Kết quả và bàn luận về virus cúm A

Kết quả và bàn luận Phaàn 3: KEÁT QUAÛ & BAØN LUAÄN Kết quả và bàn luận 44 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 3. Kết quả và bàn luận 3.1 Dòng hóa các gene N1 vào vector plasmid pCR®2.1 3.1.1 Thu nhận gene N1 từ RNA bệnh phẩm RNA của virus H5N1 tách từ các mẫu bệnh phẩm đầu tiên được chuyển thành cDNA. Sau đó, thu nhận đoạn gene N1 mục tiêu bằng phương pháp khuếch đại PCR với cặp primer đặc hiệu là Ba-NA-1 và Ba-NA-1413R nhờ enzyme Expand High Fidelity PCR System. Đây là một hỗn hợp enzyme gồm Taq DNA polymerase chịu nhiệt và Tgo DNA polymerase - một DNA polymerase chịu nhiệt có chức năng sửa sai trên mạch mới được tổng hợp (Roche). Hình 3.1. Kết quả PCR gene N1 với cặp primer Ba-NA-1 và Ba-NA-1413R từ cDNA của các chủng 38ST, 7B-TV, 19A-TV, 11A-LA, và 12A-LA. Kết quả điện di cho thấy kích thước vạch biểu hiện đoạn gene N1 tạo thành trên các giếng rất đồng đều và có chiều dài khoảng 1413 bp khi so sánh với thang DNA chuẩn (500 bp ladder). Điều này phù hợp với dự đoán lý thuyết, bởi vì gene N1 của hầu hết các chủng virus cúm có chiều dài khoảng 1413 bp nếu phần cuống thân không bị mất 20 axít amin (60 nucleotide) và cặp primer sử dụng được thiết kế đặc hiệu để khuếch đại gene N1, nên các vạch sáng trên hình điện di là kết quả thuyết phục cho thấy đây chính là gene N1. Hình 3.1 trình bày kết quả điện di 5 sản phẩm Kết quả và bàn luận 45 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam khuếch đại gene N1 của 5 chủng H5N1 trong số 16 chủng H5N1 lưu hành tại các tỉnh Long An, Trà Vinh, Sóc Trăng, Đồng Tháp và Cà Mau, mà chúng tôi đã khuếch đại thành công. 3.1.2 Biến nạp các plasmid pCR®2.1 chứa gene N1 vào tế bào TOP10 Sản phẩm PCR của gene N1 khuếch đại bằng Taq DNA polymerase ở hai đầu 3’ (trên sợi DNA) sẽ có chứa một nucleotide Adenine (A), điều này làm thuận lợi cho quá trình nối DNA gene N1 vào vector plasmid pCR®2.1 nhờ enzyme T4 DNA Ligase (Invitrogen). Đây là dòng vector có chứa một nucleotide Thymine (T) nằm ở hai đầu nối bổ sung với các đầu Adenine trên DNA gene N1. Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E.coli khả nạp TOP10. TOP10 là dòng tế bào không biểu hiện chất ức chế lac (lac repressor), nên kết quả phản ứng dòng hóa được sàng lọc trên đĩa thạch BHIA chứa 100 µg/ml ampicillin và X-Gal 40 mg/ml (không chứa IPTG). Chỉ có các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pCR®2.1 mang gene kháng kháng sinh mới có thể sinh trưởng trên môi trường sàng lọc này. Các khuẩn lạc mục tiêu là những khuẩn lạc đơn màu trắng (white colonies) phát triển trên đĩa thạch. Hình 3.2. Kết quả biến nạp gene N1 của chủng A/DK/VietNam/7B-TV/2008 (H5N1). Kết quả và bàn luận 46 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Kết quả biến nạp plasmid mang DNA gene N1 của chủng A/DK/VietNam/7B- TV/2008 (H5N1) như trên hình 3.2 cho thấy, các khuẩn lạc mọc đều khắp đĩa thạch và phần lớn là các khuẩn lạc đơn, có rất ít các khuẩn lạc mọc thành cụm hoặc dính với nhau. Đặc biệt các khuẩn lạc trắng hầu hết đều phát triển thành từng khuẩn lạc riêng lẻ, rất thuận lợi cho việc sàng lọc plasmid. Chúng tôi chọn 10 khuẩn lạc trắng để tách plasmid. Sau đó, cắt các plasmid tái tổ hợp này bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI để kiểm tra kích thước đoạn DNA nối vào plasmid pCR®2.1. Trên plasmid pCR®2.1, hai bên sát vùng chèn DNA mục tiêu vào có trình tự nhận