Đề tài Thu nhận inulinase

Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 2 Mục lục Trang I. Giới thiệu 5 1.1. Inulin 5 1.2. Định nghĩa 5 1.3. Công thức cấu tạo 5 1.4. Nguồn thu nhận 5 1.5. Ứng dụng 6 2. Enzyme inulinase 7 2.1. Định nghĩa 7 2.2. Phân loại 7 2.3. Các bậc cấc trúc và cơ chế xúc tác 7 2.4. Ứng dụng 9 3. Vi sinh vật 11 3.1. Nhóm vi sinh vật sử dụng sinh tổng hợp inulinase 11 3.2. Đặc điểm sinh lý 12 II. Quy trình công nghệ 14 III. Giải thích quy trình công nghệ 16 1. Chuẩn bị môi trường 16 2. Tiệt trùng môi trường 16 3. Chuẩn bị giống 18 4. Nhân giống 18 5. Cấy giống 20 6. Lên men 20 7. Tinh sạch 28 7.1. Ly tâm lần 1 28 7.2. Kết tủa 29 7.3. Ly tâm lần 2 30 7.4. Hòa tan kết tủa 31 7.5. Thẩm tách 31 7.6. Trao đổi sắc ký ion 32 7.7. Trao đổi sắc ký ái lực 35 7.8. Sấy 36 IV. Sản phẩm 38 V. Thành tựu công nghệ 38 VI. Tài liệu tham khảo 56 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 3 MỤC LỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 1: Một số vi sinh vật được sử dụng để sinh tổng hợp inulinase 10 Bảng 2: Một vài tính chất của inulinase từ các loài vi sinh vật… 11 Bảng 3: Sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme 25 Bảng 4: Sự kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường 27 Bảng 5: Các thành phần của môi trường dựa trên mô hình… 40 Bảng 6: Mô hình thực nghiệm sử dụng phương pháp Plackett – burman 41 Bảng 7: 41 Bảng 8: Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường cơ chất rắn 43 Bảng 9: Mô hình thực nghiệm cho tối ưu hóa các nồng độ thành phần… 43 Bảng 10: Phân tích kết quả các biến số thực nghiệm của mô hình … 44 Bảng 11: Phương pháp cố định và không cố định tế bào trong sản xuất… 53 Bảng 12: So sánh hoạt tính inulinase đạt được bởi các điều kiện khác nhau 55 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 4 MỤC LỤC HÌNH Hình Trang Hình 1: Công thức cấu tạo inulin 5 Hình 2: Quy trình sản xuất inulin 6 Hình 3 : Cấu trúc của enzyme inulinase 7 Hình 4: Cơ chế thủy phân inulin của inulinase 8 Hình 5: Vi sinh vật Kluyvermyces marxianus 12 Hình 6: Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất inulinase 15 Hình 7: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 17 Hình 8: Thiết bị nhân giống 19 Hình 9: Thiết bị lên men 21 Hình 10: Ảnh hưởng của nguồn carbon inulin(a), Ảnh hưởng của nguồn carbon 22 khác(b) với inulin là chất cảm ướng cho sản xuất inulinase Hình 11: Ảnh hưởng của nguồn nitơ 24 Hình 12: Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính bề mặt tới hoạt 26 tính của inulinase Hình 13: Thiết bị li tâm lắng 28 Hình 14: Thiết bị kết tủa 30 Hình 15: Cơ chế thẩm tách 32 Hình 16: Cơ chế sắc ký trao đổi ion 34 Hình 17: Thiết bị trao đổi ion 34 Hình 18: Sắc ký ái lực 36 Hình 19: May sấy phun chân không 2 giai đoạn 37 Hình 20: Ảnh hưởng của inulin….. 45 Hình 21: Ảnh hưởng của dịch bắp… 45 Hình 22: Ảnh hưởng của inulin … 46 Hình 23: Hoạt tính của inulinase và số tế bào sống theo thời gian 47 Hình 24: Ảnh hưởng của pH… 51 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 5 I. GIỚI THIỆU 1. Inulin 1.1. Định nghĩa Inulin là một polysaccharide có nguồn gốc từ thực vật,là nguồn cơ chất phong phú cho quá trình sản xuất HFS từ vi sinh vật, tan trong nước.