Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất cồn

MỤC LỤC Phần 1:Giới thiệu chung 3 Phần 2: Sơ đồ quy trình 4 Phần 3:Ứng dụng của VSV trong công đoạn đường hóa dịch cháo 6 I-Giới thiệu chung về nấm mốc 6 1-Cấu tạo sợi nấm 7 2-Sinh sản của nấm 7 II-Những loài nấm thường dùng 9 1-Rhizopus 11 2-Mucor 11 3-Aspergillus 12 III- Nuôi cấy mốc đường hóa : các chế phẩm enzym đường hóa 16 IV- Đường hoá tinh bột: 21 1-Tác dụng của enzym amylase lên mạch tinh bột 21 2- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa tinh bột 23 Phần 4:Ứng dụng của VSV trong công đoạn lên men dịch đường 31 A-Nấm men 31 I-Saccharomyces cerevisiae 31 1-Đặc điểm 31 2-Một số chủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng 32 3-Nghiên cứu so sánh khả năng lên men của chủng 12 với chủng MTB và 1 vài chủng khác hiện có ở nước ta. 33 4- Điều kiện lên men 35 5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae 36 II- Cơ chế lên men rượu 40 1- Cơ chế hĩa sinh học của quá trình lên men 41 2- Tiến hành lên men rượu 44 III- Nhận xét, đánh giá các phương pháp lên men 46 IV- Hiệu suất quá trình lên men từ nấm men 48 B-Vi khuẩn 48 I.Giới thiệu chung 48 II.Các vi khuẩn lên men cồn 49 1.Zymomonas mobilis 50 a.Đặc điểm 50 b.Điều kiện phát triển 52 c. Nuơi cấy 53 d- Quá trình lên men 55 e-Hiệu suất quá trình 55 2.Clostridium 57 a.Đặc điểm 57 b.Điều kiện phát triển 58 Phần 5: Hiệu suất và tổn thất trong sản xuất 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHẦN 1: GIỚI THIỆU CHUNG Công nghệ cồn etylic là khoa học về phương pháp và quá trình chế biến các nguyên liệu chứa tinh bột, đường, xenluloza, etylen thành sản phẩm etylic hay etanol. Quy trình công nghệ sản xuất cồn etylic có thể chia thành các công đọan chính gồm : chuẩn bị dịch đường lên men; gây men giống, lên men dịch đường và xử lý dịch lên men. Chuẩn bị dịch lên men: Nếu nguyên liệu chứa tinh bột thì công đọan này gồm nghiền, nấu, đường hóa và làm lạnh đến nhiệt độ lên men. Nếu nguyên liệu là mật rỉ thì chuẩn bị dịch lên men gồm pha lõang sơ bộ, xử lý mật rỉ, bổ sung nguồn dinh dưỡng, tách cặn rồi pha loãng tới nồng độ gây men và lên men Gây men giống và lên men: muốn lên men trước hết cần phát triển men giống tới chất lượng và số lượng cần thiết, thường bằng 10% thể tích của thùng lên men. Sau đó đưa men giống và dịch đường vào thùng rồi khống chế ở điều kiện xác định để nâùm men chuyển hóa đường thành rượu và CO2. Dịch nhận được sau lên men gọi là giấm chín. Xử lý dịch lên men: công đoạn này có liên quan tới kiến thức lý học và chuyển khối. Thực chất là dùng hệ thống chưng luyện phù hợp để tách rượu và các chất dễ bay hơi khỏi giấm chín, sau đó đem tinh luyện để nhận được cồn sản phẩm, thỏa mãn tiêu chuẩn và yêu cầu tiêu dùng. Sản phẩm thu được sau xử lý bao gồm cồn thực phẩm, cồn đầu, dầu fusel hoặc ancol cao phân tử. Ngoài các sản phẩm kể trên, chúng ta còn thu được bã rượu có chứa nhiều chất hữu ích, có thể dùng làm môi trường nuôi cấy và thu nhận nấm men thô dùng cho chăn nuôi, chế biến các lọai kháng sinh… Ở một số nước, người ta đem cô đặc bã rượu tới nồng độ chất khô nhất định và bổ sung trực tiếp vào khẩu phần ăn của vật nuôi. Trong bã rượu từ rỉ đường còn có thể thu nhận glyxerin, axít glutamic. Trong những năm gần đây bã rượu từ mật rỉ còn được nghiên cứu và đưa vào phụ gia của vật liệu xây