Phương pháp nghiên cứu các các dòng tế bào ung thư

Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 20 Chương 2 Vật liệu – Phương pháp 2.1. Vật liệu 2.1.1. Các dòng tế bào ung thư sử dụng trong đề tài - DLD-1 (ATCC CCL-221): Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột DLD-1 do D.L. Dexter và cộng sự thiết lập vào những năm 1977-1979 từ những khối u ruột kết ác tính của người. Tế bào DLD-1 có hình dạng biểu mô, khi được nuôi cấy in vitro sẽ bám vào bề mặt nuôi cấy và phát triển thành những lớp đơn. - HL-60 (ATCC CCL-240): Dòng tế bào ung thư máu HL-60 được phân lập vào năm 1979 bởi S.J. Collins và cộng sự từ những bạch cầu ngoại vi của một bệnh DLD-1 HL-60 Hình 2.1. Dòng tế bào ung thư ruột DLD-1 và ung thư máu HL-60 (200X) Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 21 nhân nữ mắc bệnh bạch cầu dòng tủy ác tính. HL-60 là những tế bào tròn, không bám; tăng trưởng và phát triển ở dạng huyền phù, lơ lửng trong môi trường nuôi cấy. Dòng tế bào HL-60 sử dụng trong luận văn do TS. Christine Bonnesen (Novo Nordisk, Đan Mạch) gửi tặng. 2.1.2. Hóa chất Môi trường nuôi cấy tế bào McCoy’s 5A, RPMI 1640 chứa glutamax I (dạng ổn định của L-glutamine), dung dịch đệm phosphate (PBS), trypsin, gentamicin do Gibco BRL (InVitrogen, Đan Mạch) cung cấp. Huyết thanh bào thai bò (FBS) do Seromed (Biochrom KB, Berlin, Đức) cung cấp. Nonidet P-40 do Roche Diagnostic cung cấp. RV, dimethylsulfoxide (DMSO), sodium deoxycholate, PMSF, aprotinin, sodium orthovanadate, fibronectin, bovine serum albumin (BSA) and trypan blue do Sigma cung cấp. Thuốc nhuộm calcein AM, DAPI, rhodamine-phalloidin do Molecular Probes (InVitrogen, Đan Mạch) cung cấp. Glycine, NaCl, Tris, và methanol do Merck cung cấp. Kháng thể đơn dòng kháng protein FAK và protein FAK được phosphoryl hóa ở vị trí Tyr-397 do BD Transduction Laboratories và Biosource cung cấp. Kháng thể đa dòng kháng IgG của thỏ và IgG của chuột do DakoCytomation cung cấp. Cơ chất Supersignal West Femto do Pierce Biotechnology cung cấp. RV được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 600 mM và trữ ở -200C. 2.1.3. Một số thiết bị chính - Kính hiển vi soi ngược Leica DMIRB trang bị camera Leica DC 300F (Leica Microsystems, Đức). - Kính hiển vi huỳnh quang soi thẳng Leica DM 5000B trang bị camera Leica DC 480 (Leica Microsystems, Đức). - Máy đếm tế bào Coulter Counter Z2 (Beckman Coulter, Mỹ). Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 22 - Máy đọc ELISA huỳnh quang Synergy HT (Biotek, Mỹ). - Hệ thống gel scanner – densitometer GS-800 (Bio-rad, Mỹ). 2.2. Phương pháp 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào Tế bào HL-60 được nuôi trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS và ủ ở 370C, 5% CO2. Tế bào được cấy chuyền bằng cách pha loãng dịch huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy mới ở mật độ 2 × 105 tế bào/ml. Tế bào DLD-1 được nuôi trong môi trường McCoy’s 5A có bổ sung 10% FBS; 0,1% gentamicin và ủ ở 370C, 5% CO2. Tế bào được cấy chuyền 2-3 lần trong tuần khi đạt độ phủ khoảng 80-90% bề mặt nuôi cấy. 2.2.2. Phương pháp đếm tế bào bằng máy đếm tế bào tự động Phương pháp này được sử dụng để xác định ảnh hưởng của RV lên sự tăng sinh của tế bào HL-60. Trong buồng đếm của máy, dung dịch điện phân yếu chứa tế bào được cho đi qua một lỗ nhỏ . Một dòng điện chạy qua lỗ, và các điện