biết vị trí cắt của enzyme EcoRI, nên đoạn DNA được cắt ra có kích thước gần như bằng với kích thước đoạn DNA chèn vào. Có 7 plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng cho kết quả điện di (sau khi cắt men) biểu hiện hai vạch có kích thước phù hợp với kích thước gene N1 (1413 bp) và plasmid pCR®2.1 ở trạng thái mở vòng (khoảng 3900 bp). Hình 3.3. Kết quả cắt men EcoRI của 3 plasmid pCR®2.1 chứa gene N1 của chủng A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1). Hình 3.3 trình bày kết quả điện di của 3 trong số 7 plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA có kích thước tương ứng với gene N1 sau khi cắt bằng EcoRI. Để xác định đoạn DNA nối vào các plasmid tái tổ hợp này có phải là gene N1 hay không, chúng tôi giải trình tự đoạn DNA nối này bằng cặp mồi M13 Forward và M13 Kết quả và bàn luận 47 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Reverse. Cặp primer này được thiết kế dựa trên vùng trình tự gần hai đầu nối sản phẩm DNA của plasmid pCR®2.1, do đó trình tự giải được bao gồm một đoạn ngắn của plasmid pCR®2.1 và phần còn lại là trình tự của đoạn DNA chèn vào (xem phụ lục 4). Kết quả so sánh cho thấy, phần trình tự đoạn DNA chèn vào plasmid pCR®2.1 hoàn toàn tương đồng với trình tự gene N1. Điều này chứng tỏ đoạn DNA chèn vào plasmid pCR®2.1 chính là gene N1, như vậy gene N1 đã được nối thành công vào plasmid vector pCR®2.1. Tương tự như thế, chúng tôi đã nối thành công tạo ra 8 plasmid pCR®2.1 chứa DNA gene N1 của 8 chủng virus cúm gia cầm H5N1 lưu hành tại các tỉnh Cà Mau, Trà Vinh, Long An và Sóc Trăng (Bảng 2.1). 3.2 Giải trình tự gene N1 của các chủng H5N1 Với mục đích thu nhận được trình tự đầy đủ gene N1 của các chủng H5N1 lưu hành tại một số khu vực phía nam, chúng tôi sử dụng hệ thống giải trình tự DNA tự động CEQTM 8000 Genetic Analysis System và bộ kit đánh dấu Dye Terminator Cycle Sequencing Quick Start để giải trình tự các gene N1. Trình tự giải xong sẽ được phân tích, so sánh bằng phần mềm BioEdit version 7.0.9.0 và công cụ BLAST trên trang web chủ NCBI với nguồn dữ liệu Influenza Virus Resource (IVR). Influenza Virus Resource là nguồn dữ liệu từ Dự án Giải trình tự bộ gene virus cúm của NIAID (The National Institute of Allergy and Infectious Diseases – Viện Nghiên cứu Quốc gia về Dị ứng và Bệnh nhiễm trùng của Hoa Kỳ) và Ngân hàng gene (GenBank), kèm theo các công cụ cho việc phân tích, giải thích trình tự virus cúm. Ngoài ra, IVR còn cung cấp những liên kết (links) đến các nguồn dữ liệu khác có chứa trình tự, các ấn phẩm và những thông tin phổ biến về virus cúm. Quá trình giải trình tự có thể tiến hành trên các sản phẩm DNA gene N1 của phản ứng PCR sau khi tinh sạch hoặc từ các plasmid đã dòng hóa DNA gene N1 này vào (Bảng 2.1). Trong đó, mỗi đoạn DNA gene N1 sẽ được giải trình tự theo hai chiều với các primer đặc hiệu, để cho ra kết quả là các phân đoạn trình tự nhỏ liên tiếp nhau nhưng sao cho giữa chúng luôn có phần chồng lấp lên nhau. Có nghĩa là một phần trình tự đuôi của phân đoạn một sẽ giống với một phần trình tự đầu của phân đoạn hai, và phần đuôi của phân đoạn hai sẽ giống với một phần trình tự đầu Kết quả và bàn luận 48 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam của phân đoạn ba,… đây là nguyên tắc giải trình tự theo phương thức gối đầu (overlapping). Hệ thống CEQTM 8000 Genetic Analysis System có thể giải được mỗi phân đoạn trình tự dài khoảng 