Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện virus pmwav-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá (mealybug wilt) trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rt-pcr

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHÚ DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh 09/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Ts. TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN PHÚ DŨNG Cn. LƯU PHÚC LỢI Thành Phố Hồ Chí Minh - 09 / 2005 - 3 LỜI CẢM TẠ Z Y Để hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nay tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: ™ Cha và Mẹ đã sinh thành, dạy dỗ con đạt được ngày hôm nay. ™ Ts. Trần Thị Dung đã hết lòng hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất đề tài. ™ Thầy Lưu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, góp ý và động viên trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp. ™ Các Thầy – Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. ™ Các anh chị thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. ™ Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã cùng tôi chia sẻ vui buồn, thành công và thất bại trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005 Nguyễn Phú Dũng 4 TÓM TẮT Đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏ đầu lá trên chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" được thực hiện tại phòng thí nghiệm CNSH – Trung tâm phân tích thí nghiệm – trường Đại học Nông Lâm TPHCM từ ngày 15/3/2005 đến ngày 15/8/2005. Đề tài được thực hiện bởi sinh viên Nguyễn Phú Dũng thuộc lớp CNSH khóa 27 dưới sự hướng dẫn của Ts. Trần Thị Dung - trưởng Bộ môn CNSH. Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne. Bệnh đang hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới, gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người trồng vì chưa có thuốc phòng trị đặc hiệu. Mục đích của đề tài là xây dựng quy trình phát hiện PMWaV-1 trên chồi giống dứa Cayenne bằng cách khuếch đại đoạn gen HSP 70 của virus với phương pháp RT-PCR. Nội dung nghiên cứu bao gồm: ¾ Thu thập chồi giống dứa Cayenne. ¾ Thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1. ¾ Áp dụng quy trình vừa xây dựng, giám định PMWaV-1 trên 90 chồi dứa Cayenne thuộc 3 giống: Thái Lan, Trung Quốc và Lâm Đồng. Các kết quả thu được: ¾ Ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa. ¾ Xây dựng được quy trình RT-PCR phát hiện PMWaV-1 qua việc xác định được các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer và số chu kỳ tối ưu cho phản ứng. ¾ Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự cho thấy nằm đúng vùng gene HSP 70 cần nhân bản và hoàn toàn đặc hiệu cho PMWaV-1. Như vậy, quy trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy trong việc phát hiện PMWaV-1 ¾ Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 trên cả 3 giống dứa Cayenne được giám định đều rất cao, giống Thái Lan: 53,3%, giống Trung Quốc: 46,7% và giống Lâm Đồng: 46,7%. Kết quả này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏ đầu lá đang đe dọa người trồng dứa và đòi hỏi cấp thiết một phương pháp phòng trừ bệnh hiệu quả. 5 MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ.................................................................................................................. iii Tóm tắt .......................................................................................................................iv Mục lục........................................................................................................................v Danh sách các chữ viết tắt.........................................................................................vii Danh sách các bảng................................................................................................. viii Danh sách các hình.....................................................................................................ix Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................1 1.2 Mục đích ..........................................................................................................2 1.3 Yêu cầu ............................................................................................................2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung của cây dứa. ..........................................................................3 2.2 Phân loại...........................................................................................................4 2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam......................7 2.4 Bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa ......................................................................9 2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam. .......13 2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV...........................................................15 2.7 Gene HSP 70 của PMWaV-1.........................................................................16 2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)..........................................17 2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR.....................................................17 2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR .......................................19 2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer).............................................................19 2.8.2.2 Mg2+ .........................................................................................................................................19 2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).............................19 2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) ......................................................................20 2.8.2.5 Taq – polymerase .......................................................................20 2.8.2.6 Số chu kỳ của phản ứng PCR.....................................................21 2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR)...................................21 2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA. (Sequencing)...................................................24 6 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu. ......................................................................................25 3.1.1 Mẫu .......................................................................................................25 