cực được đặt hai phía của lỗ sẽ đo điện trở của dòng điện. Do tế bào không có tính dẫn điện hoặc dẫn điện yếu hơn dung dịch điện phân nên cứ mỗi lần có một tế bào đi qua lỗ nhỏ thì điện trở lại tăng (hoặc độ dẫn điện giảm) và tế bào sẽ được đếm. Phương pháp được thực hiện như sau: - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào HL-60 đạt mật độ 6 x 105 tế bào/ml. - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có chứa RV ở các nồng độ 15, 30, 60, 120, 240 µM hoặc chứa DMSO ở nồng độ 0,2% như là mẫu không xử lý. - Hút 100 µl dịch huyền phù tế bào vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng. - Thêm 100 µl môi trường có chứa RV hoặc DMSO ở các nồng độ đã chuẩn bị vào các giếng. - Ủ đĩa trong tủ nuôi cấy 24 và 48 giờ. Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 23 - Thu nhận dịch huyền phù tế bào trong mỗi giếng. - Hòa dịch huyền phù với dung dịch đếm tế bào. - Đếm tế bào bằng máy Coulter Counter Z2 (Beckman Coulter, Mỹ). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập, ở mỗi lần lặp, mỗi nồng độ thử nghiệm được lặp lại trên 4 giếng. 2.2.3. Thử nghiệm trypan blue Trypan blue là một thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có thể đi xuyên qua màng tế bào chết. Do đó, khi dịch huyền phù tế bào được hòa với trypan blue, những tế bào sống, màng còn nguyên vẹn, không hấp thu thuốc nhuộm nên có kích thước nhỏ, tròn và khúc xạ. Những tế bào chết, màng bị vỡ, sẽ hấp thu thuốc nhuộm nên phồng lên, lớn hơn và có màu xanh đen. Thử nghiệm này được sử dụng xác định ảnh hưởng của RV lên sức sống của tế bào HL-60. Thử nghiệm được thực hiện như sau: - Tế bào HL-60 được xử lý với RV như phương pháp 2.2.2. - Thu nhận dịch huyền phù tế bào trong mỗi giếng. - Nhuộm dịch tế bào với dung dịch trypan blue 0,4% (w/v). - Đếm số tế bào sống và chết trong mỗi mẫu bằng buồng đếm hồng cầu. - Tỷ lệ tế bào sống có trong mẫu được xác định như sau: V: số tế bào sống có trong mẫu D: số tế bào chết có trong mẫu %V: tỷ lệ (%) tế bào sống của mẫu Thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập, ở mỗi lần lặp, mỗi nồng độ thử nghiệm được lặp lại trên 4 giếng. 100%    DV VV Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 24 2.2.4. Thử nghiệm bám trải tế bào (cell spreading assay) Thử nghiệm bám trải xác định tỉ lệ tế bào trong quần thể có kiểu hình mọc trải dài trên bề mặt giá thể sau một thời gian ủ nhất định sử dụng kính hiển vi phản pha và dựa trên một số tiêu chí về hình thái. Trong luận văn này, thử nghiệm được sử dụng để xác định ảnh hưởng của RV lên sự bám trải của tế bào HL-60 và DLD-1. Thử nghiệm bao gồm các bước sau: Phủ fibronectin lên bề mặt nuôi cấy - Chuẩn bị dung dịch cơ chất fibronectin trong PBS ở nồng độ 10 µg/ml. - Thêm vào mỗi giếng nuôi cấy của đĩa 24 giếng 500 µl dung dịch fibronectin. - Ủ qua đêm ở 40C. - Loại bỏ dung dịch fibronectin, thêm 500 µl dung dịch Bovine Serum Albumine (BSA) 1% đã được biến tính bằng nhiệt khoảng 2 giờ ở nhiệt độ phòng vào mỗi giếng để khóa các vị trí không được phủ fibronectin, loại bỏ dung dịch BSA . - Rửa các giếng bằng PBS. Thực hiện thử nghiệm - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy không huyết thanh hoặc có 10% FBS có chứa RV ở các nồng độ 40 và 120 µM hoặc chứa DMSO ở nồng độ 0,2% như là mẫu không xử lý. - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào DLD-1 và HL-60 đạt mật độ 6 x 105 tế bào/ml. - Hút 500 µl dịch huyền phù tế bào vào mỗi giếng. - Thêm 500 µl môi trường có chứa RV hoặc DMSO ở các nồng độ đã chuẩn bị vào các giếng. - Ủ đĩa trong tủ nuôi cấy 3 giờ. Phân tích kết quả - Sau 3 giờ ủ, tế bào ở mỗi giếng được chụp hình dưới kính hiển vi soi ngược phản pha DMIRB trang bị camera DC 300F (Leica) ở độ phóng đại 10X. Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 25 - Tỉ lệ (%) tế bào bám trải trong mỗi giếng được tính bằng cách đếm số tế bào có hình thái bám trải trong thị trường 100 tế bào được chọn ngẫu nhiên. - Tế bào bám trải có nền tối, biểu hiện hình thái kéo dài, màng tế bào nhô ra. Ngược lại, tế bào chưa bám trải có hình dạng tròn, nền sáng (hình 2.2) [35]. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập, ở mỗi lần lặp, mỗi nồng độ thử nghiệm được lặp lại trên 3 giếng. 2.2.5. Thử nghiệm sự bám dính tế bào (cell attachment assay) Thử nghiệm bám dính tế bào sử dụng chất nhuộm huỳnh quang calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) để xác định tỉ lệ tế bào trong quần thể bám vào giá thể sau một thời gian ủ nhất định. Calcein AM không phát huỳnh quang, nhưng khi thấm vào tế bào, sẽ được phân cắt thành calcein bởi các enzyme esterase nội bào và bắt đầu phát huỳnh quang. Do đó, cường độ huỳnh quang ghi nhận được sẽ tỉ lệ với lượng tế bào được nhuộm với calcein AM. Thử nghiệm này được sử dụng trong luận văn để xác định ảnh hưởng của RV lên sự bám dính của tế bào DLD-1. Thử nghiệm gồm các bước sau: Phủ fibronectin lên bề mặt nuôi cấy Quy trình tương tự như thử nghiệm 2.2.4, tuy nhiên do sử dụng đĩa 96 giếng nên lượng dung dịch fibronectin dùng để phủ là 100 µl/giếng. Tế bào đã bám trải Tế bào chưa bám trải Hình 2.2. Tế bào đã và chưa bám trải Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 26 Thực hiện thử nghiệm - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào đạt mật độ 5 x 105 tế bào/ml. - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy không huyết thanh hoặc có 10% FBS có chứa RV ở nồng độ 120 µM hoặc chứa DMSO ở nồng độ 0,2% như là mẫu không xử lý. - Hút 50 µl dịch huyền phù tế bào vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng. - Thêm 50 µl môi trường có chứa RV hoặc DMSO đã chuẩn bị vào các giếng. - Ủ đĩa trong tủ nuôi cấy 1 và 3 giờ. - Rửa đĩa 4 lần với PBS để loại các tế bào không bám. - Hút 100 µl dung dịch PBS vào mỗi giếng - Thêm 10 µl dung dịch calcein AM nồng độ 5 µM trong PBS vào mỗi giếng. - Ủ đĩa trong tủ nuôi cấy 30 phút. - Đo tín hiệu huỳnh quang bằng máy đọc ELISA huỳnh quang Synergy HT (Biotek, Mỹ) ở bước sóng kích thích và phát ra lần lượt là 494 và 517 nm. * Để phân tích kết quả, cần chuẩn bị mẫu tổng tế bào ban đầu. Mẫu này được thực hiện trên một đĩa riêng biệt như sau: - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào trong PBS đạt mật độ 2,5 x 105 tế bào/ml. - Hút 100 µl dịch huyền phù tế bào vào các giếng. - Thêm 10 µl dung dịch calcein AM nồng độ 5 µM trong PBS vào mỗi giếng. - Ủ đĩa trong tủ nuôi cấy 30 phút. - Đo tín hiệu huỳnh quang. Phân tích kết quả - Tỉ lệ (%) tế bào bám dính trong các mẫu được tính như sau: (C – B)/(T – B) Trong đó: C: tín hiệu huỳnh quang của giếng thử nghiệm B: tín hiệu huỳnh quang của giếng trắng (không có tế bào) T: tín hiệu huỳnh quang của giếng tổng tế bào ban đầu - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập. Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 27 2.2.6. Phương pháp nhuộm huỳnh quang Phương pháp nhuộm huỳnh quang với rhodamine phalloidin và 4',6- diamidino-2-phenylindole (DAPI) được sử dụng để quan sát bộ khung actin và nhân của tế bào. Phalloidin tương tác chuyên biệt với sợi actin của bộ xương tế bào và được liên hợp với rhodamine, một phân tử phát huỳnh quang màu đỏ. DAPI là một thuốc nhuộm phát huỳnh quang màu xanh dương khi được gắn xen vào DNA. Quan sát tế bào được nhuộm với rhodamine phalloidin và DAPI dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ thấy sự phân bố các sợi actin màu đỏ và vùng nhân màu xanh dương trong tế bào. Trong luận văn, phương pháp này được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của RV ở nồng độ 60 µM lên bộ khung actin của tế bào DLD-1. Phương pháp gồm các bước sau: Phủ fibronectin lên bề mặt nuôi cấy - Rửa các lamella với cồn và ủ với NaOH 2 M trong 2 giờ. - Rửa lamelle lại bằng nước cất hai lần và khử trùng bằng cồn 70%. - Đặt các lamell vào dung dịch fibronectin ở nồng độ 10 µg/ml trong 1 giờ. - Rửa lại bằng PBS. Xử lý tế bào với RV - Đặt các lamella đã phủ fibronectin vào đĩa nuôi cấy đường kính 10 cm. - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy không huyết thanh có chứa RV ở nồng độ 120 µM hoặc chứa DMSO ở nồng độ 0,2% như là mẫu không xử lý. - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào DLD-1 đạt mật độ 4 x 105 tế bào/ml. - Hút 5 ml dịch huyền phù tế bào vào các đĩa nuôi cấy. - Thêm 5ml môi trường có chứa RV hoặc DMSO ở nồng độ đã chuẩn bị vào các đĩa. - Ủ các đĩa trong tủ nuôi cấy 3 giờ. Cố định tế bào với paraformaldehyde - Rửa tế bào trên các lamella bằng PBS. Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 28 - Ủ các lamella với dung dịch paraformaldehyde 3,7% trong PBS trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Nhuộm và quan sát tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang - Rửa tế bào trên các lamella bằng PBS. - Đặt 200 µl dung dịch Triton X-100 0,1% lên mỗi lamella và ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để làm thấm màng tế bào. - Rửa lắc với PBS trong 5 phút. - Đặt 200 µl dung dịch DAPI có nồng độ 100 ng/ml trong PBS lên mỗi lamella và ủ trong 20 phút trong tối ở nhiệt độ phòng. - Rửa lắc với PBS trong 5 phút. - Ủ các lamella với dung dịch BSA 1% trong PBS trong 20 phút. - Ủ các lamella với 200 µl dung dịch rhodamine phalloidin chứa 1 unit phalloidin trong PBS trong 20 phút. - Rửa lắc trong 5 phút 2 lần với PBS. - Đặt các lamella lên lame và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang DM 5000B trang bị camera DC 480 (Leica). 2.2.7. Phương pháp Western Blot Phương pháp này được sử dụng để xác định sự biểu hiện của hai protein FAK và FAK[pY397] trong tế bào DLD-1 dưới tác động của RV ở nồng độ 60 µM. Trong phương pháp này, dịch ly giải protein đã được biến tính sẽ được phân tách bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide. Sau đó, những protein này được điện chuyển lên màng lai, và được phát hiện bởi các kháng thể chuyên biệt. Phương pháp được thực hiện như sau: Chuẩn bị các dung dịch cần sử dụng - Dung dịch RadioImmuno Precipitation Assay (RIPA): PBS, NP40 1%, SDS 0,1%, sodium deoxycholate 0,5%, Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF) 100 µg/ml, aprotinin 10 µg/ml, sodium orthovanadate 1 mM. Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 29 - Dung dịch điện di Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE): Tris pH 6,8 25 mM, glycine 190 mM, SDS 0,1%. - Dung dịch nạp mẫu: Tris pH 6,8 0,3125 M, glycerol 25%, Dithiotreitol (DTT) 325 mM, SDS 5%, bromophenol blue 0,015%. - Dung dịch chuyển thẩm: Tris 25 mM, glycine 190 mM, methanol 20%. - Dung dịch rửa màng TBS-T (Tris Buffer Saline – Tween 20) pH 7,6: Tris 50 mM, NaCl 136 mM, Tween 20 0,1%. - Dung dịch rửa màng TBS-T (Tris Buffer Saline – Tween 20) pH 10,0: Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,1%. - Dung dịch khóa màng: TBS-T pH 10,0; Tween 20 1% và bột sữa gầy 5%. Chuẩn bị dịch protein ly giải - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có chứa RV ở nồng độ 120 µM hoặc chứa DMSO ở nồng độ 0,2% như là mẫu không xử lý. - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào DLD-1 đạt mật độ 4 x 105 tế bào/ml. - Hút 5 ml dịch huyền phù tế bào vào các đĩa nuôi cấy đường kính 10 cm. - Thêm 5ml môi trường có chứa RV hoặc DMSO ở các nồng độ đã chuẩn bị vào các đĩa. - Ủ các đĩa trong tủ nuôi cấy 30 phút, 60 phút, 3 giờ và 24 giờ. - Sau thời gian ủ, thu nhận tế bào bám và tế bào nổi trong các mẫu. - Ly giải tế bào bằng dung dịch RIPA. - Ly tâm dịch ly giải 20.000g trong 20 phút ở 40C. - Thu nhận dịch nổi (dịch protein ly giải) và bảo quản thành các phân đoạn nhỏ ở -200C. Định lượng nồng độ protein trong các dịch ly giải thu nhận được Nồng độ protein trong các dịch ly giải thu nhận được định lượng bằng bộ kit DC Protein Assay (Bio-rad, Đan Mạch) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chương 2. Vật liệu – Phương pháp 30 Western blotting with với các kháng thể đơn dòng kháng FAK, FAK [pY397], và -actin (kháng thể kháng -actin được dùng làm chứng cho quy trình Western Blot) - Các dịch ly giải chứa lượng protein bằng nhau được trộn với trong dung dịch nạp mẫu và được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide Ready Tris-HCl 7,5% (Bio-Rad) ở hiệu điện thế 60V trong 30 phút và 100V trong 60 phút sau đó. Thang Kaleidiscope (Bio-Rad) được sử dụng trong quá trình điện di. - Protein sau khi điện di sẽ được điện chuyển lên màng polyvinylidene difluoride (PVDF, Amersham Biosciences) ở hiệu điện thế 100V trong 60 phút. - Ủ màng sau khi điện chuyển bằng dung dịch khóa màng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. - Ủ lắc màng với kháng thể đơn dòng kháng FAK hoặc FAK [pY397], hoặc - actin được pha loãng 1:1000 trong dung dịch TBS-T pH 7,6 chứa 5% BSA qua đêm ở nhiệt độ phòng - Rửa màng trong 10 phút (5 phút đối với kháng thể kháng FAK [pY397]) 3 lần với dung dịch TBS-T pH 7,6. - Ủ lắc màng với kháng thể thứ cấp liên hợp perosidase được pha loãng 1:2000 trong dung dịch TBS-T pH 7,6 chứa 5% bột sữa gầy trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. - Rửa màng trong 10 phút 3 lần với dung dịch TBS-T pH 7,6. - Tín hiệu lai trên màng được phát hiện bằng bộ kít phát hiện tín hiệu hóa quang Supersignal West Femto (Pierce) và được định lượng bằng hệ thống gel scanner – densitometer GS-800 và phần mềm Quantity One (Bio-rad). 2.2.8. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu Số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel. Thử nghiệm Student’s two-tailed t-test được dùng để đánh giá sự khác biệt về mặt thống kê giữa mẫu xử lý và không xử lý ở mức tin cậy 99%.