Đề tài Histamin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN: PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: HISTAMIN GVD: Huỳnh Quang Phước SVTH: Phạm Thị Diệu Hà Thị Kim Ánh Nguyễn Hồng Thuý Bùi Thị Hộp Nguyễn Anh Tuấn TPHCM, ngày 6 tháng 3 năm 2009 Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 1 MỤC LỤC Trang I. Tổng quan:……………………………………………………….... 2 I.1 Công thức:………………………………………………………..2 I.2 Nguồn gốc:……………………………………………………….2 I.3 Cách đều chế:…………………………………………………….3 I.4 T ác dung đối với cơ thể………………………………………….3 I.5 Vai trò đối với cơ thể:…………………………………………… 4 I.6 Tác dụng:…………………………………………………………5 I.7 Chỉ tiêu cho phép:………………………………………………...7 II. Phân tích:………………………………………………………….7 II.1 Định tính:………………………………………………………...7 II.2 Định lượng:……………………………………………………....8 III. Đề xuất giải pháp:……………………………………………….15 IV. Kết luận:…………………………………………………………15 Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 2 HISTAMIN I. Tổng quan: I.1 Công thức: Histamine là một amin sinh học có liên quan trong hệ miễn dịch cục bộ cũng như việc duy trì chức năng sinh lý của ruột và hoạt động như một chất dẫn truyền thần kinh. Các nghiên cứu mới đây còn cho thấy histamine có vai trò như một chất của bạch cầu. Có công thức phân tử: C5H9N3 Nhiệt độ nóng chảy: 83.5 °C (182 °F) Nhiệt độ sôi: 209.5 °C (409 °F) Công thức cấu tạo cấu trúc không gian I.2 Nguồn gốc: Histamine có nguồn gốc từ quá trình decarboxy hóa của axít amin histidine, phản ứng được xúc tác bởi enzyme L-histidine decarboxylase. Nó là một amin có tính hút nước và tính gây giãn mạch. Sự chuyển hóa từ histidine thành histamine bởi histidine decarboxylase Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 3 I.3 Cách đều chế: Histamine chỉ tồn tại ở một trong hai dạng, hoặc ở dạng dự trữ, hoặc ở dạng không hoạt động. Histamine giải phóng vào synapse bị phân huỷ bởi acetaldehyde dehydrogenase. Sư thiếu hụt enzyme này sẽ gây ra phản ứng dị ứng do các bể histamine trong synapse. Histamine còn bị phân huỷ bởi histamine-N-methyltransferase Tế bào Mast và diamine oxidase. Một vài dạng bệnh do thức ăn, còn gọi là ngộ độc thức ăn, có nguyên nhân do sự chuyển hóa từ histidine thành histamine trong thức ăn chín, chẳng hạn như cá. Phần lớn histamine trong cơ thể được tìm thấy ở các hạt trong tế bào bạch cầu mast hoặc bạch cầu ái kiềm. Tế bào mast đặc biệt tập trung nhiều ở các vị trí dễ bị tổn thương như mũi, miệng, chân; bề mặt nội mô cơ thể, và thành mạch máu. Những tế bào chứa histamine không phải là tế bào mast cũng được tìm thấy ở một vài tổ chức như não, nơi mà chức năng của nó như là một chất dẫn truyền thần kinh. Một vị trí quan trọng nữa của sự tích trữ và giải phóng histamine là ở các tế bào ái chrom của niêm mạc I.4 Tác dụng đối với cơ thể Histamine biểu hiện tác dụng của mình bằng việc kết hợp với các thụ thể histamine tế bào đặc hiệu. Có 4 loại thụ thể hsstamine đã được xác định đó là thụ thể thư H1 đến H4. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 4 Loại Vị trí Chức năng Thụ thể H1 Thấy ở tổ chức cơ trơn, nội mạc, và hệ thần kinh trung ương Gây giãn mạch, co thắt khí quản, hoạt hóa cơ trơn, sự phân chia của các tế bào nội mạc; gây đau và ngứa do côn trùng cắn; các thụ thể sơ cấp liên quan đến các hội chứng viêm mũi dị ứng và bệnh tiêu chảy. Thụ thể H2 Có ở các tế bào đỉnh thành dạ dày Chủ yếu kích thích bài biết axít gastric. Thụ thể H3 - Giảm giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh như: histamine, acetylcholine, norepinephrine, serotonin Thụ thể H4 Chủ yếu thấy ở tuyến giáp, ruột non, lách, và đại tràng. Còn thấy ở bach cầu ái kiềm, và tuỷ xương. Vai trò sinh lý chưa được biết. I.5 Vai trò đối với cơ thể:  Điều khiển giấc ngủ Histamine được giải phóng như các chất dẫn truyền thần kinh. Thân các neuron giải phóng histamine được tìm thấy ở phần sau của vùng dưới đồi ở các nhân tuberomammillary khác nhau. Từ đây, các neuron tiết histamine này sẽ chiếu ra khắp não Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 5 bộ tới vỏ não thông qua bó vỏ não trước giữa. Tác dụng tiết histamine được biết đến để điều chỉnh giấc ngủ. Về mặt kinh điển, các thuốc kháng histamine ở thụ thể H1gây cảm giác buồn ngủ. Tương tự, các nguyên nhân gây phá huỷ các neuron giải phóng histamine hay sự ức chế tổng hợp histamine sẽ làm mất khả năng duy trì sự tập trung cao. Cuối cùng, các chất đối kháng H3 (kích thích giải phóng histamine) làm tăng sự tỉnh táo.  Sự đáp ứng tình dục: Nghiên cứu cho thấy sự giải phóng histamine từ các tế bào mast ở cơ quan sinh dục ngoài là một phần của sự khoái cảm tình dục ở người. Nếu sự đáp ứng này bị thiếu hụt có thể là do chứng histapenia (chứng thiếu hụt histamine). Trong các trường hợp này, bác sĩ thường kê một chế độ ăn nhiều a-xít folic cà niaxin (là những chất được sử dụng trong kết nối có thể làm tăng nồng độ histamine trong máu và tăng giải phoáng histamine), hoặc L- histidine. Ngược lại, đàn ông có mức histamine cao có thể sẽ bị chứng xuất tinh sớm.  Bệnh tâm thần phân liệt Người ta thấy rằng, khoảng phần nửa số bệnh nhân tâm thần phân liệt có nồng độ histamine trong máu thấp. Điều này có thể là do tác dụng không mong muốn trên histamine của các thuốc chống loạn thần như Quetiapine. Dù vậy, ở những trường hợp này, khi nồng độ histamine được tăng lên thì sức khỏe của họ cũng được cải thiện. I.6 Tác dụng: Histamine được xem như một loại thuốc kháng chúng có tác dụng và chức năng như:  Kháng histamine là một loại thuốc dùng để ngăn chặn tác dụng của một chất có trong máu có tên là histamin. Histamin là một chất hóa học tự nhiên được sản xuất bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể.  Khi được tiết ra, nó sẽ làm tăng lượng máu đến khu vực bị ảnh hưởng. Các dịch len lỏi ra khỏi các mạch máu làm cho những niêm mạc bao phủ mũi và họng bị sưng lên và kích Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 6 thích các tuyến gần đó tiết nhầy. Nó gây ra những triệu chứng như ngứa ngáy, sưng hoặc đỏ. Histamin cũng gây ra hắt xì, chảy nước mũi, ngứa hoặc chảy nước mắt, và ở một số người nó còn gây thở khó.  