đây là thành tựu quan trọng trong thực phẩm, đồ uống và y dược. 1.2. Công thức cấu tạo - Về mặt hóa học, Inulin – thuộc loại fructan là một polymer mạch thẳng với monomer chủ yếu là carbohydrate, liên kết b - (2,1) fructosyl - fructose. Fructose là một loại monomer cơ bản trong cấu trúc của Inulin . Bắt đầu là một nửa phân tử a-D-glucose có thể tồn tại nhưng không cần thiết. Gpy Fn [glucopyranosyl-(fructofuransoyl)n -fructose] và Fpy Fn [fructopyranosyl-(fructofuranosyl)n -fructose] là các hợp chất được kể đến trong cùng một danh pháp; chúng là cả một hỗn hợp của oligomer và polymer tốt nhất đặc trưng bởi mức độ polymer hóa ( DP), hoặc là giá trị trung bình (DPav ) hoặc tối đa (DPmax). - Công thức phân tử C6nH10n+2O5n+1 - Các đơn vị fructosyl của inulin được liên kết với chuỗi polymer kết thúc bởi 1 gốc glucose ở cuối mạch. Inulin Hình 1 Công thức cấu tạo của inulin 1.3. Nguồn thu nhận - Inulin được thu nhận từ Jerusalem artichoke, rau diếp xoăn, thược dược… - Inulin được thủy phân bởi enzyme inulinase. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 6 Hình 2 Quy trình sản xuất inulin 1.4. Ứng dụng - Inulin được coi là nguồn carbohydrate tốt nhất. Tại Hoa Kỳ, nó được gọi GRAS, an toàn cho con người và mức tiêu thụ trung bình hàng ngày đã được ước tính là từ 3 đến 11 g tại Châu Âu và từ 1 đến 4 g tại Hoa Kỳ. Trong y học, Inulin chống lại cả sự thủy phân acid và tương tác của các enzym tuyến tụy, nhưng không thay đổi gì ở đường ruột, nơi nó được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn probiotic. Điều này lý giải tại sao Inulin không làm tăng glycaemia, cũng không có ảnh hưởng đến hàm lượng insulin trong máu, do đó sự có mặt của nó trong cơ thể các bệnh nhân tiểu đường là tốt. - Vì lợi ích sức khỏe của nó, nó được sử dụng như là một thành phần thực phẩm trong nhiều loại thực phẩm chế biến. Nó có nhiều chức năng như: giúp cải thiện sự hấp thu và cân bằng chất khoáng, làm giảm sự tăng lượng đường trong máu. Lý do chính để inulin được sử dụng trong thực phẩm chế biến chính vì nó có thể thay thế chất béo và làm giàu chất xơ. Như một sự thay thế chất béo, nó cải thiện mùi vị, kết cấu, và khẩu vị của việc giảm bớt chất béo và các sản phẩm sữa nghèo chất béo. Các sản phẩm ngũ cốc như bánh ngọt, bánh mì, ngũ cốc dùng ăn sáng được cải tiến cấu trúc và độ giòn. Sản phẩm thủy phân của Inulin, oligofructose, không chỉ cải thiện kết cấu và khẩu vị mà còn giúp tăng cường hương vị và mùi vị trái cây khi được sử dụng trong sữa chua nghèo chất béo kết hợp với độ ngọt cao. Nó cũng được dùng trong đồ uống sữa giàu dinh dưỡng để nâng cao lượng chất xơ. - Inulin ngày càng được sử dụng phổ biến trong thực phẩm bởi vì nó có tính năng dinh dưỡng thay đổi bất kỳ. Mùi vị của nó trong khoảng từ không vị đến rất ngọt (khoảng 10% vị ngọt của đường / sucrose). Nó có thể được dùng để thay thế đường, chất béo, và bột. Điều này đặc biệt thuận lợi vì inulin chiếm 1/3 tới 1/4 năng lượng của đường hoặc Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 7 carbohydrate khác và 1/6 đến 1 / 9 của năng lượng của chất béo. Nó cũng làm tăng sự hấp thu Ca và có thể tăng sự hấp thu Mg đồng thời thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn đường ruột. Về mặt dinh dưỡng, nó được coi là một dạng chất xơ hòa tan và đôi khi được xem như một probiotic, có khả năng ngăn ngừa ung thư ruột kết.. - Ngày nay trong công nghiệp, người ta sản xuất High fructose syrup từ inulin với hiệu suất thủy phân cao, là một sản phẩm quan trọng trong ngành thức uống nói riêng và thực phẩm nói chung. 