Sản phẩm DNA li trích

Phần 4 Kết quả và thảo luận šv› 4.1.Sản phẩm DNA li trích Li trích DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Đối với lá cacao, việc li trích gặp một số khó khăn do lá cacao có lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh, bên trong mô lá chứa hàm lượng lớn polysaccharide, polyphenol và các sắc tố khác. (Hoàng Thị Liễu, 2004). Qui trình li trích DNA của chúng tôi đạt hiệu quả vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Vì ở qui trình li trích này, trong dịch trích DNA có chất mercapto có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bước ủ Rnase sẽ phân hủy RNA có trong mẫu li trích, góp phần hạn chế lượng DNA tạp tổng hợp từ RNA trong phản ứng PCR sau này. Đặc biệt sự có mặt của muối sodium acetate có khả năng làm biến tính enzyme phân hủy DNA. Mặt khác, bước sử dụng Chloroform được lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu được rất tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra Kết quả định lượng DNA bằng quang phổ kế cho thấy DNA của các mẫu đem li trích có độ tinh sạch tương đối cao với tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.5 đến 2.2 và lượng DNA có trong mỗi mẫu trung bình khoảng 50ng/µl. Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA Những mẫu có tỉ lệ OD thấp, độ tinh sạch không cao, chúng tôi vẫn có thể chạy PCR đạt kết quả tốt bằng cách xử lý như sau: pha loãng mẫu 2-3 lần, rồi li tâm ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4oC để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ nhàng hút DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR, trong trường hợp này thể tích DNA trong phản ứng PCR được tăng lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl) và giảm thể tích nước đi 2µl. Bước pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bước li tâm tiếp theo sẽ giúp thu được DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống. 4.2.Sản phẩm PCR Qui trình PCR cho kết quả ổn định với cả 5 cặp primer. Tuy nhiên primer mTcCIR11 thường cho những band rất mờ do mức độ khuếch đại thấp hơn các primer khác. Vì vậy khi pha trộn mẫu với primer mTcCIR11 cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi. Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7 Qui trình PCR cho kết quả tương đối ổn định. Những mẫu có nồng độ DNA li trích cao sẽ cho kết quả tốt khi chạy multiplex PCR, cho các band điện di sáng, rõ. Do đó khi thực hiện phản ứng multiplex PCR cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi. Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR 4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao Sản phẩm PCR có thể đưa vào phân tích ngay trên máy giải trình tự DNA mà không cần phải qua bước tinh sạch. Vì kết quả so sánh giữa 2 nghiệm thức tinh sạch và không tinh sạch cho kết quả phân tích như nhau. Do đó sản phẩm PCR không cần phải tinh sạch trước khi phân tích để giảm tốn kém. Ngoài ra để giảm thời gian (1 giờ cho mỗi 16 giếng trên đĩa) và hóa chất phân tích (size standard và hidi formamide), chúng tôi tiến hành trộn 3 sản phẩm PCR riêng biệt (0.5µl/1sản phẩm) với cùng một lượng size standard và hidi formamide như với 1 sản phẩm. Điều này giúp giảm chi phí xuống 3 lần mà vẫn cho kết quả phân tích tốt. Những mẫu có sản phẩm PCR không xuất hiện band nào trên gel điện di hoặc band điện