Luận văn Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-Loop hệ gen ty thể của gà ri, gà đông tảo và gà tre

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ---------------0o0--------------- LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào. Tác giả luận văn Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nông Văn Hải đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn, KS. Vũ Hải Chi, CN. Địch Thị Kim Hƣơng và tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Đề tài đƣợc hỗ trợ kinh phí từ đề tài nhánh thuộc đề tài "Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội" do PGS. TS. Lê Thị Thuý, Viện Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.3. Hoá chất......................................................................................... 23 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu……………………………………….……... 23 2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……..………………….…… 24 2.2.1. Điện di trên gel agarose…………..………………………….…… 24 2.2.2. Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)…………………..……..…..…………………...… 26 2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR……..……….…………...……….…... 28 2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop…………………………….….………. 29 2.2.5. Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng.……….……… 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…..………………….………. 31 3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR……..…………………….. 31 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank……..……………....…….…...... 36 3.3. Sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 3 giống gà…..…….……. 56 3.4. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu..….. 56 3.5. So sánh mức độ đa dạng di truyền của 3 giống gà nghiên cứu với một số quần thể gà châu Á……………..……………...…................ 58 3.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại……..………………..….……… 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................... 62 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ................................................................ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO……..……..……………………..…………… 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHƢ̃NG CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) CJF Gà rừng Cyelon ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate DNase Deoxyribonuclease đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide ETOH Ethanol GJF Gà rừng màu xám GrJF Gà rừng màu xanh mtDNA Hệ gen ty thể Nxb Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction RJF Gà rừng đỏ RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rpm Vòng/ phút TAE Tris – acetate – EDTA Tm Nhiệt độ biến tính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 phƣơng, cùng với sự du nhập của vật liệu di truyền mới do việc nhập khẩu một cách ồ ạt các giống nhập ngoại nên chúng đứng trƣớc nguy cơ bị lai tạp, mất dần. Do đó, vấn đề bảo tồn nguồn gen các giống gia cầm quý là một yêu cầu bức thiết của thực tế. Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống vật nuôi là bƣớc đầu tiên trong quy trình tiến tới mục tiêu bảo tồn, cải tiến và sử dụng nguồn giống. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền đã đƣợc tiến hành ở cấp độ DNA - vật chất di truyền của sự sống. Cũng nhƣ các loài động vật có xƣơng sống khác, hệ gen của gà cũng gồm hệ gen nhân và hệ gen ty thể (mtDNA). Do kích thƣớc của hệ gen nhân là rất lớn, việc sử dụng các gen trong nhân làm đối tƣợng nghiên cứu đa dạng di truyền có một số nhƣợc điểm. Gen nhân có tần số đột biến thấp, mặt khác chúng lại đƣợc di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn. Bởi vậy, DNA ty thể với những lợi thế của mình nhƣ tần số đột biến cao, di truyền theo dòng mẹ, không tái tổ hợp, số lƣợng bản sao lớn và khá đồng nhất đã, đang và sẽ là công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và phát sinh chủng loại [15], [30], [50], [57]. Hệ gen ty thể có hai vùng chức năng chính. Vùng mã hóa chiếm tới 93% hệ gen ty thể, vùng còn lại đƣợc gọi là vùng D-loop (vùng siêu biến hay vùng điều khiển) không đƣợc dịch mã, chứa trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản của chuỗi nặng và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gen trong vùng mã hóa. Vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn nhiều so với các vùng khác của hệ gen ty thể, vì vậy nó là vùng thích hợp và có giá trị nhất trong phân tích di truyền quần thể, đặc biệt là đối với các nghiên cứu biến đổi di truyền bên trong loài [25]. Do đó, xác định và so sánh trình tự mtDNA nhất là trình tự vùng D-loop là phƣơng pháp có độ tin cậy cao đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƢỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ Trong hệ thống phân loại, chi Gallus gồm 4 loài gà rừng khác nhau: 1. Gà rừng đỏ G. gallus (Red junglefowl - RJF) thƣờng gặp ở Đông Dƣơng, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia và vài nƣớc khác. 2. G. lafayetti (Lafayette's JF) ở vùng Sri Lanka, loài này còn có tên gọi là gà rừng Ceylon (Cyelon junglefowl - CJF). 3. Gà rừng màu xanh G. varius (Green junglefowl - GrJF) phổ biến ở vùng Java nên còn gọi là gà rừng Java. 4. G. sonneratii (Grey junglefowl - GJF), còn gọi là gà rừng màu xám, thƣờng gặp ở vùng rừng núi Ấn Độ. Trong 4 loài trên thì phổ biến nhất là loài gà rừng đỏ G. gallus (RJF). Hiện nay, loài này gồm 5 phân loài: G. g. gallus (Southeast Asian Red junglefowl - SE Asian RJF), G. g. spadiceus, G. g. bankiva, G. g. murghi (Indian RJF) và G. g. jabuoillei [49]. Sự phân loại này chủ yếu dựa trên các đặc điểm kiểu hình và khu vực phân bố địa lí của các quần thể. Ở Việt Nam có ba phân loài của gà rừng đỏ với số lƣợng còn tƣơng đối nhiều: G. gallus gallus (1), G. gallus jabouibi (2), G. gallus spadiceus (3). Phân loài 1: phân bố từ phía nam tỉnh Hà Tĩnh vào đến Nam Bộ. Phân loài 2: phân bố ở vùng Đông Bắc nƣớc ta. Phân loài 3: phân bố ở vùng Tây Bắc nƣớc ta [8], [10]. Trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau: Giới Động vật (Animalia) Ngành Động vật có xƣơng sống (Chordata) Lớp Chim (Aves) Bộ Gà (Galiformes) Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus Loài Gallus gallus Phân loài Gallus gallus domesticus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Hiện nay, gà là một trong những vật nuôi phổ biến và đƣợc nuôi ở nhiều vùng trên toàn thế giới. Tuy nhiên nguồn gốc của gà nuôi chƣa đƣợc thống nhất và vẫn đang đƣợc tranh cãi giữa thuyết đơn nguyên và đa nguyên. Thuyết đơn nguyên cho rằng tổ tiên của tất cả các loại gia cầm là phân loài Gallus gallus gallus của gà rừng đỏ sống ở Đông Nam Á (SE Asian RJF) [26], [27]. Trong khi nhiều tác giả lại đƣa ra bằng chứng chứng tỏ rằng gà nhà có nhiều tổ tiên khác nhau theo dòng mẹ, có tới 3 phân loài của gà rừng đỏ có thể là tổ tiên trực tiếp của gà nhà gồm G. g. gallus, G. g murghi và G. g. spadiceus. Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ giả thuyết này [34], [42], [43], [50]. Boruxenco (1953) và Valilop (1993) cho rằng Nam Á, Ấn Độ, Đông Dƣơng… là một trong những trung tâm châu Á đầu tiên thuần dƣỡng nhiều loài vật nuôi trong đó có gà nhà [5]. Từ các khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á và Ấn Độ, gà rừng đỏ Gallus gallus đã lan rộng ra các vùng khác trên thế giới khi con ngƣời thuần hóa chúng, kết quả là tạo ra nhiều giống gà khác nhau [61]. Tiếp theo quá trình thuần hóa là các chƣơng trình chọn giống rộng rãi đã tạo ra 4 dòng gà khác biệt: lấy trứng, lấy thịt, làm cảnh và chọi gà. Trƣớc đây, Ấn Độ đƣợc coi là trung tâm của quá trình thuần hóa gà nhà. Quá trình này diễn ra tại các vùng thung lũng Ấn Độ vào khoảng năm 3200 trƣớc Công nguyên. Tuy nhiên những bằng chứng địa chất gần đây đã chỉ ra rằng quá trình này diễn ra sớm hơn rất nhiều ở đại lục Trung Quốc vào khoảng năm 6000 trƣớc Công nguyên [27], [36]. Gà đƣợc đƣa sang châu Âu vào khoảng thế kỷ XVIII - XIX và nhờ tiến bộ của công tác chọn giống, các giống gà bản địa của châu Á đã đƣợc lai tạo thành những giống cho năng suất cao hơn. Trƣớc đây, phần lớn các tác giả đều cho rằng gà đƣợc đƣa vào châu Mỹ bởi những nhà thám hiểm Tây Ban Nha hoặc Bồ Đào Nha vào khoảng năm 1500 sau Công nguyên. Một giả thuyết khác cho rằng gà đƣợc đƣa trực tiếp từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 màng. Lớp màng ngoài bao trùm, tạo nên ranh giới ngoài của ty thể; lớp màng trong tạo thành các nếp gấp (mào - cristae) hƣớng vào tâm và là nơi khu trú của các enzyme hô hấp. Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang chứa chất nền nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng. Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của ty thể Ty thể là bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ vai trò trung tâm trong việc sản sinh năng lƣợng, trao đổi amino acid, trao đổi chất béo, trao đổi steroid và chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis) [30], [40]. Nhờ chứa chuỗi truyền điện tử, các enzyme của chu trình Krebs và phosphoryl hóa, ty thể thực hiện quá trình oxy hóa các carbohydrate, các acid béo, các amino acid… giải phóng ra năng lƣợng dƣới dạng các liên kết phosphate cao năng trong phân tử ATP. Đây là dạng năng lƣợng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế bào. Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỉ lệ từ 1 - 5% DNA của tế bào. Kích thƣớc của hệ gen ty thể (mtDNA) ở phần lớn động vật có xƣơng sống vào khoảng 16,8 kb, tuy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Đáng chú ý là trật tự sắp xếp của các gen trong phân tử DNA dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này đƣợc thể hiện rõ khi so sánh trình tự genome ty thể các taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu phân loại đối với các taxon bậc cao [43]. Một số gen mã hóa protein hoặc tRNA có khung đọc nằm gối lên nhau một phần (overlapping gene). Ngoài các đặc điểm trên, hệ gen ty thể gà có một số đặc điểm đáng chú ý, khác biệt với lớp thú và lƣỡng cƣ [22]: - Thứ nhất, theo chiều 5’ - 3’ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 đến vùng D-loop là các gen Cyt b, tRNA Thr , tRNA Pro , ND6 và tRNA Glu, trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần hơn với vùng điều khiển. Trật tự này đƣợc bảo toàn trong các loài thuộc bộ gà (Galliformes). - Thứ hai, một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tƣơng đƣơng với trình tự nằm giữa hai gen tRNACys và tRNAAsn đều có ở tất cả động vật có xƣơng sống đã đƣợc giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà không có đặc điểm này. - Thứ ba, gen COI (cytochrome oxydase I) có mã khởi đầu là GTG thay vì ATG. Sơ đồ chi tiết của hệ gen ty thể gà đƣợc trình bày ở hình 1.2. Hình 1.2. Sơ đồ mtDNA gà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Các tRNA đƣợc tạo thành nhờ ngắt quãng các trình tự dài hơn của rRNA và mRNA, sau đó chúng đƣợc cuộn xoắn trong các bản phiên mã và đƣợc phân cắt. Các mRNA và rRNA tự do đƣợc polyadenyl hóa sau phiên mã và tRNA đƣợc biến đổi thêm CCA vào đầu cuối 3' [21], [58]. 