Đề tài Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lên men lactic để chọn chủng tiềm năng probiotic

Chương 1: Mở Đầu Đặt vấn đề Hiện nay công nghệ sinh học là một lĩnh vực đang phát triển và có nhiều tiềm năng lớn. Việt Nam cũng đã từng bước tạo điều kiện để phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt là những ứng dụng trong nông nghiệp và cả trong công nghiệp. Probiotic một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học. Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và hiệu quả mà nó thể hiện. Hiệu quả tác dụng của probiotic không chỉ đơn thuần là làm thức ăn ngon hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làm bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose; cải thiện chức năng miễn dịch; ngăn chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn chăn chứng viêm; giảm cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại; tăng trọng nhanh… Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotic đang chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác. Vì tính hiệu quả của probiotic (tính trị bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh, tồn dư tác hại trong sinh vật chủ. Mà với sự khắt khe của con người thì điều này là số một. Như đã biết trước đây và cả hiện nay nhiều nông dân sử dụng chất kháng sinh trong chăn nuôi như là biện pháp tối ưu nhất bởi những lợi ích mà nó mang lại như: Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng với sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh). Phòng các bệnh mãn tính và ngăn chặn xẩy ra những dịch bệnh do vi trùng. Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. Tuy nhiên, thế giới đã nhanh chóng nhận ra những tác động xấu do việc làm này mang lại. Sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi (sử dụng không đúng cách trong điều trị, phòng bệnh và dùng trong thức ăn chăn nuôi như chất kích thích sinh trưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng là làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Có ý kiến cho rằng, việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi đã biến vật nuôi thành nơi để một số loài vi khuẩn “ học” cách vô hiệu hoá tác dụng của các loại  kháng sinh. Hậu quả của sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn về kinh tế rất lớn. Tuy nhiên, những thiệt hại về kinh tế không phải là chính yếu mà vấn đề đáng lo ngại là không chỉ vật nuôi mà ngay cả loài người đang đứng trước hiểm hoạ xẩy ra các thảm dịch do những loài vi khuẩn kháng thuốc gây ra mà không thể kiểm soát được. Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotic vào cuộc sống là một công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Có như vậy mới tiếp tục hoàn thiện probiotic đem lại hiệu quả cao hơn, chất luợng cuộc sống ngày được cao hơn, an toàn hơn đáp ứng nhu cầøu ngày càng cao và khắt khe của chúng ta. Có thể nói đây là sự tác động thân hữu của con người vào tự nhiên nên đã mở ra một chiến lược phát triển bền vững và an toàn. Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày càng cao của con người. Trên phương trình tăng tiến này, con người đòi hỏi khắt khe hơn về chất lượng của mọi loại sản phẩm đặc biệt là sự an toàn về sức khoẻ của chính bản thân họ. Mà chính những nhu cầu này là kích thích tố trực tiếp thúc đẩy khoa học phát triển. “ Probiotic” là một phần của sự phát triển ấy. Để có thể có một chế phẩm probiotic có đầy đủ những hoạt tính cần thiết, khâu chọn lọc chủng vi khuẩn để làm probiotic là cực kì quan trọng. Bởi vì ngay tại khâu này sẽ quyết định vai trò và tác dụng của chế phẩm lên đối tượng cần quan tâm. Tuy nhiên, trong phạm vi nhỏ hẹp của nghiên cứu này, tôi chỉ thực hiện đề tài ở bước kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật vì thời gian thực hiện đề tài chỉ trong 12 tuần không cho phép tôi thực hiệân hoàn chỉnh tất cả các tiêu chí tuyển chọn Probiotic. Chính vì thếø tôi đã chọn đề tài “THỬ NGHIỆM VÀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN CHỦNG TIỀM NĂNG PROBIOTIC”. Mục tiêu nghiên cứu Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lên men lactic. Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic. Đối tượng nghiên cứu Vì thời gian hạn hẹp, đề tài chỉ tập trung ở những đối tượng sau : Vi khuẩn lên men lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men ( cà muối, dưa muối, nem, sữa lên men) và có nguồn gốc từ các chế phẩm dược. Vi sinh vật chỉ thị Escherichia coli. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp luận Trước khi bắt tay vào thực hiện đề tài này, tôi đã tham khảo khá nhiều các nghiên cứu từ trước tới nay về probiotic cũng như các phương pháp tuyển chọn nó. Nhận thấy có khá nhiều phương pháp được sử dụng để thực hiện việc chọn lọc này, tôi đã xem xét và chọn ra những phương pháp điển hình nhất cho đề tài của mình. Tôi xin đề xuất sơ đồ tiến hành nghiên cứu như sau: Tổng hợp biên tập tài liệu Phân tích các nghiên cứu liên quan Tiến hành thử nghiệm các phương pháp Trao đổi ý kiến với giáo viên hướng dẫn Phân tích ưu điểm – khuyết điểm của các phương pháp Chọn phương pháp tối ưu, tiến hành chọn lọc probiotic Đưa ra kết quả nghiên cứu Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị biểu diễn. Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, vè đồ thị tương quan. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Tìm hiểu về các phương pháp đánh giá khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị của các vi khuẩn lên men lactic. Tạo tiền đề cho các nghiên cứu liên quan sau này tại phòng thí nghiệm. Góp phần chọn lọc được chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic. Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu Tổng quan về Probiotics Giới thiệu sơ lược về probiotic Giới thiệu chung Việc sử dụng các vi khuẩn lactic như thức ăn bổ sung đã xuất hiện từ lâu khi con người biết đến sữa lên men. Việt nghiên cứu được bắt đầu từ Metchnikoff làm việc ở viện Pasteur Paris. Ông ta cho rằng vi sinh vật trong ruột có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe vật nuôi và những ảnh hưởng xấu này có thể được cải thiện bởi việc sử dụn sữa chua. Ông đã trích dẫn các quan sát về nông dân Bungari sử dụng số lượng lớn sữa chua và có tuổi thọ rất cao. Ông phân lập được hệ sinh vật từ sữa chua ông gọi là “Bulgarian bacillus” và sử dụng chúng trong các thử nghiệm. Những sinh vật này được xác định và được biết đến là Lactobacillus bulgaricus và ngày này được gọi là L. delbrueckii subsp bulgaricus là một trong số sinh vật được sửdụng để lên men sữa và sản xuất yoghurt. Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt động nghiên cứu này chuyển về USA. Được biết ở thời điểm đó người ta đã đề xuất việc sử dụng các L. acidophilus và nhiều thử nghiệm đã được thực hiện với sinh vật này. [34] Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩa khác nhau, nó được sử dụng lần đầu tiên năm 1965 (Lilly & Stillwell ) để mô tả một chất được tạo bởi một protozoan để kích thích sự tăng trưởng của một sinh vật khác. Đến năm 1974, Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các sinh vật và chất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng vi sinh vật ruột. Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gần với hiện nay là “ một bổ sung vi sinh vật sống qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện cân bằng vi sinh vật đường ruột”. [33] Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩn probiotic (T. Mattila-Sandholm, M. Saarela, Probiotic functional foods) Dạng sản phẩm Tên sản phẩm Công ty Vi Khuẩn probiotic bổ sung (107-108 LAB/ml) Nơi sản xuất Yoghurt LC1 Nestle L. johnsonii LC-1 France, Belgium, Spain, Switzerland, Portugal, Italy, Germany, UK Yoghurt Gefilus Valio L. rhamnosus GG Finland Yoghurt Vifit Mona L. rhamnosus GG Netherlands, Ireland Yoghurt Vifit Sudmilch L. rhamnosus GG Germany Yoghurt drink Yo-Plus Waterford Foods L. acidophilus Ireland Yoghurt Bio-Pot Onken Biogarde cultures Europe Yoghurt LA7 Bauer L. acidophilus Germany Fermented milk drink Yakult Yakult L. casei Shirota strain Nertherlands, UK, Germany Cultures yoghurt-style product Gaio MD-Foods E. faecium Denmark Yoghurt SNO Dairygold L. acidophilus Ireland Yoghurt Actimel Cholesterol Control Danone L. acidophilus Belgium Fermented milk drink Actimel Danone L. casei Europe Yoghurt Yoplait Waterford-Foods L. acidophilus Ireland Fermented milk drink Bra-Mjolk Arla Bifidus, L. reuterii, L. acidophilus Sweden Fermented milk drink Fyos Nutricia L. casei Netherlands Yoghurt Symbalance Tonilait L. reuterii, L. casei, L. acidophilus Switzerland Yoghurt Shape St Ivel L. acidophilus Ireland, UK Hiệu quả sử dụng probiotic Đã có rất nhiều chế phẩm probiotic dành cho người hay cho vật nuôi được đăng kí bảo hộ sáng chế. Hầu hết các sản phẩm này chứa Lactobacillus spp. hoặc Streptococcus spp., một số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces boulardii, hay Bacillus subtilis. Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột. Những chế phẩm này có những hiệu quả sử dụng được biết tới như sau: [2], [3], [5], [25], [32], [33] Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp lactose Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh Kích thích hệ thống miễn dịch Giảm nhiễm trùng đường niệu Tăng trọng (5%) ở gia cầm Giảm bệnh nhiễm trùng ở gia cầm Giảm tiêu chảy ở dộng vật non Giảm tác dụng phụ của chất kháng sinh Hiệu quả lâm sàng của một vài chủng probiotic được trình bày trong Bảng dưới đây: Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic [8], [15] Chủng Tác dụng lâm sàng trên người Lactibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy do kháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòng rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile, kích thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em Lactobacillus johnsonii (acidophilus) LJ-1 (La1) Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter pylori Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lịch, điều trị tiêu chảy do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em Lactobacillus reuteri (BioGaia Biologics) Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở trẻ em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành HIV dương tính Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cực đối với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của người khỏe mạnh Lactobacillus plantarum DSM9843 (299v) Cân bằng hệ bi sinh vật đường ruột, tăng hàm lượng acid béo mạch ngắn trong phân Saccharomyces boulardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị viêm ruột kết do Clostridium difficile, dự phòng tiêu chảy ở bệnh nhân sử dụng dinh dưỡng qua ống Chủng trong sữa chua (Streptococcus thermophilus hay L. delbrueckii subsp bulgaricus Không có tác dụng trên tiêu chảy do rotavirus, không có hiệu ứng tăng cường miễn dịch khi bị tiêu chảy do rotavirus, không có tác dụng lên hoạt tính enzyme phân Vào cuối năm những năm 1940 có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh vật đường ruột