Đối tượng và phương pháp nghiên cứu các loài cây thân gỗ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu Phấn hoa các loài cây thân gỗ thu được ở lâm trường Tân Phú, tỉnh Đồng Nai. 2.2 Nội dung nghiên cứu Hình thái học hạt phấn của các loài cây thân gỗ ở lâm trường Tân Phú. Những đặc điểm hình thái được quan tâm nghiên cứu bao gồm: 2.2.1 Tính đối xứng và sự phân cực Hầu hết hạt phấn thường có sự đối xứng lưỡng trắc hay đối xứng qua tâm. Hạt phấn trong giai đoạn đầu tiên của sự hình thành thường nằm trong bộ bốn. Mỗi tế bào mẹ hạt phấn giảm phân cho ra bốn tế bào con, mỗi tế bào con cho ra một hạt phấn. Có nhiều kiểu bộ bốn khác nhau, tùy thuộc vào cách sắp xếp của hạt phấn trong bộ bốn. Dù ở trong kiểu bộ bốn nào, mỗi hạt phấn đều có hai mặt, mặt dưới hướng vào bên trong và mặt trên hướng ra bên ngoài. Hình 2.1 Một số kiểu bộ bốn A: Hình tháp B: Bắt chéo C: Hình thoi D: Hình vuông E: Đường thẳng F: Hình chữ T. (Nguồn: W.Punt và cộng sự, 1994) Điểm chính giữa của mặt dưới được gọi là cực dưới (proximal pole) và điểm chính giữa của mặt trên được gọi là cực trên (distal pole). Những hạt phấn không có 13 sự khác biệt giữa hai cực, ta nói hạt phấn đó đẳng cực. Và ngược lại, những hạt phấn nào có sự khác biệt giữa hai cực, ta nói hạt phấn đó có tính phân cực. Hình 2.2 A: Hạt phấn trong bộ bốn, phần hướng ra phía ngoài (có màu đậm) là mặt trên B: Hạt phấn có phân cực C: Hạt phấn đẳng cực. (Nguồn: Michael Hesse và cộng sự, 2008). Mặt phẳng phân chia hạt phấn thành hai mặt là mặt phẳng xích đạo. Chu vi mặt lớn nhất của hạt phấn là chu vi xích đạo, đường kính của chu vi xích đạo là trục xích đạo (E). Đường thẳng nối liền hai cực của hạt phấn được gọi là trục cực (P). Trục cực của hạt phấn giao nhau tại trung tâm của bộ bốn. Khi phân tích hình thái học của hạt phấn, cần quan sát hạt phấn ở hai vị trí là vị trí xích đạo và vị trí cực. Vị trí xích đạo là vị trí trục cực nằm song song với quang trường của kính hiển vi, quan sát toàn bộ trục cực. Vị trí cực là vị trí mà trục cực nằm thẳng góc với quang trường của kính hiển vi. 14 Hình 2.3 A: Trục xích đạo (E) và trục cực (P) B: Vị trí xích đạo C: Vị trí cực. (Nguồn: W.Punt và cộng sự, 1994) 2.2.2 Hình dạng Khi quan sát ở vị trí cực hạt phấn có thể có dạng elip, tròn, có thùy hay đa giác. Hình 2.4 Hình dạng hạt phấn khi quan sát ở vị trí cực: A: Dạng elip B: Dạng tròn C: Dạng có thùy D: Dạng đa giác. (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) 15 Khi quan sát ở vị trí xích đạo thường hạt phấn có thể có hình tròn, hay hình bầu dục (elip) tùy thuộc vào tỉ lệ P/E (Chiều dài trục cực/Chiều dài trục xích đạo). Hình 2.5 Hình dạng hạt phấn khi quan sát ở vị trí xích đạo: A: Dạng dẹt B: Dạng tròn C: Dạng dài. (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) Năm 1952, Erdtman đã đưa ra một thang hình dạng hạt phấn khi quan sát ở vị trí xích đạo, dựa vào tỉ lệ P/E. Bảng 