Hoạt động chính của histamin liên quan đến miễn dịch. Nó được chế tiết ra khi cơ thể tiếp xúc với các dị nguyên. Các dị nguyên là những chất mà lúc bình thường không gây hại, chẳng hạn như phấn hoa, nhưng nó có thể gây ra các phản ứng quá mẫn của hệ miễn dịch ở một số người. Histamin cũng có các tác dụng khác ở khắp cơ thể, chẳng hạn như làm co và dãn các mạch máu và co cơ ở đường thở và hệ tiêu hóa. Ngoài ra histamine được xem như là một chất gây ngộ độc tự nhiên, chúng có sắn trong các loại động vật thủy sản như: cá ngừ, cá thu, cá trích, cá heo,... nhất l à khi c á đ ã b ị ư ơn, chính là nguyên nhân gây ngộc độc.  Đặc tính của Histamine là chịu được nhiệt, thậm chí cá đã nấu chín, đóng hộp thanh trùng thì Histamine vẫn không bị tiêu hủy. Cơ thể con người chấp nhận hàm lượng Histamine nhất định không gây ra phản ứng ngộ độc nào, nhưng nếu hàm lượng Histamine quá cao sẽ gây độc.  Vì thế, khi cơ thể người bị yếu mà ăn phải cá ngừ có chứa nhiều độc tố Histamine thì sẽ bị ngộ độc ngay. Người bị ngộ độc do ăn cá ngừ có nhiều Histamine thường có các triệu chứng như: mặt đỏ bừng, đường tiêu hóa bị ảnh hưởng nên gây tiêu chảy, buồn nôn, ảnh hưởng trực tiếp đến thần kinh, đau đầu, nổi mẩn ngứa toàn thân và nóng ran trong miệng.  Độc tố Histamine có ở khắp cơ thể cá, nhưng thường tích tụ nhiều ở những nơi dễ bị nhiễm vi sinh vật như ở phần xung quanh ruột cá (khi cá đã chết) hay trên da cá vốn thường có Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 7 các tuyến dịch, môi trường rất thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Phần gần mang cá cũng là nơi tích tụ nhiều độc tố bởi khi cá chết, mang cá thường tụ máu, máu là môi trường rất tốt cho vi sinh vật phát triển... Nên chọn cá ngừ tươi Bản thân một số loại cá biển như cá ngừ, cá thu chết sau 4 -6 giờ là bị phân hủy, cộng với hàm lượng đạm có trong cá cao càng làm cho cá mau bị hư và như thế hàm lượng Histamine sẽ tăng lên rất nhiều. Chưa kể tình trạng người đánh bắt đến người buôn bán ở chợ đã dùng nhiều hóa chất như urê, hàn the tẩm ướp cho cá cứng như cá tươi nhằm qua mắt người tiêu dùng, nên chất độc trong cá đã cao lại càng cao hơn. Vì vậy, người tiêu dùng nên chọn những con cá tươi và nên chọn cá được trữ lạnh liên tục hoặc được ướp muối thật kỹ. I.7 Chỉ tiêu cho phép: Với liều lượng từ 8 mg - 40 mg, người nhạy cảm sẽ bị chảy nước mắt, nước bọt trong bữa ăn. Với liều lượng từ 1,5g - 4g, ngoài triệu chứng trên còn gây choáng váng, nhức đầu, đau bụng, tiêu chảy, nhiệt độ xuống thấp, mệt lả, mạch nhanh, thở gấp, nổi ban. Vì vậy chỉ tiêu cho phép phải nhỏ hơn 8mg. II. Phân tích: II.1 Định tính: là phương pháp dựa vào đặc tính cảm quan của người quan sát, chủ yếu là xem cá ươn hay không, nếu cá chết lâu thì hàm lượng Histamin càng nhiều, bên cạnh đó còn có một số loại vi khuẩn khác cũng có thể gây ngộ độc cho người. Vì so với các loại thịt gia súc, gia cầm, cá có nhược Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 8 điểm là phần nạc kém bền cơ học, dễ bị nhiễm vi sinh vật. Ngoài các yếu tố hư hỏng các chất đạm, béo, đường, tạo thành các axit hữu cơ như: amoniac, indol, scatol, phênol... gây ra các mùi hôi thối, tạo ra các màu xanh lục, nâu, đen, trong điều kiện yếm khí, histidin là một trong các loại axit amin được tạo ra trong quá trình thủy phân chất đạm của một số loại cá được chuyển hóa tạo thành amin độc có tên là histamin. Độc tố histamin còn được tạo ra khi cá chết là do