2. Enzyme inulinase 2.1. Định nghĩa - Enzyme inulinase (β-D-fructan fructanohydrolases) là enzyme thủy phân liên kết β-2,1 và liên kết β–2,6 của inulin. 2.2. Phân loại - Có 2 loại enzyme inulinase: Exoinulinase (β-D-fructan fructohydrolase, EC 3.2.1.80) Endoinulinase (β -2,1-D-fructan fructanohydrolase, EC 3.2.1.7) Bảng 1 Một vài tính chất của inulinase từ các loài vi sinh vật khác nhau 2.3. Các bậc cấu trúc và cơ chế xúc tác Hình 3 Cấu trúc của enzyme inulinase - Quá trình thủy phân inulin thành fructose: inulin là hỗn hợp của nhiều polyme với các giá trị DP khác nhau và nồng độ của nó thì khó xác định. Cho nên để đánh giá quá trình thủy phân, người ta sẽ dựa vào hàm lượng đường fructose và glucose được tạo ra. Trong quá trình thủy phân inulin xảy ra đồng thời 3 cơ chế của một hệ 3 enzyme: exoinulinase, endoinulinase, invertase. - Trong đó exoinulinase sẽ tấn công vào liên kết β-2,1-fruto cắt fructose tận cùng của inulin cho ra fructosevà endoinulinase tấn công vào liên kết β-2,6- inulooligosaccharides (IOSs) (hình ) Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 8 Hình 4 Cơ chế thủy phân inulin của inulinase 2.4. Ứng dụng a. Sản xuất Ultra-high-fructose syrup (UHFS) từ inulin - Fructose syrup có lợi ở bệnh nhân tiểu đường, làm tăng hấp thu sắt ở trẻ em, có độ ngọt cao, vì vậy nó có thể được sử dụng để bổ sung vào khẩu phần ăn của người béo Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 9 phì, kích thích sự hấp thụ canxi của phụ nữ mãn kinh, kích thích sự tăng trưởng của hệ vi khuẩn Bifidobacteria trong ruột già và ruột non, ngăn ngừa bệnh ung thư ruột kết, và nó được sử dụng thay cho chất béo đối với những người ăn kiêng. Fructose cũng được sử dụng rộng rãi trong nhiều loại thực phẩm, dược phẩm, và đồ uống nhẹ thay cho sucrose. Tuy nhiên, hiện nay các phương pháp hóa học để sản xuất fructose bị hạn chế. Fructose cũng có thể được sản xuất từ tinh bột bằng phương pháp enzym bao gồm: α-amylase, amyloglucosidase, và glucose isomerase .Và người ta thấy rằng cách tốt nhất là sử dụng vi sinh vật inulinase, bằng phương pháp thủy phân từng bậc inulin, hiệu suất thu được sau quá trình thủy phân là 95% fructose. Vì vậy, exoinulinase từ nhiều loài vi sinh vật khác nhau được sử dụng để sản xuất Ultra high - fructose syrup (UHFS) từ inulin và từ nguyên liệu có chứa inulin. - Có một điều thú vị đáng chú ý chỉ có monosaccharide (glucose và fructose) đã được thu nhận từ inulin do hoạt tính của inulinases từ hai chủng nấm men C. aureus G7a and P. guilliermondii. Vì vậy, inulinases từ hai chủng nấm men này có tiềm năng rất lớn trong việc thủy phân trực tiếp inulin trong thực phẩm và ngành công nghiệp lên men. Các monosaccharide và oligosaccharide cũng được phát hiện sau khi thủy phân inulin trong hơn 2 giờ do các exoinulinase sản xuất bởi K . marxianus var. bulgaricus. b. Sản xuất ethanol từ inulin - Ethanol được ứng dụng làm nhiên liệu sinh học hoặc là