500 – 700 nucleotide. Do đó, đối với gene N1 có chiều dài ước tính 1413 bp, về cơ bản cần khoảng 3 primer trên một mạch là đủ để giải trình tự toàn bộ chiều dài của DNA gene N1. Các phân đoạn trình tự nhỏ sau khi giải xong sẽ được lắp ráp thành đoạn DNA gene N1 hoàn chỉnh nhờ phần mềm chuyên dụng CEQuence Investigator, cùng với các trình tự gene N1 tham khảo trên IVR. Hình 3.4 trình bày một phần trình tự trong số 658 nucleotide giải được của gene N1 (vị trí nucleotide 1 - 65) từ plasmid p7BTV-NA sử dụng primer M13 Forward. Trong đó, các peak (đỉnh nhọn tín hiệu) với 4 màu sắc khác nhau biểu diễn cho 4 loại nucleotide phân bố thành từng peak riêng lẻ rất rõ ràng, không có hiện tượng peak này trùng lên peak khác, và trình tự sợi DNA gene N1 được đọc theo chiều từ trái sang phải. Hình 3.4. Kết quả một phần trình tự DNA gene N1 (vị trí 1 - 65) của chủng A/DK/VietNam/7B-TV/2008 giải từ plasmid p7BTV-NA với primer M13 Forward. Đỉnh màu xanh dương: T; Đỉnh màu đỏ: A; Đỉnh màu đen: C; Đỉnh màu xanh lá cây: G Với cách thức như trên, chúng tôi đã giải trình tự thành công DNA gene N1 của 16 chủng virus gia cầm H5N1 lưu hành tại một số khu vực miền nam Việt Nam từ năm 2006 đến năm 2008 gồm: Cà Mau, Đồng Tháp, Trà Vinh, Long An và Sóc Trăng (xem trình tự đầy đủ ở phụ lục 1). Kết quả và bàn luận 49 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Bảng 3.1. Thứ tự các chủng H5N1 sử dụng để giải trình tự gene N1 STT Mã bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm Địa điểm Năm Viết tắt 1 A/DK/Viet Nam/CM-1/2006 (H5N1) Vịt Cà Mau 2006 CM-1/2006 2 A/Teal/Viet Nam/MBP5/2006 (H5N1) Le le 2006 MBP5/2006 3 A/DK/Viet Nam/DT-9/2007 (H5N1) Vịt Đồng Tháp 2007 DT-9/2007 4 A/DK/Viet Nam/11A-LA/2008 (H5N1) Vịt Long An 2008 11A-LA/2008 5 A/DK/Viet Nam/12A-LA/2008 (H5N1) Vịt Long An 2008 12A-LA/2008 6 A/DK/Viet Nam/36ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 36ST/2008 7 A/DK/Viet Nam/38ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 38ST/2008 8 A/DK/Viet Nam/39ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 39ST/2008 9 A/DK/Viet Nam/40ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 40ST/2008 10 A/DK/Viet Nam/41ST/2008 (H5N1) Vịt Sóc Trăng 2008 41ST/2008 11 A/DK/Viet Nam/15A-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 15A-TV/2008 12 A/DK/Viet Nam/17A-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 17A-TV/2008 13 A/DK/Viet Nam/19A-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 19A-TV/2008 14 A/DK/Viet Nam/20A-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 20A-TV/2008 15 A/DK/Viet Nam/2B-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 2B-TV/2008 16 A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) Vịt Trà Vinh 2008 7B-TV/2008 Gene N1 của các virus cúm A H5N1 lưu hành tại miền nam Việt Nam dài 1350 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide neuraminidase 449 axít amin. Phân tích trình tự gene N1 và các gene còn lại của virus H5N1 cho thấy, hầu hết các chủng virus cúm gia cầm H5N1 Việt Nam sử dụng để giải trình tự gene N1 trong đề tài này thuộc type Z (cùng type gene với chủng H5N1 gây dịch ở Việt Nam từ cuối năm 2003). Đây là type virus cúm H5N1 tái tổ hợp chứa 2 gene HA và NA có nguồn gốc từ chủng A/Goose/Guangdong/1/96 (được biết như là chủng H5N1 đầu tiên phân lập) và các gene còn lại từ hai chủng cúm A khác. Cũng giống như các virus khác thuộc type Z, gene