một số loài vi sinh vật như: Enterobacteriaceae; vibrio sp; lactobacillus sp; Morganella morganii... Trong đó, Morganella morganii là loài vi khuẩn tạo ra histamin nhiều II.2 Định lương: Histamin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Histamin in fisher y products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography 1 Ðối tượng và phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng histamin trong sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5 mg/kg. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo Tiêu chuẩn NMKL số 99 - 1981(Nordic committee on food analysis No 99 - 1981). 3 Nguyên tắc Histamin có trong mẫu thủy sản được tách chiết bằng metanol. Dịch chiết được làm sạch trên cột trao đổi anion; sau đó, được tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-Phthal alđehyt (OPT). Hàm lượng dẫn xuất histamin được định lượng trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 9 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang. 4.1.2 Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột L x ID: 50 x 4,6 mm, kích thước hạt: 5 mm. 4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 6000 - 30 000 vòng/phút (HEIDOLPH DIAX 900). 4.1.4 Bể điều nhiệt hoạt động ở nhiệt độ 20 -100oC (GRANT Y14). 4.1.5 Máy lắc tốc độ 50 - 500 vòng/phút (IKA ề KS 260 basic). 4.1.6 Máy đo pH, dải pH từ 2 đến 12 (Knick 766). 4.1.7 Cân phân tích, độ chính xác 0,0001 g. 4.1.8 Cột thủy tinh (khóa teflon, kích thước: 300 x 10,5 mm ID x 13 mm OD). 4.1.9 Bình tam giác, bình định mức và pipet thủy tinh các loại. 4.1.10 Giấy lọc 0.45 mm (Whatman No.1). 4.2 Hoá chất Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm: 4.2.1 Nước cất dùng cho HPLC. 4.2.2 Metanol dùng cho HPLC. 4.2.3 Axetonitril dùng cho HPLC. 4.2.4 Axit clohyđric (HCl) đậm đặc 37 %. 4.2.5 Natri hyđroxit (NaOH) rắn. 4.2.6 Kali đihyđro phosphat (KH2PO4) rắn. 4.2.7 o-Phthal alđehyt (OPT) 99%, được bảo quản lạnh. 4.2.8 Trietylamin (TEA). 4.2.9 Histamin đihyđroclorua (C5H11Cl2N3), M = 184,07 g/mol. 4.2.10 Axit phosphoric (H3PO4) đậm đặc 85 %. 4.2.11 Nhựa trao đổi anion, Dowex loại 1 x 8, kích thước hạt 50 -100 mesh. 4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.3.1 Các dung dịch chuẩn histamin 4.3.1.1 Dung dịch chuẩn histamin gốc 1000 mg/l: hoà tan 0,1656 g histamin đihyđroclorua (4.2.9) trong axit HCl 0,1 M rồi định mức đến 100 ml. Dung dịch này bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 10 4.3.1.2 Dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l: pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn gốc histamin 1000 mg/ l (4.3.1.1) với dung dịch axít HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi định mức đến 100 ml. Dung dịch này bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh. 4.3.1.3 Các dung dịch chuẩn histamin làm việc: pha loãng lần lượt 1; 2 và 3 ml dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l (4.3.1.2) trong dung dịch axit HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi định mức đến 100 ml để được các dung dịch chuẩn 0,1; 0,2 và 0,3 mg/l. Chuẩn bị mới các dung dịch chuẩn mỗi khi phân tích. 4.3.2 Các dung dịch thử 4.3.2.1 Dung dịch