2.1 Hình dạng hạt phấn khi quan sát ở vị trí xích đạo. P/E HÌNH DẠNG <0,5 Rất dẹt 0,5 – 0,7 Dẹt 0,75 – 0,87 Hơi dẹt 0,87 – 1,14 Hơi tròn, tròn 1,14 – 1,3 Hơi dài 1,3 – 2 Dài >2 Rất dài 16 2.2.3 Kích thước Kích thước hạt phấn thay đổi với biên độ rất lớn. Hạt phấn có kích thước nhỏ nhất cho đến hiện nay là của họ Boraginaceae (họ vòi voi) chỉ vài µm. Họ Cucurbitaceae (họ bầu bí) kích thước của hạt phấn có thể lên đến 200µm. Hình 2.6 Thang kích thước của hạt phấn: A: Hạt phấn rất nhỏ B: Hạt phấn nhỏ C: Hạt phấn trung bình D: Hạt phấn lớn E: Hạt phấn rất lớn. (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) 17 2.2.4 Cấu tạo vỏ hạt phấn Hình 2.7 Cấu tạo vỏ của hạt phấn. (Nguồn: W.Punt và cộng sự, 1994) 2.2.4.1 Thành phần Vỏ của hạt phấn có cấu tạo rất phức tạp, kiến trúc bề mặt đa dạng, là đối tượng chính trong nghiên cứu hình thái học của hạt phấn. Thường có hai lớp ngoại mạc (exine) và nội mạc (intine). Ngoại mạc (exine): cấu tạo bởi Sporopollenin (kết hợp phần lớn bằng C90) rất bền vững về mặt hóa học lẫn cơ học. Được chia làm hai lớp ectexine và endexine. Lớp ngoài của ngoại mạc (ectexine): nằm ngoài cùng, thường có ba tầng: - Tầng phủ (tectum): là lớp trên cùng, có thể hình thành hay không ở những loài thực vật khác nhau. Thường có ba dạng tầng phủ toàn phần (tectate) hay tầng phủ một phần (subtectate) hoặc đôi khi không có tầng phủ (intectate). - Tầng giữa (infratectum): nằm bên dưới của tầng phủ, thường có dạng cột (columellar), dạng hạt (granular), hoặc dạng tổ ong (alveolar). - Tầng nền (foot layer): nằm bên dưới của tầng giữa. 18 Lớp trong của ngoại mạc (endexine): bắt màu yếu với phẩm nhuộm. Trong quá trình xử lý mẫu có thể bị phá hủy một phần. Đôi khi khó phân biệt giữa endexine và tầng nền, do đó người ta gọi chung chúng là endexine. Nội mạc (intine): cấu tạo từ celluloz pectin, không bền vững về mặt hóa học. Lớp này thường bị mất đi khi xử lý bằng hóa chất. 2.2.4.2 Các kiểu kiến trúc bề mặt của hạt phấn (sculpture element) Hạt phấn có tầng phủ (tectate): hầu hết hạt phấn của các loài đều có tầng phủ. Kiến trúc bề mặt không lồi - Dạng nhẵn (psilate): kiến trúc bề mặt của hạt phấn nhẵn (mịn). - Dạng lỗ thủng (perforate): trên bề mặt hạt phấn có những lỗ thủng xuyên qua tầng phủ, kích thước của lỗ nhỏ hơn 1µm. - Dạng lỗ điểm (micropitted): trên bề mặt hạt phấn có những lỗ thủng xuyên qua tầng phủ, kích thước của lỗ lớn hơn 1µm. - Dạng hốc lõm (foveolate): bề mặt hạt phấn có những chỗ lõm xuống, thường có hình tròn, đường kính thường lớn hơn 1µm. - Dạng rãnh lõm (fossulate): bề mặt hạt phấn có những đường rãnh kéo dài ra, kích thước không đều nhau. - Dạng phễu (tilioid): bề mặt hạt phấn có dạng phễu, xếp sát nhau. Do các cột của tầng giữa dính lại với nhau ở bên trên. - Dạng lưới lõm (negative reticulum)(areolate): do các rãnh nối lại với nhau, tạo thành ô lưới. Kích thước của các ô lưới có thể không đều nhau. 