khí đốt. Nó cũng là một nguyên liệu lý tưởng cho hóa tổng hợp. - Jerusalem artichoke là một trong những nguyên vật liệu tốt nhất để sản xuất nhiên liệu ethanol. Chủng Saccharomyces cerevisiae được sử dụng cho việc sản xuất đồng thời ethanol và fructose từ hỗn hợp glucose/fructose hoặc từ dịch thủy phân Jerusalem artichoke. Điều này cho phép sản xuất 5g ethanol/lít và 48g đường/lít chứa đến 99% fructose từ sự pha loãng dịch thủy phân Jerusalem artichoke có chứa 60g đường/lít. - Ethanol cũng được sản xuất từ Jerusalem artichoke bằng cách sử dụng K. fragilis với hoạt tính của inulinase, từ nấm men thương mại S. cerevisiae, hoặc từ các vi khuẩn Zymomonas mobilis. Công nghiệp sản xuất ethanol của S. cerevisiae cũng như vi khuẩn, Z. mobilis trong quá trình lên men nếu trộn với nấm men có hoạt tính inulinase, cụ thể là K. fragilis, thì hàm lượng sản phẩm thu nhận được tăng lên 12% so với phương pháp sử dụng một loại vi sinh vật. c. Sản xuất Oligofructan từ inulin - Fructooligosaccharide là một trong những thành phần phổ biến cấu thành nên thực phẩm chức năng vì có tính chất tăng cường hệ vi sinh vật bifidogenic trong đường ruột. Inulin có thể được thủy phân một cách chọn lọc bởi inulinase tạo ra IOSs như inulotriose and inulotetraose. Các Inulooligosaccharide có cấu trúc và chức năng tương tự các fructooligosaccharide, tác động có lợi trên người và động vật. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 10 - Khi endoinulinase được sử dụng cho thủy phân Inulin, fructooligosaccharide có thể được sản xuất bởi quá trình thủy phân từng bậc, năng suất hơn 80%. - Ngoài các ứng dụng trên, inulinase còn được sử dụng để sản xuất các chất khác như: gluconic acid, sorbitol, pupulan, acetone và butanol. 3. Vi sinh vật Có nhiều loại vi sinh vật được sử dụng để sản xuất inulinase: nấm men, nấm mốc, và vi khuẩn Bảng 1 Một số vi sinh vật được sử dụng để sinh tổng hợp inulinase Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 11 Bảng 2 Một vài tính chất của inulinase từ các loài vi sinh vật khác nhau Sự ảnh hưởng của vi sinh vật lên khối lượng phân tử inulinin: - Hầu hết các inulinases từ nấm mốc có khối lượng phân tử lớn hơn 50,0 kDA (Pandey et al. 1999). Ví dụ, khối lượng phân tử của inulinase tinh sạch từ canh trường lên men của nấm men C. aureus G7a được ước tính là 60,0 kDA (Sheng et al. 2008b) trong khi khối lượng phân tử của inulinase tinh sạch từ P. guilliermondii được ước tính là 50,0 kDA (Gong et al 2008).. Tuy nhiên, inulinase ngoại bào từ nấm men K. fragilis có khối lượng phân tử là 250 kDA. - Khối lượng phân tử của exoinulinase tinh sạch từ vi khuẩn được ước tính là khoảng 54,0 KDA (Tsujimoto et al. 2003; Kwon et al. 2000). Điều này cho thấy khối lượng phân tử của exoinulinases từ vi khuẩn là gần như giống với khối lượng phân tử của exoinulinases từ nấm men. - Các endoinulinases từ nấm mốc và vi khuẩn cũng được tinh sạch và mô tả. Ví dụ, endoinulinase sản xuất bởi Penicillium sp. TN-88 có khối lượng phân tử là 68,0 kDA (Nakamura et al 1997). Trong khi khối lượng phân tử của endoinulinase ngoại bào từ Arthrobacter sp. S37 là 75 kDA (Kang et al 1998).. 