1.3.2. Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền Phân loại học cổ điển trên các đối tƣợng thuộc bộ Gà chủ yếu dựa vào các đặc điểm bộ lông bên ngoài của con trống, đó là những đặc điểm sinh dục thứ cấp. Những đặc điểm này mang một tiềm năng biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ nên không đƣợc coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loại ở các loài. Khi đó, mtDNA và đặc biệt là vùng D-loop với những ƣu điểm nổi bật đã đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu. Thuật ngữ D-loop đƣợc dùng để chỉ một vùng có chức năng điều khiển nằm trong mtDNA. Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong DNA ty thể và cũng là vùng liên quan đến sự mở đầu tái bản của mtDNA. Ở gà nhà, vùng này có kích thƣớc 1227 bp [26], nó chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Về mặt cấu trúc, D-loop của gia cầm có thể đƣợc chia thành ba vùng chính là vùng ngoại biên I và III có khả năng biến đổi cao và vùng II là vùng trung tâm ít biến đổi [55]. Vùng I nằm ở đầu 5' vùng điều khiển, kích thƣớc khoảng 400 bp, vùng này chứa chuỗi cytosine (C-stretch), đó là một chuỗi trình tự gồm toàn nucleotide cytosine; chuỗi C là đặc điểm đặc trƣng cho đầu 5' của vùng điều khiển hệ gen ty thể của nhiều họ trong lớp Chim. Vùng I còn chứa trình tự kết thúc quá trình tái bản hệ gen ty thể (TAS) là hộp TATAT hoặc TACAT. Vùng II bảo thủ nhất có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 này. Ở Nhật Bản có 3 giống gà Naganakidori rất đặc biệt đƣợc nuôi để phát triển tiếng gáy dài khác thƣờng tới trên 15 giây. Nhằm làm sáng tỏ quá trình thuần hóa và nguồn gốc phát sinh của chúng, năm 2004, vùng D-loop ty thể gà Naganakidori đã đƣợc giải trình tự. Các mẫu máu của 9 con gà có tiếng gáy dài và 74 con gà từ 11 giống gà địa phƣơng đã đƣợc thu thập. Dữ liệu về trình tự DNA của 2 loài gà rừng cũng đã đƣợc thu thập từ GenBank. Tiếp theo, cây chủng loại phát sinh đã đƣợc thiết lập, kết quả cho thấy cả 3 giống gà Naganakidori đều có tổ tiên chung từ gà chọi Shamo bất chấp việc chúng có nhiều đặc điểm khác nhau rõ rệt và thú vui nuôi gà có tiếng gáy dài có thể đã đƣợc đến trƣớc bởi thú chơi gà chọi. Hơn nữa, những chủng gà này lần đầu tiên tách biệt khỏi gà chọi ở đảo Okinawa, nơi có vị trí gần với miền Nam Trung Quốc và Đông Dƣơng hơn so với lục địa Nhật Bản (Honshu/ Kyushu). Điều này cho thấy rằng có thể tổ tiên của những con gà có tiếng gáy dài lần đầu tiên đƣợc mang vào lục địa Nhật Bản qua đảo Okinawa là những con gà chọi từ các khu vực xung quanh ở miền Nam Trung Quốc hoặc Đông Dƣơng [36]. Năm 2005, Nishibori và đtg (Nhật Bản) [48] đã xây dựng cây chủng loại phát sinh của các loài gà thuộc chi Gallus dựa trên phân tích trình tự D-loop ty thể và dùng nó để chứng minh cho giả thuyết rằng gà rừng đỏ (Red junglefowl - RJF) là tổ tiên trực tiếp của gà nhà. Vị trí chủng loại phát sinh của gà nhà và các loài gà khác thuộc chi Gallus là rất quan trọng khi có ý định gìn giữ và cải tiến các giống gà bằng chuyển gen từ hệ gen của các chủng hoang dã. Các phân tích chủng loại phát sinh dựa trên trình tự mtDNA đã khám phá ra rằng hai chủng gà rừng xám (GJF) là cùng một nhánh với gà rừng đỏ (RJF) và gà nhà và chỉ có một chủng gà rừng xám nằm ở vị trí xa hơn cùng với gà rừng Cyelon (CJF). Quá trình thuần hóa của gà đƣợc tin rằng đã diễn ra ở Nam Á, đặc biệt là châu thổ Ấn Độ. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu trƣớc đó lại không bao gồm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hệ gen ty thể gà nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, phần lớn mang tính cá thể và không đặc trƣng cho quần thể. Mục đích chủ yếu của các nghiên cứu này là tìm hiểu đa hình trình tự nucleotide ở một vài cá thể. Năm 1997, trình tự 641 nucleotide đầu tiên của vùng D-loop 3 mẫu gà Việt Nam (1 mẫu gà nhà và 2 mẫu gà rừng đỏ phân loài G. g. gallus) đã đƣợc Miyake (Nhật Bản) xác định [44]. Đây là tác giả nƣớc ngoài đầu tiên tiến hành nghiên cứu đa hình trình tự vùng D-loop trên đối tƣợng gà Việt Nam, các trình tự này sau đó đƣợc đăng ký trên GenBank với các mã số là AB009435 (G. gallus domesticus), AB009434 (G. gallus gallus) và AB009449 (G. gallus gallus). Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và đtg [9] đã nghiên cứu về sự khác biệt ở ba loài thuộc giống gà Lôi: gà Lôi lam đuôi trắng Hà Tĩnh (Lophura hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi lông tía (L. diardi). Tác giả đã chỉ ra sự thay đổi nucleotide trên vùng D-loop ty thể của chúng dựa trên vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn SmaI và EcoRI. Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và đtg [4] sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 đã nhân đƣợc đoạn D-loop có kích thƣớc 1,3 kb từ DNA genome của 2 mẫu gà Lôi lam đuôi trắng (Lophura hatinhensis) và gà Lôi lam mào trắng (Lophura edwardsi), sau đó gắn thành công vùng D-loop ty thể của 2 cá thể này vào vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc tiến hành phân tích trình tự nucleotide vùng D-loop để nhằm so sánh quan hệ di truyền giữa 2 loài. Năm 2007, Lê Đức Long và đtg [7] đã giải trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 3 cá thể gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch, qua đó đã xác định đƣợc 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và đtg [12] đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của 2 mẫu gà Ri và gà Mông, phát hiện đƣợc 16 điểm đa hình/ đột biến về nucleotide khi so sánh với trình tự gà White Leghorn gốc Nhật Bản mang mã số AB114078 trên GenBank. Năm 2008, Nguyễn Đăng Tôn và đtg [47] đã xác định trình tự 300 nucleotide từ vị trí 131 đến vị trí 430 của 80 mẫu thuộc 4 giống gà Ri, Tre, Chọi và Tàu Vàng (mỗi giống 20 mẫu), qua đó xác định đƣợc 21 vị trí đa hình nucleotide. Năm 2009, Berthouly và đtg [16] đã sử dụng 30 marker vi vệ tinh trên 1082 mẫu gà để nghiên cứu về cấu trúc di truyền của quần thể gà H’mong thuộc tỉnh Hà Giang và đƣa ra bằng chứng di truyền về hiện tƣợng tạp giao của nhóm gà này với gà rừng G. gallus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển D-loop của 71 mẫu cá thể gà địa phƣơng Việt Nam thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre (các cá thể này không bao gồm 40 cá thể gà Ri và gà Tre đã sử dụng trong nghiên cứu của Nguyễn Đăng Tôn và đtg), sau đó sản phẩm PCR sẽ đƣợc dùng để giải trình tự tự động. Các số liệu đa hình thu đƣợc về vùng điều khiển D-loop của 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre sẽ đƣợc so sánh với trình tự chuẩn AP003580 đã đƣợc công bố trên GenBank, từ đó phân loại các mẫu này vào các kiểu đơn bội khác nhau. Đại học Thái Nguyên 23 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc nhập khẩu từ các hãng Fermentas, Sigma Aldrich, Promega… Các hóa chất này gồm có: - Bộ hóa chất dùng cho PCR: đệm, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase… của hãng Fermentas. - Cặp mồi H1255 và L16725 đƣợc đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen. + H1255: 5’- CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC -3’ + L16725: 5’- AGG ACT ACG GCT TGA AAG C -3’ - Hóa chất chạy điện di: + Agaro