19 Hình 2.8 A: Dạng nhẵn (psilate) B: Dạng lỗ thủng (perforate) C: Dạng hốc lõm (foveolate) D: Dạng rãnh lõm (fossulate) E: Dạng phễu (tilioid) F: Dạng lưới lõm (areolate). (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) Kiểu kiến trúc bề mặt lồi - Dạng hạt (granulate): là những phần tử kích thước nhỏ, dạng tròn, đường kính thường nhỏ hơn 1µm. - Dạng mấu lồi (verrucate): là những mấu hay u tròn nhô lên, có đường kính lớn hơn hoặc bằng độ cao. - Dạng đinh gút (gemmate): là các mấu lồi lên dạng cột, phần đỉnh phình to ra. - Dạng chùy (clavate): là các mấu cao lên dạng cột, các cột này to dần từ chân lên đỉnh tạo nên hình chùy. - Dạng gai (echinate): là các mấu nhô cao lên có hình chóp, nhọn ở đỉnh. 20 Hình 2.9 A: Dạng hạt (granulate) B: Dạng mấu lồi (verrucate) C: Dạng đinh gút (gemmate) D: Dạng chùy (clavate) E: Dạng gai (echinate). (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) - Dạng lưới (reticulate): là hệ thống mạng gồm những khoang lưới. Tùy thuộc vào kích thước khoang lưới, có dạng lưới mịn (micro-reticulate) khi kích thước khoang lưới <1µm, dạng lưới trung bình (medium- reticulate) khi kích thước khoang lưới 1 – 3µm, dạng lưới thô (coarsely- reticulate) khi kích thước khoang lưới >3µm. - Dạng dải (striate): là các cạnh nhô lên nối tiếp với nhau thành những dải song song hay phân nhánh. Có dạng dải mịn (finely-striate), dạng dải trung bình (medium-striate), dạng dải thô (coarsely-striate). - Dạng gờ uốn khúc (rugulate): là dạng trung gian giữa dạng lưới và dạng dải, gồm các gờ lồi uốn khúc và sắp xếp lộn xộn. - Dạng lưới gai (lophate): bên dưới là cấu trúc có dạng lưới. Trên bề mặt khung lưới có những mấu lồi hình chóp hay hình cầu. 21 Hình 2.10 A: Dạng lưới (reticulate) B: Dạng dải (striate) C: Dạng gờ uốn khúc (rugulate) D: Dạng lưới gai (lophate). (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) Hạt phấn không có tầng phủ (Intectate) Có các dạng như: Dạng hạt (granulate), dạng mấu lồi (verrucate), dạng đinh gút (gemmate), dạng chùy (clavate), dạng gai (echinate), dạng cột (baculate). Ngoài những kiểu cấu trúc trên, trong tự nhiên hạt phấn còn phối hợp nhiều kiểu kiến trúc bề mặt khác nhau, tạo nên những dạng trung gian. 2.2.5 Cửa (aperture) Là vùng mỏng đi hay có cấu trúc đặc biệt của ngoại mạc (exine), tham gia vào quá trình nảy mầm của hạt phấn, là nơi đi ra của ống phấn. Cửa còn có nhiệm vụ cân bằng áp suất của hạt phấn với môi trường bên ngoài. 2.2.5.1 Cấu tạo Lớp ngoài của ngoại mạc (sexine): ở khu vực cửa, ngoại mạc thường nứt ra. Có hai dạng: Lỗ (porus): chỗ nứt có dạng hình tròn. Đôi khi lớp ngoài của ngoại mạc chung quanh lỗ dày lên hay mỏng đi tạo nên bìa lỗ (annulus). 