3.1. Nhóm vi sinh vật sử dụng để sản xuất inulinase Chủng : Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 12 Giống : Kluyveromyces Loài : K. marxianus Hình 5 Kluyveromyces marxianus - Sự hình thành nang bào tử: sự tiếp hợp của các tế bào đơn bội hoặc các tế bào chồi có thể hình thành nên nang nấm, hoặc nang nấm có thể mọc trực tiếp từ tế bào lưỡng bội. 1 đến 4 nang bào tử được hình thành. Các bào tử được sắp xếp thành hình dạng từ hình cầu đến hình elip đến hình thận. Các bào tử sẽ được giải phóng từ nang bào tử ngay sau khi hình thành và có khuynh hướng kết dính lại. - Sự hình thành bào tử sẽ xảy ra sau 2-5 ngày ở 17-25oC trên môi trường thạch agar 1%. Hầu hết giống này có khả năng sinh bào tử tốt. 3.2. Đặc điểm sinh lí Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 13 - Khả năng lên men các loại đường: - Sự tiêu thụ cơ chất: - Những đặc tính sinh trưởng khác: Chỉ tiêu chọn giống vi sinh vật) - Khả năng sinh độc tố: không có. - Khả sinh tổng hợp gellan: càng mạnh càng tốt. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 14 - Khả năng thích nghi của giống phải cao, tốc độ sinh trưởng mạnh. - Điều kiện nuôi cấy: đơn giản, là môi trường đặc trưng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn và tổng hợp gellan. Môi trường dễ kiếm, giá thành không quá cao. - Sự ổn định của giống theo thời gian: càng lâu càng tốt. II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 15 Hình 6 Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất inulinase INULIN Chuẩn bị môi trường Tiệt trùng Lên men Ly tâm lần 1 Kết tủa Ly tâm lần 2 (NH4)2SO4 Nhân giống Kluyveromyces marxianus Hòa tan kết tủa Thẩm tách Trao đổi ion Trao đổi sắc ký ái lực Sấy Sản phẩm Dung dịch đệm acetate - phophate Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 16 III. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 1. Chuẩn bị môi trường lên men - Mục đích: Chuẩn bị chất dinh dưỡng, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lên men. - Thành phần môi trường lên men bề sâu bao gồm: (w/v) Inulin 1.0 % Chất chiết nấm men 1.0 % KH2PO4 0.5% KCl 0.12% NH4Cl 0.15% MgSO4.7H2O 0.07% ZnSO4.7H2O 0.01% Dung dịch các nguyên tố vết: 0.1% ( v/v) pH : 6.5 Sau khi tiệt trùng, làm nguội và đưa về nhiệt độ 30ºC để cấy canh trường giống với tỉ lệ 5% . 2. Tiệt trùng môi trường - Mục đích: Tiêu diệt vi sinh vật chuẩn bị cho quá trình lên men - Các biến đổi của nguyên liệu: Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), … Hóa lý: Sự bốc hơi nước. Hóa sinh: Enzym bị vô hoạt. Sinh học: Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật. Cảm quan:Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin,…). - Thiết bị sử dụng: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 17 Hình 7 Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 Chú thích: 1- Thùng chứa 2- Bơm 3- Bộ đun nóng 4- Bộ giữ nhiệt 5- Bộ lấy mẫu 6- Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát 8- Thiết bị lên men Cấu tạo: gồm thùng chứa môi trường dinh dưỡng, bơm ly tâm, bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt, bộ thu hồi nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh tự động các thông số của quá trình. Nguyên tắc hoạt động: Trước khi bắt đầu hoạt động tất cả các thiết bị, đường ống dẫn và phụ tùng YHC được thanh trùng bằng hơi quá nhiệt. Hơi nước được đưa vào bộ đun nóng theo đường viền của van điều chỉnh tiêu hao hơi, sau đó vào bộ giữ nhiệt, thu hồi nhiệt và theo đường viền của van giảm áp suất vào thiết bị làm mát. Cùng lúc mở các van xả nước ngưng và khi đạt được nhiệt độ lớn hơn 1400C thì bắt đầu tiệt trùng. Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy đảo các cấu tử của môi trường dinh dưỡng, môi trường mới lại cho vào thùng chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nóng. - Thông số công nghệ: Nhiệt độ: 1210C. Thời gian tiệt trùng: 20 phút. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 18 pH = 6.5 Tốc độ bơm môi trường: 3.5 m3/s. Áp suất: 1 atm. 3. Chuẩn bị giống - Mục đích: Chuẩn bị giống cho quá trình nhân giống. - Môi trư ờng giữ giống Kluyveromyces marxianus: Dịch chiết malt 0.3% Dịch chiết nấm men 0.3% Peptone 0.5% Glucose 1% Agar 2% pH: 6.5 Toàn bộ canh trường được giữ ở 300C và được thay mới 2 lần/ tuần và được bảo quản ở 40C. - Con giống từ canh trường trên trước khi cấy giống sẽ được chuẩn bị vào 50ml môi trường chứa: Chất chiết nấm men (0.3%,w/v), peptone (0.5%, w/v), glucose (2.0%, w/v) và đưa về pH 6.0 (môi trường này đã được tiệt trùng ở 1210C, 20 phút) trong một erlen 250ml, sau đó đem cho vào thiết bị lắc với vận tốc 100 rpm ở 300C trong 12 giờ và đem bảo quản ở 40C. - Các biến đổi : Quá trình làm tăng khuẩn lạc của nấm mốc. 4. Nhân giống - Nhân giống là quá trình tăng dung tích, dịch chứa sinh khối qua nhiều cấp. Mỗi cấp nhân giống thường tăng dung khối từ 10-15 lần. Cứ làm như vậy cho đến khi toàn bộ dung tích đủ để tiến hành quá trình lên men. - Khi nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các dụng cụ thủy tinh như ống nghiệm, erlen với các dung tích 750 ml, 1l, 2l kết hợp với tủ ấm, tủ lắc điều nhiệt. Do thể tích môi trường nhỏ nên việc sử dụng máy lắc có thể đảm bảo được sự đồng nhất trong canh trường nuôi và cung cấp đầy đủ oxy cho sự sinh trưởng, phát triển của nhóm vi sinh vật hiếu khí. - Khi nhân giống ở giai đoạn phân xưởng, người ta sử dụng những thiết bị với dung tích khác nhau: 100l, 500l, 1m 3 , 3 m 3 , 5 m 3 , 10 m 3 hoặc lớn hơn tùy theo dung tích của thiết bị lên men đang sử dụng tại nhà máy. - Mục đích: Chuẩn bị giống cho quá trình lên men. Quá trình nhân giống giúp gia tăng số lượngtế bào( tăng sinh khối), tích lũy đủ số lượng tế bào cần thiết để cấy giống vào môi trường lên men. - Môi trường nhân giống: Thành phần (g/l) Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 19 Dịch chiết malt 30.0 Peptone 5.0 Agar 15.0 Môi trường được hấp tiệt trùng ờ 1150C trong 10 phút. Dịch chiết malt là nguồn cung cấp năng lượng cho vi sinh vật, peptone cung cấp nguồn Nitơ cho vi sinh vật, agar là tác nhân làm đông đặc môi trường. - Phương pháp thực hiện: 10ml chứa môi trường glucose được tiệt trùng và canh trường vi sinh vật được ủ ở 30 oC trong 24h. Sau 24h, canh trường sẽ được chuyển vào 90ml môi trường đã tiệt trùng tương tự và tiếp tục ủ ở 300C trong 24h. 100ml giống này sẽ được chuyển tiếp đến 900ml môi trường và được ủ tiếp. Các cấp nhân giống được thực hiện cho đến khi có đủ số lượng giống cần thiết cho quá trình lên men. Hình 8 Thiết bị nhân giống 1. Hệ thống điều nhiệt (nhân giống trong erlen). 2. Bình nhân giống trung gian. 3. Th