N1 của các chủng H5N1 miền nam Việt Nam đều mất 20 axít amin (vị trí 49 đến 68) ở phần cuống thân (stalk), đặc điểm này được cho là để thích nghi với các gia cầm trên cạn [52]; còn chủng H5N1 của HongKong năm 1997 mất 19 axít amin (vị trí 55 đến 73), trong khi gene N1 của chủng virus gốc Guangdong/96 không bị mất vùng này [25] (Hình 3.5). Ngoại trừ chủng H5N1 tách Kết quả và bàn luận 50 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam từ chim hoang dại MBP5/2006 có gene N1 không bị mất 20 axít amin ở vùng cuống thân này. Mức độ tương đồng gene N1 với nhau giữa các chủng H5N1 ở ba tỉnh Trà Vinh, Long An, và Sóc Trăng năm 2008 lớn hơn 99% về trình tự nucleotide cũng như axít amin. Gene N1 Việt Nam tương đồng 82% (nucleotide) và 88% (axít amin) với gene N1 chủng A/Brevig Mission/1/1918 (H1N1) [AF250356] - phân lập từ đại dịch cúm năm 1918; tương đồng 87% (nucleotide) và 90% (axít amin) với gene N1 chủng A/HongKong/156/97 (H5N1) [AF046089] - phân lập từ dịch cúm H5N1 HongKong năm 1997. Hình 3.5. Có 15 chủng H5N1 miền nam bị mất 20 axít amin ở vùng cuống thân. Từ những nghiên cứu của Colman và Wang cho thấy, trên gene N1 của hầu hết các chủng virus cúm H5N1 có 21 axít amin bảo tồn, bao gồm các axít amin chức năng (functional residues) có vai trò tương tác trực tiếp với các chất nền (substrate) (có thể là axít sialic hoặc tác nhân ức chế như DANA), tham gia vào phản ứng xúc tác; và các axít amin lân cận (framework residues) có vai trò tương tác với các axít amin chức năng nhằm giữ ổn định cấu trúc của vị trí hoạt động (active site) [16, 69]. Gene N1 của các chủng H5N1 miền nam có đầy đủ 21 axít amin bảo tồn này trong Kết quả và bàn luận 51 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam vùng head region và không có trường hợp đột biến nào. Chúng tôi cũng không tìm thấy những đột biến ở các vị trí quan trọng như His274Tyr (H274Y) hay Asn294Ser (N294S) trong tất cả 16 gene N1 được giải trình tự, đây là những đột biến trên gene N1 giúp cho các chủng virus cúm A H5N1 kháng Oseltamivir. Bảng 3.2. Các axít amin bảo tồn trên gene N1 của các chủng H5N1 Việt Nam Hiện tại, cũng đã có bằng chứng cho thấy chủng H5N1 gây dịch ở Việt Nam vào cuối năm 2003 có nguồn gốc từ tỉnh Yunnan (Vân Nam) của Trung Quốc. Wang và cộng sự khi so sánh, phân tích toàn bộ 8 gene của các virus H5N1 phân lập tại tỉnh Yunnan (đại diện là chủng A/chicken/Yunnan/1215/2002(H5N1)) từ khoảng tháng 11/2002 đến tháng 4/2003 và các chủng H5N1 gây dịch ở Việt Nam từ cuối năm 2003 và đầu năm 2004 thấy rằng: 6 gene mã hóa cho các protein bên trong virus (PB1, PB2, PA, NP, M, và NS) tương đồng hơn 99%, gene HA tương đồng 98,12% và gene NA tương đồng 98,89% về trình tự axít amin. Kết hợp với các thông tin thương mại gia cầm trên vùng biên giới giáp giữa Yunnan và phía bắc Việt Nam (Yunnan và Việt Nam có đường biên giới chung khoảng 600 km), cùng với thời gian xác nhận trận dịch đầu tiên tại Việt Nam vào tháng 11/2003, muộn Kết quả và bàn luận 52 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam hơn thời điểm phân lập các chủng H5N1 ở Yunnan. Wang cho rằng đây chính là những bằng chứng thuyết phục cho thấy các chủng H5N1 gây dịch ở Việt Nam từ cuối năm 2003 được truyền trực tiếp từ tỉnh Yunnan thông qua hoạt động buôn bán gia cầm trên vùng biên giới [68]. Trên cơ sở đó, để biết chi tiết hơn về những đột biến khác ngoài 21 axít amin bảo tồn trên 16 gene N1 giải trình tự trong đề tài, chúng tôi sử dụng trình tự gene N1 của chủng A/chicken/Yunnan/1215/2002 (H5N1) xem như là chủng chuẩn để so sánh. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sử dụng thêm các chủng H5N1 của Việt Nam, Trung Quốc, và Indonesia (là quốc gia có nhiều người tử vong nhất vì H5N1) trong khoảng thời gian từ 2004 đến 2007 có sẵn trên nguồn dữ liệu IVR để cùng so sánh, phân tích (phụ lục 3). Tỉ lệ tương đồng trung bình về axít amin của 16 chủng Việt Nam so với chủng chuẩn Yunnan/2002 là 95,93%. Tương đồng nhiều nhất (97%) là 2 chủng Long An và 3 chủng Trà Vinh: 15A-TV, 17A-TV, 20A-TV; thấp nhất (90%) là chủng H5N1 phân lập từ chim hoang dại MBP5/2006, đây là chủng có kiểu gene hoàn toàn khác với các chủng còn lại. Sáu axít amin đầu tiên MNPNQK thuộc vùng cytoplasmic tail của cả 16 gene N1 Việt Nam đều bảo tồn, không có thay đổi. Điều này hoàn toàn phù hợp, vì vùng đuôi này có tính bảo tồn rất cao trong tất cả các type cúm A. Tại vị trí 16, đa phần các chủng H5N1 là Valine (V), trong khi đó có 5 chủng H5N1 Sóc Trăng năm 2008 vị trí này là Isoleucine (I), riêng chủng DT-9/2007 thì vị trí này là Alanine (A). Ở vị trí 26 chúng tôi thấy có sự biến đổi đồng loạt, hầu hết 22 chủng H5N1 tham khảo đều là Isoleucine (I), còn chủng DT-36/2005 và 15 trong số 16 chủng giải trình tự là Valine (V). Cả hai vị trí này (16 và 26) là những axít amin thuộc vùng xuyên màng (TM- trans membrane) của gene N1, vùng này thường có tính bảo tồn cao trong virus cúm A. Như vậy, trong số 29 axít amin của vùng này ở các virus H5N1 Việt Nam, toàn bộ 5 chủng Sóc Trăng năm 2008 đều có hai đột biến. Cũng đã có thí nghiệm chứng minh một số những thay đổi axít amin liên tiếp trong vùng TM sẽ ảnh hưởng nhiều đến sự sinh sản của virus [6]. Tuy nhiên, hai đột biến trên vùng TM của các chủng Việt Nam cách nhau 10 axít amin, và hiện tại vẫn chưa rõ chức năng sinh học cụ thể của những đột biến này. Kết quả và bàn luận 53 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Bảng 3.3. Đột biến axít amin trên 16 gene N1 Việt Nam so với các chủng H5N1 kháca Vò trí caùc axít amin ñoät bieán treân gene N1 Caùc chuûng H5N1 16 26 55 63 64 75 80 153 233 244 257 269 280 287 312 414 429 430 CM-1/2006 V V L V K N Y R H I E T N N K G N S MBP5/2006 V I P V A S Y R Y V E M N N T N N S DT-9/2007 A V L V K N Y R H I K I N N T S N S 11A-LA/2008 V V P A K N Y R H I E T N N K G S G 12A-LA/2008 V V P A K N Y R H I E T N N K G S G 36ST/2008 I V P A K N Y R H I E T N N K G S G 38ST/2008 I V P A K N Y R H I E T N N K G S G 39ST/2008 I V P A K N Y R H I E T N N K G S G 40ST/2008 I V P A K N Y R H I E T D N K G S G 41ST/2008 I V P A K N Y R H I E T N N K G S G 15A-TV/2008 V V P A K N Y R H I E T N N K G S G 17A-TV/2008 V V P A K N Y R H I E T N N K G S G 19A-TV/2008 V V P A K N Y R H I E T N N K G S G 20A-TV/2008 V V P A K N Y R H I E T N N K G S G 2B-TV/2008 V V P A K N Y R H I E T N D K G S G 7B-TV/2008 V V P A K N Y R H I E T N D K G S G Gs/GD/1/96 V I L V T S H R Y V E T N N T S N S HK/156/97 V I Y V T S Y R Y V E T N N T K N S Ck/YN/1215/2002 V I L V T S H K Y V E T N N T S N S Dk/YN/215/2003 V I L V T S H K Y V E T N N T S N S Dk/HN/795/2002 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S VN/1194/2004 V I L V K N Y R H V E T N N T S N S VN/1203/2004 V I L V K N Y R H V E T N N T S N S VN/DT-036/2005 V V L V K N Y R H V E T N N T S N S Hn/30408/2005 V I L V K N Y