axit HCl 2,5 M: pha loãng 125 ml axit HCl (4.2.4) trong nước cất (4.2.1) để có 500 ml. 4.3.2.2 Dung dịch axit HCl 1 M: pha loãng 40 ml dung dịch axit HCl 2,5 M (4.3.2.1) trong nước cất để có 100 ml. 4.3.2.3 Dung dịch axit HCl 0,1 M: pha loãng 10 ml dung dịch axit HCl 1 M (4.3.2.2) trong nước cất để có 100 ml 4.3.2.4 Dung dịch NaOH 1 M: hòa tan 40 g NaOH (4.2.5) trong 1000 ml nước cất. 4.3.2.5 Dung dịch OPT: hòa tan 0,100 mg OPT (4.2.7) trong 100 ml metanol (4.2.2). Dung dịch bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh trong chai sẫm màu. 4.3.2.6 Dung dịch H3PO4 1,19 M: pha loãng 121,8 ml H3PO4 đậm đặc 85% (4.2.10) với nước cất (4.2.1) để có 1000 ml. 4.3.3 Chuẩn bị nhựa trao đổi anion: nhựa trao đổi anion được đổ vào trong dung dịch NaOH 1 M (4.3.2.4) với tỉ lệ tương ứng 15 ml NaOH/1 g nhựa. Tiến hành khuấy đều dung dịch, để yên ít nhất trong 30 phút rồi gạn bỏ phần dung dịch. Lặp lại thao tác trên. Cuối cùng rửa nhựa với nước cất. Sau đó, đổ nhựa lên giấy lọc rồi rửa nhiều lần với nước cất (4.2.1) cho đến khi hết NaOH. Nhựa bảo quản được 1 tuần trong nước cất. 4.3.4 Chuẩn bị pha động: hòa tan 1.089 g KH2PO4 (4.2.6) trong gần 600 ml nước ((4.2.1). Thêm 100 ml axetonitril (4.2.3) và 0,10 ml TEA (4.2.8), chỉnh pH đến 7,30 + 0,05 trên máy đo pH (4.1.6). Sau đó, chuyển Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 11 dung dịch vào bình định mức 1000 ml (4.1.9) rồi định mức tới vạch bằng nước cất (4.2.1). Chú thích: trong quá trình chuẩn bị pha động, dung dịch phải được lọc qua giấy lọc 0,45mm (4.1.10) và đuổi khí bằng bể siêu âm trước khi sử dụng. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Cân chính xác 10 g mẫu đã được nghiền đồng thể (kí hiệu W) cho vào bình tam giác 150 ml (4.1.9). 5.1.2 Thêm 50 ml metanol (4.2.2), lắc đều trong 2 phút. Ðặt bình chứa dung dịch mẫu trên bể điều nhiệt (4.1.4) ở nhiệt độ 60oC trong 15 phút . Sau đó, chuyển toàn bộ sang bình định mức 100 ml; tráng bình tam giác bằng metanol (4.2.2). 5.1.3 Ðể nguội dung dịch tới nhiệt độ trong phòng rồi định mức đến vạch bằng metanol (4.2.2) để có 100 ml (kí hiệu V1). Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc (4.1.10). Dịch chiết này bền được vài tuần lễ nếu được bảo quản lạnh. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng là mẫu thuỷ sản đã được xác định không chứa histamin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định taị Ðiều 5.1. 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ppm Thêm chính xác 1 ml dung dịch chuẩn histamin 1000 mg/l (4.3.1.1) vào 10 g mẫu trắng đã được nghiền đồng thể. Tiến hành chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định t aị Ðiều 5.1. 5.4 Làm sạch mẫu 5.4.1 Chuẩn bị cột làm sạch Nhồi nhựa trao đổi anion đã được chuẩn bị (4.3.3) vào cột thủy tinh (4.1.8) đến chiều cao khoảng 8 cm và giữ không để khô cột. Trước khi sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml nước cất (4.2.1). Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 12 5.4.2 Làm sạch mẫu Lần lượt cho 1 ml dịch chiết thu được tại các Ðiều 5.1, 5.2 và 5.3 (kí hiệu V2) qua cột, rồi rửa cột bằng 4 - 5 ml nước cất (4.2.1). Thu dịch chảy ra vào bình 50 ml đã chứa 5 ml dung dịch axit HCl 1 M (4.3.2.2). Khi lớp dung dịch cách mặt trên lớp nhựa khoảng 2 mm phải cho tiếp nước cất (4.2.1) vào cột cho đến khi thu được khoảng 35 ml dịch giải hấp. Khóa cột rồi định mức phần dịch giải hấp thu được bằng nước cất (4.2.1) để có 50 ml (kí hiệu V3). 5.5 Tạo dẫn xuất huỳnh quang 5.5.1 Dung dịch xác định đường chuẩn Hút chính xác 5 ml các dung dịch chuẩn histamin làm việc (4.3.1.3) vào các bình định mức 50 ml, thêm 3 ml dung dịch NaOH 1 M (4.3.2.4) vào mỗi bình rồi lắc đều. Sau khoảng 5 phút, thêm 1 ml dung dịch OPT (4.3.2.5) vào mỗi bình. Sau đúng 4 phút, tiếp tục thêm 3 ml dung dịch H3PO4 1,19 M (4.3.2.6) vào mỗi bình, định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi lắc đều các bình. Chú thích: phải lắc đều dung dịch sau mỗi lần thêm hóa chất ít nhất 1 lần trong quá trình tạo phản ứng với dung dịch OPT (4.3.2.5). 5.5.2 Mẫu trắng Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu trắng đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1. 5.5.3 Mẫu xác định độ thu hồi Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1. 5.5.4 Mẫu thử Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 13 Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu thử đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1. 5.6 Tiến hành phân tích trên HPLC 5.6.1 Ðiều kiện phân tích: a. Cột sắc ký : cột Licrocart C18, kích thước 50 x 4,6 mm, 5 mm (4.1.2). b. Nhiệt độ cột : 40oC. c. Pha động : hỗn hợp gồm: KH2PO4 , axetonitril và TEA (4.3.4). d. Tốc độ dòng : 1 ml/phút. đ. Bước sóng kích thích : l = 350 nm. e. Bước sóng phát xạ : l = 444 nm. g. Thể tích tiêm : 20 ml. 5.6.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút tại chế độ làm việc. 5.6.3 Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5.1). Dựng mối quan hệ tuyến tính của diện tích píc sắc ký theo nồng độ. 5.6.4 Tiêm dịch chiết mẫu trắng (5.5.2); dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi (5.5.3) và dịch chiết mẫu thử (5.5.4) đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC. Mỗi dịch thực hiện 2 lần. Tính diện tích trung bình và xác định nồng độ histamin trong dịch chiết từ đường chuẩn. Tính hàm lượng histamin trong mẫu theo Ðiều 6. 5.7 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.7.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 14 5.7.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi của mẫu được xác định theo mỗi lần phân tích mẫu. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 90 đến 110%. 5.7.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. 6 Tính kết quả Hàm lượng histamin có trong mẫu thử được tính theo công thức sau: C x V1 x V3 M (mg/kg) = ----------------- W x V2 Trong đó: - M là hàm lượng histamin có trong mẫu, tính theo mg/kg. - C là nồng độ histamin có trong dịch chiết mẫu (5.6.4), tính theo mg/ml. - V1 là thể tích dịch mẫu thử (100 ml) đã được định mức (5.1). - V2 là thể tích dịch chiết (1 ml) chuẩn bị được làm sạch (5.4.2). - V3 là thể tích dịch đã được làm sạch (5.4.2) chứa trong bình định mức (50 ml). - W là khối lượng (10 g) của mẫu thử đã được nghiền đồng thể (5.1). Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn 15