di quá mờ vẫn có thể cho kết quả khi phân tích trên máy giải trình tự DNA bằng cách tăng lượng mẫu PCR lên gấp đôi (1µl thay vì 0.5µl) trong hỗn hợp mang điện di. Trong trường hợp không nhận được kết quả khi phân tích microsatellite (No data), chúng tôi tiến hành hoàn thiện phản ứng bằng cách nâng lượng mẫu trong phản ứng PCR lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl). Do đó chúng tôi thu được kết quả phân tích của tất cả các mẫu với 5 primer. Kết quả phân tích 21 dòng cacao khảo sát với 5 cặp pimer được tóm tắt ở 2 bảng 4.1 và 4.2 với các cặp al đặc trưng sau khi đã loại trừ những allele dropping (xem trang 54). Từ kết quả này, chúng tôi nhận thấy 5 primer sử dụng có thể phân biệt được 21 kiểu gen khác nhau. Với đặc tính đồng trội (codominant), những cặp al khác nhau được gọi là dị hợp (VD: al 235- al 250), còn những cặp al giống nhau được gọi là đồng hợp (VD: al 288- al 288). Dựa vào 2 bảng dữ liệu dưới đây chúng tôi có thể định danh được 21 dòng cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite của chúng cũng như xây dựng được bảng dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao phục vụ cho công tác định danh và phân tích đa dạng di truyền. Bảng 4.1: Dữ liệu microsatellite thu được với 3 primer Thứ tự Tên dòng mTcCIR 8 mTcCIR 11 mTcCIR 15 A1 A2 A1 A2 A1 A2 1 BAL 209 288 290 298 305 252 254 2 BAL 244 292 292 295 314 244 246 3 BR 25 302 305 298 308 235 244 4 KKM 225 286 286 295 298 235 244 5 PBC 123 288 290 295 305 235 250 6 PBC 154 288 305 298 305 232 252 7 PBC 157 288 302 295 305 235 250 8 PBC 159 288 302 298 305 235 244 9 PBC 230 286 288 305 314 235 250 10 PBC 236 290 290 298 305 235 250 11 QH 1213 288 290 295 298 252 254 12 QH 22 288 302 295 298 232 252 13 QH 441 288 288 295 295 232 252 14 CT1 288 288 141 314 248 250 15 CT3 288 290 141 305 244 248 16 CT4 269 269 150 150 242 252 17 CT5 288 294 305 314 244 248 18 CT6 288 288 288 314 252 252 19 CT7 286 294 141 314 248 250 20 CT8 288 288 288 288 248 250 21 CT9 286 286 150 314 248 250 Bảng 4.2: Dữ liệu microsatellite thu được với 2 primer Thứ tự Tên dòng mTcCIR 7 mTcCIR 18 A1 A2 A1 A2 1 BAL 209 155 157 344 346 2 BAL 244 157 157 337 344 3 BR 25 153 155 331 344 4 KKM 225 153 155 331 346 5 PBC 123 155 157 331 342 6 PBC 154 153 157 342 344 7 PBC 157 155 157 331 346 8 PBC 159 155 157 331 346 9 PBC 230 155 157 331 342 10 PBC 236 153 157 342 344 11 QH 1213 153 157 344 346 12 QH 22 153 157 342 344 13 QH 441 157 157 342 344 14 CT1 153 153 335 344 15 CT3 153 157 333 344 16 CT4 153 157 333 335 17 CT5 153 157 333 335 18 CT6 155 157 344 344 19 CT7 153 153 342 342 20 CT8 153 153 342 342 21 CT9 153 153 335 342 Allele dropping Allele dropping là những al chỉ xuất hiện 1 lần trong 3 lần lặp lại thí nghiệm. Đó là những al xuất hiện không ổn định, có thể do nồng độ mẫu quá thấp, hoặc bị tạp nhiễm với 1 kiểu gen khác trong quá trình thí nghiệm, hoặc do việc thêm vào một nucleotid adenosine (A) vào đầu 3’ của đoạn DNA khuếch đại (Smith et al., 1996), hoặc do lỗi phân tích của máy ABI 3100. Những al đó cần được ghi nhận để loại bỏ trong những lần phân tích sau. Trong quá trình thí nghiệm, một số mẫu được lặp lại 2-3 lần với cùng một primer để tìm nồng độ pha loãng thích hợp và để định danh lại mẫu mã hóa. Từ đó, chúng tôi ghi nhận được sự xuất hiện allel dropping của một số dòng như sau: Dòng PBC 159 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 246. Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15:al 244. Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331. Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331. Có 6 mẫu dưới đây chỉ mới lặp lại thí nghiệm 2 lần, do đó cần lặp lại thí nghiệm một lần nữa để khẳng định allele dropping, bao gồm: Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 295. Dòng PBC 123 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244. Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244. Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 298 Dòng BAL 244 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 150. Dòng QH 1213 có 2 allele dropping với primer mTcCIR15: al 235, al 244. Al dropping 246 Hình 4.4: Giống PBC 159 có 1 allele dropping 246 với primer mTcCIR15. 4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa Với dữ liệu microsatellite của 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8 (bảng 3.7), chúng tôi tiến hành định danh bằng cách phân tích mức độ đồng nhất di truyền giữa 13 mẫu mã hóa với 13 dòng cacao tương ứng với chúng bằng phần mềm Cervus dựa trên các chỉ tiêu sau: 3 loci được đưa vào phân tích. Có ít nhất 2 loci có al hoàn toàn giống nhau. Số loci sai khác cho phép là 1. Sự chênh lệch giữa số lượng loci đưa vào phân tích và số loci giống nhau càng cao thì kết quả phân tích mức độ đồng nhất di truyền có độ tin cậy càng cao, hay kết quả định danh sẽ càng chính xác và ngược lại. Còn nếu số loci sai khác càng cao thì độ tin cậy của kết quả càng thấp, việc định danh do vậy cũng không chính xác. Hình 4.5: Các chỉ tiêu để kiểm tra mức độ đồng nhất di truyền Kết quả phân tích cho ra 10 cặp cá thể đồng nhất di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu trên, đồng thời cũng là kết quả nhận diện hay định danh tương ứng với 10 mẫu mã hoá. Kết quả định danh có độ chính xác cao do hoàn toàn không có loci sai khác (mismatching loci bằng 0). Bảng 4.3: Kết quả nhận diện trong phần mềm Cervus **** Parameters **** Number of loci: 3 Minimum number of loci needed for match: 2 Number of mismatching loci allowed: 1 **** Genotype matches **** The following individuals had matching genotypes in the genotype file: ID1 Loci typed ID2 Loci typed Matching loci Mismatching loci BAL209 3 A10 3 3 0 BR25 3 A9 3 3 0 KKM225 3 A5 3 3 0 PBC154 3 A12 3 3 0 PBC157 3 A11 3 3 0 ]PBC159 3 A8 3 3 0 PBC230 3 A13 3 3 0 PBC236 3 A6 3 3 0 QH1213 3 A7 3 3 0 QH22 3 A4 3 3 0 TOTAL: 10 Còn lại ba mẫu mã hóa A2, A3, A14 và 3 dòng cacao là BAL 244, PBC 123 và QH441 chưa được nhận diện. Kết quả phân tích microsatellite cho thấy: Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của mẫu A2 và BAL244 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 loci của primer mTcCIR15: mẫu A2 bị thiếu mất một al 246 (xem phụ lục trang 65 ). Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của mẫu A3 và PBC123 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 al của loci xác định bởi loci của primer mTcCIR15:al 250 là al đặc trưng của mẫu A3, nhưng ở mẫu PBC123 thì al 250 không phải là al đặc trưng mà thay vào đó là al 244 (xem phụ lục trang 66). Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của mẫu A14 và QH441 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 al của loci xác định bởi primer mTcCIR15: al 252 là al đặc trưng của mẫu A14, nhưng ở mẫu QH441 thì al 252 không phải là al đặc trưng mà thay vào đó là al 244 (xem phụ lục trang 77). Sự sai khác ở 1 al như trên là do hiện tượng allele dropping xảy ra trong quá trình phân tích trình tự microsatellite. Tuy có sự sai khác ở 1 al nhưng kết quả phân tích trên đủ để kết luận mẫu A2 mã hóa cho dòng cacao BAL244, mẫu A3 mã hóa cho dòng cacao PBC123, và mẫu A14 mã hóa cho dòng cacao QH441. Bảng 4.4: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa Giống lấy mẫu Mẫu mã hóa Giống nhận diện Đánh giá kết quả BAL 244 PBC 123 QH 22 KKM22 PBC 236 QH 1213 PBC 159 BR 25 BAL 209 PBC 157 PBC 154 PBC 230 QH 441 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 BAL 244 PBC 123 QH 22 KKM225 PBC 236 QH 1213 PBC 159 BR 25 BAL 209 PBC 157 PBC 154 PBC 230 QH 441 Sai khác 1 al Sai khác 1 al Chính xác Chính xác Chính xác Chính xác Chính xác Chính xác Chính xác Chính xác Chính xác Chính xác Sai khác 1 al Việc định danh này không sử dụng sự hỗ trợ của việc nhận diện kiểu hình nhưng trên thực tế việc định danh luôn có sự hỗ trợ bằng cách nhận diện kiểu hình dựa vào kinh nghiệm (như nhận diện qua hình dạng, màu sắc của hoa, quả) nên sẽ đơn giản và thuận tiện hơn. Nhưng lợi thế của phương pháp định danh bằng microsatellite là có thể áp dụng từ giai đoạn cây con còn đang được ươm trong nhà lưới, chưa có hoa hay quả để giúp cho việc nhận diện bằng kiểu hình. Uu điểm của việc định danh từ giai đoạn cây con là giúp loại bỏ kịp thời những cây bị nhầm lẫn giống trước khi đem ra vườn trồng. 4.5. So sánh dữ liệu microsatellite Khi so sánh dữ liệu microsatellite của 3 giống cacao NA33, AMAZ15/15, PA107 tại vườn sưu tập giống cacao, Đại Học Nông Lâm, với dữ liệu tương ứng của chúng trên ngân hàng cacao thế giới ICGD chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt ở ít nhất 2 primer (được trình bày ở 3 bảng 4.4, 4.5 và 4.6). Như vậy 3 giống cacao NA33, AMAZ15/15, PA107 trong bộ sưu tập giống cacao của Đại Học Nông Lâm và Ngân hàng cacao thế giới ICGD không giống nhau, có thể do nguồn gốc lai tạo khác nhau. Tuy nhiên, kết quả này cũng cho thấy phương pháp và kỹ thuật phân tích của chúng tôi đúng với phương pháp phân tích microsatellite của ngân hàng cacao thế giới. Điều này sẽ hỗ trợ cho việc so sánh sự đa dạng di truyền giữa các giống cacao tại Đại Học Nông Lâm với các giống cacao trên thế giới dựa trên dữ liệu về Microsatellite. Bảng 4.5: Dữ liệu microsatellite của giống NA33 NA33- ICGD NA 33 Kết quả thí nghiệm Kết quả trong cơ sở dữ liệu ICGD Primer 8 290 290 289 293 Al đồng hợp Al dị hợp Primer11 295 305 305 305 Al dị hợp Al đồng hợp Primer 18 333 342 333 343 Al dị hợp Al dị hợp Bảng 4.6: Dữ liệu microsatellite của giống AMAZ15/15 AMAZ15/15- ICGD AMAZ15/15 Kết quả thí nghiệm Kết quả trong cơ sở dữ liệu ICGD Primer 8 288 292 289 293 Al dị hợp Al dị hợp Primer15 244 254 245 257 Al dị hợp Al dị hợp Primer 18 333 346 340 340 Al dị hợp Al đồng hợp Bảng 4.7: Dữ liệu microsatellite của giống PA107 PA107-ICGD PA107 Kết quả thí nghiệm Kết quả trong cơ sở dữ liệu ICGD Primer 8 244 244 242 242 Al đồng hợp Al đồng hợp Primer18 337 346 337 347 Al dị hợp Al dị hợp 4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR Một trong các lợi thế của kỹ thuật microsatellite thực hiện trên máy giải trình