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................25 3.1.3 Hóa chất ................................................................................................26 3.1.3.1 Hoá chất dùng cho tách chiết RNA .............................................26 3.1.3.2 Hoá chất dùng cho phản ứng RT-PCR........................................26 3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA .................................................27 3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA .................................................28 3.2 Phương pháp nghiên cứu...............................................................................28 3.2.1 Tách chiết RNA ....................................................................................28 3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA.............................................................29 3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR ................................................................30 3.2.3.1 Khảo sát độ đặc hiệu của primer .................................................30 3.2.3.2 Xác định chu kỳ nhiệt tối ưu .......................................................30 3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp.............................................31 3.2.3.4 Xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR......................31 3.2.4 Điện di sản phẩm RT-PCR ...................................................................31 3.2.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR............................................................32 3.2.6 Giám định chồi giống dứa.....................................................................32 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ly trích RNA.....................................................................................33 4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR............................................................34 4.2.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của primer ..............................................34 4.2.2 Kết quả xác định chu kỳ nhiệt tối ưu ....................................................36 4.2.2 Kết quả xác định nồng độ primer thích hợp..........................................38 4.2.3 Kết quả xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR. .................39 4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự ..........42 4.4 Kết quả giám định chồi giống dứa ................................................................46 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận. ........................................................................................................49 5.2 Đề nghị ..........................................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................50 PHỤ LỤC..................................................................................................................53 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : base pair cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphophate ddNTP : Dideoxyribonucleotide triphophate DNA : Deoxyribo nucleic acid ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HSP 70 : Heat shock protein 70 mRNA : messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information Nu : Nucleotide PCR : Polymerase Chain Reaction PCV : Pineapple Closterovirus PMWaV-1 : Pineapple mealybug wilt associated virus – 1 RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TBIA : Tissue Blotting Immuno Assay Taq-polymerase : Thermos aquaticus - polymerase Tm : Melting temperature 8 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát............30 Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226 ...............................34 Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất ................35 Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226.........................36 Bảng 4.4: Trình tự của sản phẩm RT-PCR ...................................................42 Bảng 4.5: Kết quả so sánh trình tự của sản phẩm RT-PCR ..........................44 Bảng 4.6: Kết quả phân tích BLAST của 2 trình tự D1, D2..........................46 Bảng 4.7: Tổng kết giám định PMWaV-1 trên chồi dứa...............................47 9 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Cây dứa ................................................................................................ 3 Hình 2.2: Dứa Cayenne........................................................................................ 7 Hình 2.3: Cây dứa Cayenne bị héo đỏ đầu lá .................................................... 10 Hình 2.4: Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá ...................................................... 10 Hình 2.5: Rệp xám (Dysmicoccus neobrevipes), rệp hồng (Dysmicoccus brevipes) và vị trí thường gặp của chúng trên cây dứa ....................... 11 Hình 2.6: Sự cộng sinh của kiến đầu to (Pheidole megacephala) với rệp sáp .. 12 Hình 2.7: Phản ứng PCR.................................................................................... 18 Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 22 Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm...................................... 25 Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226 ......................................... 27 Hình 3.3: Thang DNA........................................................................................ 28 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm ly trích RNA............................................. 33 Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR của 5 chu trình nhiệt........................................... 37 Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp....................................... 39 Hình 4.4: Kết quả khảo sát số chu kỳ RT-PCR thích hợp ................................. 40 Hình 4.5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1................................. 