22 Rãnh (colpus): chỗ nứt dài, có dạng thấu kính, chiều dài lớn hơn hai lần chiều rộng. Đôi khi lớp ngoài của ngoại mạc chung quanh rãnh dày lên hay mỏng đi tạo nên bìa rãnh (margo). Lớp trong của ngoại mạc (nexine): ở khu vực cửa, lớp trong của ngoại mạc nứt ra tạo thành miệng (ora). Miệng cũng nhiều hình dạng khác nhau. Đôi khi lớp trong của ngoại mạc chung quanh miệng dày lên về phía bên trong tạo nên mép trong của miệng (oral – costa). Hình 2.11 Các kiểu miệng: A: Tròn B: Elip nằm dọc rãnh C: Elip thẳng góc với rãnh D: Dạng xoang hổng E: Dạng thấu kính F: Hình thoi thắt lại ở giữa G: Hình thoi H: Hình chữ H I: Hình nơ J: Dạng bất định K: Hình chữ nhật L: Dạng vòng. (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) Ở một số cửa, trên mặt của phần ngoài có màng mỏng che phủ được gọi là màng cửa. Màng cửa là phần còn lại rất mỏng của ngoại mạc. Trong một số trường hợp 23 màng cửa phát triển mạnh, tạo thành nắp (operculum) đậy lên rãnh hay lỗ. Trên bề mặt màng cửa cũng có thể có những dạng kiến trúc khác nhau tương tự như cấu trúc của ngoại mạc. 2.2.5.2 Các kiểu cửa Dạng rãnh (colpate): cửa của hạt phấn là vết nứt dài dạng rãnh trên ở lớp ngoài của ngoại mạc. Lớp trong của ngoại mạc chưa có biến đổi về hình dạng. Lớp trong của ngoại mạc chung quanh lỗ dày lên về phía trong tạo nên bìa trong của rãnh (costa – colpi). Dạng lỗ (porate): cửa là lỗ dạng tròn trên lớp ngoài của ngoại mạc. Lớp trong của ngoại mạc chưa có biến đổi gì về hình dạng. Nếu lớp trong của ngoại mạc chung quanh lỗ dày lên về phía trong tạo nên bìa trong của lỗ (costa – pori). Dạng rãnh – miệng (colporate): đây là cửa dạng phức. Lớp ngoài của ngoại mạc có dạng rãnh, lớp trong của ngoại mạc có miệng. Thường miệng nằm ngay dưới đáy của rãnh. Dạng lỗ – miệng (pororate): đây là cửa dạng phức. Lớp ngoài của ngoại mạc có dạng lỗ, lớp trong của ngoại mạc có miệng. Hình 2.12 Các kiểu cửa: A: Rãnh (colpate) B: Lỗ (porate) C: Rãnh – miệng (colporate) D: Lỗ – miệng (pororate). (Nguồn: W.Punt và cộng sự, 1994) 24 2.2.5.3 Số lượng và cách sắp xếp Số lượng và cách sắp xếp của cửa là đặc điểm rất quan trọng trong nghiên cứu hình thái học của hạt phấn. Hình 2.13 Một số kiểu hạt phấn: A: Nhóm hạt phấn không có cửa B: Nhóm hạt phấn có rãnh C: Nhóm hạt phấn có rãnh – miệng nhưng miệng không rõ D: Nhóm hạt phấn có rãnh – miệng E: Nhóm hạt phấn có rãnh – miệng kép F: Nhóm hạt phấn có lỗ. (Nguồn: Vasanthy, G.; Grard, P.; Jayapalan, G., 2006) 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Dụng cụ - Kéo cắt cành, kéo nhỏ, túi giấy. - Máy ly tâm. - Ống nghiệm. - Nồi nấu cách thủy. - Pipettes Pasteur. - Lames – Lamelles. - Kính hiển vi quang học Leica. - Máy ảnh Canon PowerShot S80. - Bộ kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning Electron Microscope) JEOL JSM_5500 bao gồm: máy làm khô chân không, máy mạ vàng, kính hiển vi điện tử quét kết nối với máy tính chạy trên nền Windows NT 4.0. - Bơm tia. 2.3.2 Hóa chất - Acid acetic đậm đặc. - Acid sulfuric đậm đặc. - Anhydric acetic. - KOH 10%. - Nước acid chlorhydric (ClH N/60) - Cồn. - Nước cất. - Gelatine