tự là có thể thực hiện cùng lúc nhiều phản ứng PCR, hoặc cùng lúc điện di nhiều sản phẩm PCR nhưng thiết bị vẫn có thể nhận diện từng sản phẩm. Lợi thế này cho phép sự kết hợp thực hiện cùng lúc nhiều phản ứng PCR hay multiplex PCR để giảm chi phí hóa chất và thời gian thí nghiệm. Phản ứng multiplex PCR được thực hiện với 3 primer có cùng nhiệt độ bắt cặp 46oC và có màu huỳnh quang khác nhau: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15. Kết quả phân tích microsatellite của sản phẩm multiplex PCR giúp phân biệt nhanh chóng những mẫu có kết quả giống nhau ở 1 đến 2 cặp primer. Ví dụ 2 mẫu QH441 và BAL244 có kết quả giống nhau với primer mTcCIR8 nhưng có thể phân biệt chúng dễ dàng vì kết quả của 2 primer còn lại khác nhau. Do đó chỉ cần 1 lần phân tích thay vì 3 lần với 3 primer riêng biệt. Quan trọng nhất là kết quả này có hiệu quả kinh tế cao, vì giúp giảm chi phí cho cả giai đoạn PCR lẫn giai đoạn phân tích microsatellite. Ngoài ra, nếu trộn 3 sản phẩm PCR riêng biệt với 3 primer (có màu huỳnh quang khác nhau) của cùng một mẫu rồi đem phân tích trình tự thì kết quả cũng tương tự như khi thực hiện phản ứng multiplex PCR. Ưu điểm của cách làm này so với multiplex PCR là có thể kết hợp phân tích cùng lúc những primer có nhiệt độ lai khác nhau (trong khi phương pháp multiplex PCR đòi hỏi các primer phải có cùng nhiệt độ lai), nhưng khuyết điểm là chi phí cao hơn phương pháp multiplex PCR vì số phản ứng PCR thực hiện nhiều gấp 3 lần. mTcCIR8 mTcCIR15 mTcCIR11 mTcCIR15 mTcCIR11 mTcCIR8 BAL244 QH441 mTcCIR7 mTcCIR11 mTcCIR15 Hình 4.6:So sánh kết quả của 2 mẫu multiplex PCR giống nhau ở primer mTcCIR8 Hình 4.7:Kết quả phân tích mẫu CT3 bằng phương pháp kết hợp 3 sản phẩm PCR riêng biệt với 3 primer mTcCIR7, mTcCIR15 và mTcCIR11. 4.7. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền Với dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao khảo sát nằm trong 6 quần thể: CT, PBC, BAL, QH, BR và KKM, chúng tôi dùng phần mềm Genetix để xử lý dữ liệu microsatellite của từng cá thể trong quần thể, từ đó mô tả được quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các quần thể, cũng như giữa các cá thể trong quần thể dựa trên khoảng cách giữa chúng trên biểu đồ. Kết quả phân tích như sau: Các quần thể có quan hệ di truyền gần nhau: Quần thể QH và quần thể BAL. Quẩn thể BR, KKM và PBC. Các quần thể có quan hệ di truyền xa nhau: Quần thể BR và quần thể QH. Quần thể BR và quần thể BAL. Quần thể BR và quần thể CT. Quần thể KKM và quần thể QH. Quần thể KKM và quần thể BAL. Quần thể KKM và quần thể CT. Các cá thể phân tích trong quần thể BAL và QH có quan hệ di truyền gần với nhau. Riêng 2 quần thể BR và KKM chỉ có một cá thể đại diện nên không thể nhận xét về mặt cá thể. Quần thể PBC có 6 cá thể, trong đó: 3 cá thể PBC 123, PBC 157 và PBC 236 có quan hệ di truyền rất gần nhau 2 cá thể PBC 159 và PBC 230 có quan hệ di truyền khá gần nhau nhưng khá xa 3 cá thể trên. Cá thể còn lại PBC 154 có quan hệ di truyền xa nhất với các cá thể khác trong quần thể PBC. Quần thể CT có 8 cá thể, trong đó: 5 cá thể CT1, CT5, CT7, CT8, CT9 có quan hệ di truyền rất gần nhau. 3 cá thể CT3, CT4 và CT6 có quan hệ di truyền khá xa với nhau và khá xa với cả 5 cá thể còn lại trong quần thể CT. Riêng cá thể CT6 có quan hệ di truyền khá gần với 2 cá thể PBC 154 và QH 441.