R H V E T N N T S N S AH/1/2005 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S MDk/JX/2300/2005 V I L V T S Y R Y V E T N N T S N S Dk/FJ/1734/05 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S Dk/GY/2231/2005 I I L V I S H R Y V E T N N T S N S Ck/DR/BPPVI/2005 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S ID/5/2005 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S ID/CDC836/2006 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S SH/1/2006 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S MsDk/ID/KD/2006 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S ID/CDC1032N/2007 V I L V T R H R Y I E T N N T S N S JS/1/2007 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S Dk/HN/1930/2007 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S Sw/ID/ML/2007 V I L V T R H R Y V E T N N T S N S aViết tắt: AH, Anhui; Ck, chicken; Dk, duck; DR, Dairi; FJ, Fujian; GD, Guangdong; Gs, Goose; GY, Guiyang; HK, HongKong; Hn, Hanoi; HN, Hunan; ID, Indonesia; JS, Jiangsu; JX, Jiangxi; KD, Kedri163124; MDk, migratory duck; ML, Magelang1631-57; MsDk, muscovy duck; SH, Shanghai; Sw, swan; VN, Viet Nam; YN, Yunnan. Kết quả và bàn luận 54 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Vùng cuống thân (stalk) có vị trí từ khoảng axít amin thứ 40 cho đến 90 đối với gene NA không bị mất 20 axít amin ở vùng này, do đó đối với 16 gene N1 trong đề tài (trừ MBP5/2006) đều mất 20 axít amin ở vùng stalk, thì vị trí vùng này có thể ước định trong khoảng axít amin 40 đến 70. Cũng đã có những thí nghiệm cắt một vài axít amin cho đến toàn bộ vùng stalk hay thêm một vài axít amin vào vùng này, để chứng minh độ dài của vùng stalk ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Neuraminidase của virus [11]. Nhưng vẫn còn thiếu những thí nghiệm chứng minh các đột biến riêng lẻ trên vùng stalk này có ảnh hưởng như thế nào đến khả năng sinh sản cũng như độc tính của virus. Do đó, với 3 đột biến khác nhau (vị trí 55 L→P, 63 V→A, và 64 T→K) của tất cả 13 chủng H5N1 năm 2008 so với chủng chuẩn cũng như các chủng tham khảo, thì đây cũng có thể là những đột biến quan trọng cần nghiên cứu thêm. Các vị trí còn lại từ 75 cho đến 430 như thông tin so sánh trên bảng 3.3, chúng tôi thấy nhóm các virus phân lập năm 2008 có những đột biến rất đồng loạt giữa các chủng, trừ chủng 40ST/2008 ở vị trí 280 và hai chủng Trà Vinh (2B-TV/2008, 7BTV-2008) ở vị trí 287 có đột biến N→D; trong khi ba chủng: CM-1/2006, MBP5/2006 và DT-9/2009 các đột biến có tính riêng lẻ, rải rác. Đặc biệt, vị trí 257 chỉ có duy nhất chủng DT-9/2007 là bị đột biến E→K trong toàn bộ 38 chủng H5N1 trên bảng so sánh. Ở vị trí 269, chủng DT-9/2007 có đột biến T→I, còn chủng MBP5/2006 đột biến T→M. Những đột biến này nằm trên vùng head region của gene N1, cũng là vùng có vai trò quan trọng nhất trong hoạt tính enzyme NA. Do vậy, tất cả các đột biến trên vùng này rất nên được quan tâm nghiên cứu, đặc biệt là những đột biến riêng lẻ. Như vậy, chúng tôi đã thành công trong việc giải trình tự 16 gene N1 của các chủng H5N1 lưu hành tại một số tỉnh phía nam từ năm 2006 đến 2008. Kết quả giải trình tự cho thấy, gene N1 của virus H5N1 Việt Nam có nhiều đột biến axít amin so với chủng chuẩn Yunnan/2002, điều này cũng phù hợp với trật tự trên cây phả hệ gene N1 (Hình 3.6). Và quan trọng là các đột biến này hiện tại vẫn cần những nghiên cứu sâu hơn để có thể hiểu chính xá