glycerine. - Paraffine. - Màu Safranine. - Terbutanol. - Vàng. 26 2.3.3 Thời gian, địa điểm thu mẫu Thời gian thu mẫu từ tháng 3 năm 2006 đến tháng 3 năm 2007. Hai tuần một lần, mỗi lần hai ngày. Để có thể dễ dàng tìm lại những cây được thu mẫu, các loài cây thân gỗ có hoa được thu hai bên đường, mỗi bên sâu vào 10m, dọc theo các tuyến chính của lâm trường Tân Phú từ trạm Bằng Lăng đến Thác Mai. Hình 2.14 Sơ đồ tuyến thu mẫu. (Nguồn: Đặng Lê Anh Tuấn, 2006) 2.3.4 Phương pháp 2.3.4.1 Thu mẫu Mẫu phấn hoa được giữ trong các túi giấy và sấy khô để tránh nấm mốc. Nếu hoa có kích thước lớn thì tách bỏ hết các phần phụ, chỉ giữ lại bao phấn. Đối với 27 những hoa có kích thước nhỏ thì để nguyên. Ngoài ra, một số loài phấn hoa được lấy từ mẫu tiêu bản của dự án “Phục hồi và phát triển di sản rừng tỉnh Đồng Nai”. Các loài nghiên cứu được định danh và so sánh mẫu với bộ tiêu bản của dự án “Phục hồi và phát triển di sản rừng tỉnh Đồng Nai”. 2.3.4.2 Xử lý mẫu Đối với mẫu quan sát trên kính hiển vi quang học Có nhiều phương pháp xử lý mẫu phấn hoa của nhiều tác giả như Erdtman [13], Wodehouse [29], Fischer [13], Bùi Thị Mai và M.Girard (theo CNRS) (*: trang 30). Để phù hợp với điều kiện thực tế, toàn bộ mẫu phấn hoa được xử lý theo phương pháp của Bùi Thị Mai và M.Girard. - Dehydrat hóa: cho mẫu phấn hoa vào ống nghiệm, cho thêm 2ml acid sulfuric (H2SO4), 26ml acid acetic (CH3COOH), 6ml anhydric acetic (CHCO)2O, khuấy đều. Đun cách thủy 10 phút. Ly tâm 2000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ chất lỏng bên trên, gạn lấy cặn. - Acetolyse: tiếp tục cho vào ống nghiệm 28ml acid acetic (CH3COOH), 4ml anhydric acetic (CHCO)2O, 8ml acid sulfuric (H2SO4), khuấy đều. Đun cách thủy 10 phút, ly tâm 2000 vòng/phút trong 5 phút, gạn bỏ chất lỏng. Sau đó rửa bằng cồn 30% từ hai đến ba lần. - Kiềm hóa: cho vào ống nghiệm 2ml KOH 10%, khuấy đều, đun cách thủy trong 5 phút. Ly tâm như trên, gạn bỏ chất lỏng. Rửa lần thứ nhất bằng nước cất, lần thứ hai rửa bằng nước acid chlorhydric (ClH N/60). Sau đó rửa lại bằng nước cất cho đến khi pH=7. 28 - Nhuộm màu: cho vào ống nghiệm 2 đến 3 giọt Safranine, khuấy đều, để trong 2 phút. Ly tâm như trên, gạn bỏ chất lỏng. - Làm tiêu bản: phấn hoa sau khi nhuộm sẽ cố định trên lame bằng dung dịch Glycerine jelly và cố định bằng Paraffine. Dán nhãn gồm những nội dung: tên khoa học, mã số mẫu, ngày làm mẫu. - Lưu trữ mẫu: phần phấn hoa còn lại trong ống nghiệm sẽ chuyển vào những ống nghiệm bằng polime trong dung dịch glycerin. Dán nhãn gồm những nội dung: tên khoa học, mã số mẫu, ngày làm mẫu. Đối với mẫu quan sát trên kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning Electron Microscope) - Ngâm trong Terbutanol: mẫu hạt phấn bảo quản trong dung dịch ở trên được lấy ra và ngâm trong Terbutanol khoảng 60 phút. - Làm khô mẫu: sau khi ngâm trong Terbutanol dùng ống hút, hút dung dịch có chứa hạt phấn ra