41 Hình 4.6: Kết quả giám định PMWaV-1 trên 10 mẫu chồi dứa Thái Lan......... 47 10 Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng trên thế giới. Ngoài giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin cao, cây dứa còn được xem là hoàng hậu của các loại quả vì có hương vị thơm ngon và rất hợp khẩu vị của người phương Tây. Bên cạnh đó, dứa còn được dùng làm nguyên liệu cho rất nhiều sản phẩm chế biến: dứa hộp, dứa khoanh, nước dứa cô đặc, điều chế bromelin... nên hiện nay, dứa đang được xem là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Về mặt trồng trọt, cây dứa vốn không kén đất, các vùng gò, đồi, đất xấu, nghèo dinh dưỡng... đều có thể trồng dứa. Vì vậy ở nước ta, từ những vùng đồi khô hạn đến các vùng chịu nhiều thiên tai, gió bão, nắng nóng, từ vùng trung du bán sơn địa ở miền Bắc đến những vùng đất nhiễm phèn, chua, mặn ở miền Nam đâu đâu cũng trồng được dứa. Chính vì vừa là một loại cây công nghiệp có giá trị cao, vừa thích hợp phát triển qui mô ở những vùng đất xấu, kén cây trồng nên có thể nói, đối với nước ta cây dứa chứa đựng một tiềm năng kinh tế - xã hội rất lớn. Trong các giống dứa chính, cây dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm phù hợp với công nghệ chế biến đồ hộp (quả lớn, mắt cạn, cùi nhỏ) nên đang được trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, dứa Cayenne chiếm 80% diện tích trồng dứa trên toàn thế cầu. Ở nước ta, do trước đây dứa Cayenne ít được trồng phổ biến nên từ năm 1998 đến nay, Chính phủ và các địa phương đã đầu tư nhiều tỷ đồng để nhập chồi dứa Cayenne từ Trung Quốc, Thái Lan... nhằm tăng diện tích trồng dứa, mở rộng các vùng dứa nguyên liệu cho chế biến trong nước. Ở miền Nam, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang nằm trong chương trình cung cấp giống cây, con chất lượng cao của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, cây dứa Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá hoại, đặc biệt là khả năng nhiễm bệnh wilt - bệnh héo đỏ đầu lá rất cao. 11 Bệnh héo đỏ đầu lá là một bệnh rất nghiêm trọng và phổ biến ở các vùng trồng dứa nói chung, đặc biệt gây hậu quả nặng nề đối với dứa Cayenne nói riêng. Theo những nghiên cứu gần đây, bệnh do 1 loại virus thuộc họ Closterovirus được gọi là Pineapple Mealybug Wilt associated Virus (PMWaV) gây ra. Tuy tác nhân lây truyền của virus này là rệp sáp (mealybug) nhưng mầm bệnh vẫn có thể truyền sang đời sau qua chồi giống. Hiện nay, các phương pháp thông thường không thể xác định được chồi giống mang mầm bệnh mà chỉ khi trồng đến giai đoạn sắp thu hoạch, cây mới phát bệnh, gây thiệt hại rất lớn cho người trồng. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏ đầu lá trên chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" nhằm xây dựng một phương pháp hữu hiệu để kiểm tra virus PMWaV gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa, đồng thời là cơ sở cho những nghiên cứu kế tiếp hướng tới mục tiêu cung cấp chồi giống dứa sạch bệnh cho việc và phát triển các vùng dứa Cayenne. 1.2 Mục đích Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR. 1.3 Yêu cầu - Tách chiết RNA tổng số từ mẫu dứa. - Khảo sát các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer, số chu kỳ thích hợp để thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1. - Giải trình tự đoạn khuếch đại để kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm. - Giám định PMWaV-1 trên chồi dứa các giống Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng 12 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung của cây dứa Cây dứa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, được tìm thấy lần đầu tiên bởi Christopher Columbus khi ông cùng các thủy thủ đặt chân lên đảo Guadeloupe năm 1943. Ở cuối thế kỷ 16, cây dứa được du nhập vào châu Á và đến cuối thế kỷ 17, nó đã được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới trên thế giới. Ở Việt Nam, cây dứa đã được du nhập và trồng từ hơn 130 năm trước. Dứa được trồng nhiều ở các tỉnh phía Nam (75,43% tổng diện tích dứa cả nước), trong đó các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm 69,36% diện tích dứa cả nước (Đường Hồng Dật, 2003) Cây dứa có lá hình ống máng, có gai, chiều dài lá tương đối đồng đều, phân bố đều, xòe ra tứ phía hình hoa thị. Do có nguồn gốc là cây khí sinh nên hệ rễ dứa cắm xuống đất khá cạn và yếu. Trên thân ở nách lá có một số chồi. Chồi dứa cũng như thân chính có nhiều rễ khí sinh sẽ bật thành rễ ngầm khi tiếp xúc với đất, do đó người ta dùng chồi dứa để nhân giống, không dùng hạt. Quả dứa phức hợp hình chóp cụt, giữa có lõi (thực chất là phần nối tiếp của thân chính), trên đầu quả còn có chồi gồm nhiều lá ngắn (gọi là chồi ngọn) cũng được dùng để nhân giống. Hình 2.1: Cây dứa 13 Dứa là cây thân thảo lâu năm. Sau khi thu hoạch trái thứ nhất, các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho một trái. Nhiều thế hệ sinh trưởng có thể tiếp nối nhau như vậy, nhưng trong thực tế đối với nhiều giống dứa, thu hoạch hai hay ba lứa thường không có lợi lắm do cây thoái hóa, trái nhỏ dần và không đồng đều. Dứa sinh trưởng và ra hoa tốt ở 20 – 30oC, lượng mưa hàng năm khoảng 1000 - 2000 mm nên rất thích hợp với điều kiện khí hậu của nước ta với nhiệt độ bình quân là 22oC và lượng mưa bình quân 1300 - 1500 mm/năm. Về thổ nhưỡng, dứa thích hợp với đất đồi, đất badan, thậm chí đất xấu. Đặc biệt với đất phèn, không thể trồng lúa, trồng hoa màu nhưng trồng dứa lại rất tốt. Dứa có khả năng chống xói mòn, giữ màu cho đất nếu trồng với mật độ hợp lý (45.000 - 65.000 cây/ha). Cây dứa lại bảo đảm cho thu hoạch chắc chắn vì dứa không có hiện tượng ra hoa khó, rụng đài như nhiều loại cây ăn quả khác nên năng suất ổn định, không có hiện tượng mất mùa. Như vậy, ngoài vùng đồng bằng chúng ta có thể trồng dứa trên toàn bộ vùng đất đồi có độ dốc dưới 20 độ với khoảng 8.700 ha ở miền Bắc, hơn 10.000 ha ở miền Trung, Tây Nguyên và hàng ngàn hecta đất phèn ở Nam Bộ. 2.2 Phân loại Dứa có tên khoa học là Ananas comosus thuộc: Chi: Ananas Merr Họ: Bromeliaceae Bộ: Farinosae Theo Trần Thế Tục (2001), các giống dứa đang được trồng hiện nay được chia thành 3 nhóm chính: dứa Cayenne, dứa Queen và dứa Spanish. * Nhóm dứa Cayenne Lá dài và dày, không gai hoặc có ít ở đầu chóp lá. Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước, vỏ mỏng nên dễ dập, cây đẻ yếu, xử lý ra hoa khó và dễ nhiễm bệnh. 14 Tuy nhiên, quả to (nặng bình quân 1,5 - 2,0 kg) có dạng hình trụ, mắt rất nông nên rất phù hợp cho việc chế biến đồ hộp. Thịt vàng nhạt, có vị chua. * Nhóm dứa Queen Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Quả có nhiều mắt, mắt nhỏ và lồi cứng, do đó ít hư hỏng khi vận chuyển xa. Thịt quả vàng, ít nước và có vị thơm hấp dẫn. Cây có hệ số nhân giống cao nhưng có khuyết điểm là quả nhỏ, dạng hơi bầu dục nên khó xử