này. Đầu tiên, thấy rằng thuốc kháng sinh bổ sung trong thức ăn đã thúc đẩy tăng trưởng của vật nuôi. Mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnh hưởng tới việc tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột này và cách thức mà nó tác động lên vật chủ. Thứ hai, càng ngày càng có nhiều vật nuôi bị bệnh, cung cấp cho những thí nghiệm để khám phá hệ sv trong đường ruột bởi những vật chủ có sẵn. Và cuối cùng cho thấy rằng L. acidophilus không là vi khuẩn lactobacillus duy nhất có trong ruột non mà có nhiều sinh vật khác cần được nghiên cứu để sử dụng làm probiotics. Những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy có khoảng 1014 vi sinh vật thuộc khoảng 400 loài khác nhau tồn tại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vì vậy việc nghiên cứu về những sinh vật có thể sử dụng làm probiotic ngày càng được mở rộng. [30] Sau nhiều nghiên cứu, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều sinh vật có thể sử dụng làm probiotic. Điều này sẽ được trình bày ở mục tiếp theo. Các thành phần của Probiotics Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al. 2001) [5] Lactobacillus Bifidobacterium Other lactic acid Bacteria Non-lactic acid bacteria L. acidophilus L. amylovorus L. casei L. cripatus L. delbrueckii subsp.Bulgaricus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. Longum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteroides Pediococcus acidolactici Streptococcus thermophilus Sporolactobacillus inulinus Bacillus cereus var. Toyoi Escherichia coli Nissle 1917 Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccheromyces boulardii Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic [2], [3], [33], [34] Các sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được các tiêu chuẩn như: Tiêu chuẩn về an toàn Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng Đã có nhiều nghiên cứu, nhiều thông tin về những tiêu chuẩn dành cho probiotic, ta có thể tổng kết lại như sau: Khía cạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể sau: Có định danh chính xác Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh Không liên quan tới bệnh tật Không gây khử liên hợp muối mật Đặc điểm di truyền ổn định Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được Tính an toàn của các chủng probiotic là điều được quan tâm hàng đầu. Có một số phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic như: nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotic, nghiên cứu về dược động học của chủng probiotic, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ. Các probiotic thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As Safe) Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng [2], [15] Vi sinh vật Khả năng lây nhiễm Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các bệnh nhân suy giảm miễn dịch (AIDS) Lactococcus Không gây bệnh Streptococcus Gây bệnh cơ hội, có S. thermophilus được sử dụng trong các sản phẩm sữa Enterococcus Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng kháng sinh Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người Propionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotic Saccheromyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người Phần lớn những vi sinh vật sử dụng làm probiotic cho người đều phải đạt những yêu cầu khắc khe như đã nêu trên. Còn đối với vật nuôi ta có thể nới lỏng những yêu cầu này, tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng của nó. Trước khi một probiotic có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe con người chúng thường phải có những đặc điểm sau: [2], [4], [23] Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có thể đưa vào sản xuất. dễ nuôi cấy. Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm. Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm. Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng. Để tồn tại được nó phải có đặc tính sau: Có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp ở dạ dày) và dịch vị của người. Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non). Có khả năng bám dính và niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ. Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng. Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm. Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là sinh vật gây bệnh đường ruột. Sản xuất các chất kháng vi sinh vật ( ví dụ như bacteriocin, hydrogen peroxide, acid hữu cơ). Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư. Sau đây là một số chức năng quan trọng của những chủng được sử dụng làm probiotic Khả năng bám dính [1], [2], [10] Khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa người được xem là điều kiện tiên quyết quyết định chức năng của probiotic. Những vi khuẩn có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do đó có điều kiện để biểu hiện những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả năng nám dính Khả năng bám dính sẽ tạo nên một mối tương tác giữa probiotic và bề mặt niêm mạc ruột là nơi chứa các tế bào lympho, điều này sẽ kích thích tính miễn dịch tại chỗ và toàn bộ cơ thể. Do đó người ta cho rằng chỉ có những chủng probiotic có khả năng bám dính mới tạo được hiệu quả cảm ứng miễn dịch và làm ổn định hàng rào bảo vệ niêm mạc ruột. Sự bám dính của probiotic cũng tạo nên khả năng cạnh tranh gắn kết vào biểu mô ruột, giữa những vi khuẩn gây bệnh và probiotic. Qua một số thử nghiệm, đều cho thấy Lactobacillus acidophilus còn sống hay đã chết do nhiệt đều có