giấy lọc có kích thước 0,5cm x 0,5cm, giữ lạnh và làm khô hoàn toàn trong môi trường chân không ở 50C (trong khoảng 4 đến 5 tiếng). - Mạ vàng: mẫu hạt phấn trên giấy lọc sau khi làm khô hoàn toàn được mang đi mạ vàng trong 30 phút. 2.3.4.3 Phân tích mẫu Kính hiển vi quang học Sử dụng phương pháp phân tích sáng – tối (L-O, L – Lux – sáng và O – Obscuritas – tối). Là phương pháp phân tích các đặc điểm của ngoại mạc bằng kính hiển vi quang học tùy thuộc vào mức độ sáng tối khác nhau của các thành phần ngoại mạc dựa vào vị trí cao độ khác nhau của vật kính. 29 Nếu vùng quan sát trên bề mặt hạt phấn có kiến trúc lồi thì khi vật kính ở vị trí cao nhất phần lồi sẽ tạo nên một vùng sáng và khi hạ dần vật kính xuống thì vùng sáng này sẽ dần chuyển sang tối. Ngược lại, nếu vùng quan sát trên bề mặt hạt phấn có kiến trúc lõm thì khi vật kính ở vị trí cao nhất phần lõm xuống sẽ tạo nên một vùng tối và khi hạ dần vật kính xuống thì vùng tối này sẽ sáng dần lên. Hình 2.15 Phương pháp phân tích L-O. A: Vùng quan sát có kiến trúc lồi, phần lồi sẽ sáng lên khi vật kính ở vị trí cao (H) và tối đi khi vật kính ở vị trí thấp (L) B: Vùng quan sát có kiến trúc lõm, vùng lõm sẽ tối khi vật kính ở vị trí cao (H) và sáng lên khi vật kính ở vị trí thấp (L). (Nguồn: W.Punt và cộng sự, 1994) Kính hiển vi điện tử Mẫu hạt phấn sau khi mạ vàng được đưa vào quan sát và chụp hình chi tiết kiến trúc bề mặt. 2.3.4.4 Mô tả, lập chìa khóa nhận diện, số hóa dữ liệu Đo chiều dài trục cực và trục xích đạo của hạt phấn. Kích thước cũng như các thành phần dùng đơn vị đo là µm. Mỗi loài đo khoảng 20 đến 25 mẫu. Chụp ảnh hạt phấn ở vị trí cực để mô tả kiến trúc ngoại mạc, đo độ dày của ngoại mạc và lát cắt quang học. Chụp ảnh hạt phấn ở vị trí xích đạo để mô tả kiến trúc ngoại mạc cũng như hình dạng, cấu tạo cửa. 30 Ảnh mô tả được chụp bằng máy Canon PowerShot S80 trên kính hiển vi quang học Leica ở độ phóng đại 50x, 100x. Và được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét JEOL JSM_5500, tùy vào kích thước của hạt phấn mà độ phóng đại khi phân tích trên kính hiển vi điện tử quét từ 1200 lần đến 3000 lần. Mỗi loài được chụp ở vị trí xích đạo và vị trí cực để mô tả các đặc điểm hình thái học của hạt phấn. Phần mô tả chi tiết cho các loài được xếp theo họ, các họ sắp xếp theo thứ tự chữ cái. Chìa khóa nhận diện được xây dựng dựa trên những đặc điểm khác nhau về hình thái của hạt phấn. Sau đó toàn bộ dữ liệu về mô tả cũng như chìa khóa được số hóa để xây dựng phần mềm nhận diện. (*) Phương pháp xử lý mẫu của Bùi Thị Mai và M. Girard (theo CNRS: Centre National De La Recherche Scientifique), bổ sung từ phương pháp của Erdtman, tương tự như phương pháp của Erdtman nhưng có giảm liều lượng acid sulfuric để hạn chế hạt phấn bị hư. Đồng thời thêm acid acetic vào dung dịch acetolyse để hạt phấn không bị đen, do đó không cần qua công đoạn tẩy màu trước khi nhuộm.