dựng. Ơû nước ta việc sử dụng bã rượu chưa được nghiên cứu áp dụng nên còn lãng phí nhiều. Phần lớn bị bỏ đi , chỉ phần rất ít được sử dụng vào mục đích chăn nuôi. PHẦN 2: SƠ ĐỒ QUY TRÌNH Tinh bột Xử lý nguyên liệu Quá trình dịch hĩa Đường hĩa Lên men rượu Chưng cất Tinh chế Mật rỉ Xử lý nguyên liệu Nguyên liệu Nấm men Chuẩn bị dịch lên men Lên men rượu Tinh chế O2 Chế phẩm amylase của nấm mốc Nấm men Chưng cất Cồn tinh luyện PHẦN 3: ỨNG DỤNG CỦA VSV TRONG CÔNG ĐOẠN ĐƯỜNG HÓA DỊCH CHÁO Nấu xong, tinh bột trong dịch cháo đã chuyển sang trạng thái hịa tan nhưng chưa thể lên men trực tiếp để biến thành rượu được, mà phải trải qua quá trình thủy phân do xúc tác của amylase để biến thành đường. Quá trình trên được gọi là quá trình đường hĩa, cĩ vai trị rất quan trọng trong cơng nghệ sản xuất cồn ethylic. Nĩ quyết định phần lớn hiệu suất thu hồi rượu do giảm bớt hoặc gia tăng đường và tinh bột sĩt lại sau khi lên men. Muốn đạt hiệu quả cao trong quá trình thủy phân tinh bột thì phải chọn được tác nhân đường hĩa tốt nhất. Hiện nay, người ta dùng amylase nhận được từ nuơi cấy vi sinh vật, trong đĩ nấm mốc được sử dụng nhiều nhất, sau đĩ đến vi khuẩn, cuối cùng là nấm men Endomycopsip. Các yếu tố cần chú ý khi nuơi cấy vi sinh vật là chọn giống, mơi trường nuơi cấy, điều kiện nuơi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy). I-GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MỐC Nấm mốc (mold) là tên chung để chỉ các lọai nấm hiển vi có cấu tạo sợi. Chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng, có bào tử, không có diệp lục tố, không có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí carbonic mà sử dụng trực tiếp chất hữu cơ có sẵn để sinh sống. Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì vậy chúng thường phát triển trên lớp bề mặt của cơ chất, dưới dạng những lớp lún phún hình sợi, lớp mang nhện hay khối sợi bông. Trong cơ chất, chúng chỉ sinh trưởng trong các khoang hổng chứa không khí. Nhiều loại nấm mốc có giá trị lớn trong công nghiệp, trái lại nhiều loại nấm lại gây nhiều thiệt hại trong công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm, y học … 1-Cấu tạo sợi nấm Đa số nấm có hình sợi phân nhánh, đan kết lại với nhau thành một khối sợi, từng sợi riêng lẻ gọi là sợi nấm (khuẩn ty thể, mycelium). Có 2 loại sợi nấm: sợi nấm có màng ngăn ngang và sợi nấm không có màng ngăn ngang; trong trường hợp sau, tòan bộ hệ sợi nấm chỉ là 1 tế bào phân nhánh rất phức tạp. Chiều rộng của sợi nấm thay đổi từ 5-50μm. Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào trong cơ chất và hút chất dinh dưỡng ở trong đó (khuẩn ty cơ chất), trong khi đó một phần hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt của cơ chất (khuẩn ty ký sinh), phần sợi nấm nằm ngoài này nhiều hay ít tùy theo loài và môi trường. Ở nhiều loài, các sợi của hệ sợi nấm nằm bên ngoài cơ chất là cơ quan sinh sản. Ở một số nấm khác, sợi nấm đan kết lại dàu đặc với nhau và tạo thành quả thể. Cấu tạo tế bào của nấm không khác với cấu tạo của các sinh vật khác. Màng tế bào cấu tạo bởi cellulose; ở nhiều loại nấm, trong màng tế bào có chứa kitin. Trong tế bào chất có không bào và các chất khác. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glycozen, hạt volutin và các giọt mỡ. Tế bào nấm có 1,2 hoặc nhiều nhân. Ở nấm, hiện tượng nhiều nhân rất phổ biến. 2-Sinh sản của nấm Một đặc điểm của nấm là có nhiều hình thức sinh sản và nhiều cơ quan sinh sản. Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử, từ bào tử mọc ra sợi nấm và sau đó là hệ sợi nấm. Mặc dù vậy, bất cứ một đọan sợi nấm hoặc một mảnh nào của hệ sợi cũng có thể dùng để sinh sản được, các đọan này khi rơi trên môi trường dinh dưỡng thì phát triển và tạo thành một hệ sợi nấm mới. Trong phòng thí nghiệm thường dùng phương pháp này để nhân giống và phân lập. Một số nấm sinh sản bằng oidi (bào tử bột). Trong trường hợp này, sợi nấm bị cắt ra thành từng phần nhỏ đơn bào và mỗi một tế bào đó có thể phát triển thành một hệ nấm mới. Sợi nấm bị cắt ra, từ ngọn xuống, và hiện tượng đó có thể tiến hành ở tòan bộ hệ sợi nấm. Trong sinh sản vô tính của nấm có 2 loại bào tử : bào tử ngoài (exospore) và bào tử trong (endospore), bào tử ngoài gọi là hạt đính (đính bào tử, conidi) và sợi nấm mang các hạt đính gọi là cuống hạt đính. Cuống hạt đính trực tiếp bị thắt lại và sinh ra hạt đính, hoặc có các tế bào đặc biệt nằm ở đầu cuống phân chia sinh ra các hạt đính. Hạt đính nằm đơn độc trên cuống hoặc tụ lại thành nhóm hay thành chuỗi, v.v… Ở các loài nấm khác, bào tử lại được hình thành trong các tế bào riêng biệt nằm ở đầu sợi nấm. Những bào tử đó thường có kích thước lớn, hình cầu, gọi là bọc bào tử (sporangium) hay bào tử nang, sợi nấm mang gọi cuống bọc bào từ (cuống bào tử nang). Cuống bọc bào từ thường phát triển trong bọc bào tử làm thành một trụ có nhiều hình dạng khác nhau, gọi là lõi (columelle) hay nang trụ Trong sinh sản hữu tính, nấm tạo ra nang (asque) mang nang bào tử (ascospore), và đảm (basidi) mang đảm bào tử (basisospore), đó là những cơ quan sinh sản đặc biệt. Đôi khi nang và đảm xếp đơn độc trên sợi nấm, nhưng thường làm thành từng nhóm hoặc từng lớp trong quả thể. Về hình dạng, màu sắc và cấu tạo quả thể thường rất khác nhau. Một số nấm thường có thể sinh sản bằng cách vô tính và hữu tính. Một số khác không có khả năng sinh sản hữu tính, đó là những nấm bất toàn. Trong chu kỳ sinh sản của nhiều loài nấm, ngoài các hình thức sinh sản trên, còn hình thành thêm hạch nấm (sclecotium) và bào tử màng dầy (chlamydospore). Hạch nấm do sợi nấm kết chặt lại rắn chắc và thường có màu đen ở mặt ngoài. Chúng có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau, chứa nhiều chất dự trữ, ít nước. Bào tử màng dầy là những đoạn sợi nấm xếp chặc lại, có màng rất dày. Hạch nấm và bào tử màng dày là giai đọan nghĩ của nấm, ở giai đọan này cbúng có thể vững bền đối với tác dụng của các điều kiện không lợi của môi trường bên ngòai. Khi rơi vào chỗ có điều kiện chúng lại phát triển tốt, chúng nảy mầm vá phát triển thành hệ sợi nấm mới hoặc phát triển thành cơ quan sinh sản II-NHỮNG LOÀI NẤM THƯỜNG DÙNG 1. Rhizopus : Rhizopus có nhiều loại: Rhi. japonicus, Rhi. Orysee, Rhi. pekaII, Rhi. Tonkinensis… Rhizopus có đặc điểm sinh trưởng bằng “giả chi” để lan rộng trên bề mặt. Ở những điểm tiếp xúc với môi trường đặc, thành ống nghiệm… có một chùm rễ giả. Ở chỗ có giả căn, thân bò tiếp tục phát triển và sinh ra các cuốn tử nang chứa nhiều bào tử. Bào tử sinh ra từ nang trụ ở bầu cuống. Vì một phần nang trụ tiếp xúc với vách nang, do đó khi soi kính, nửa dưới của nang lộn ngược như cái ô mà cuống nang trụ là cán ô. Lúc non, bào tử nang trắng, lúc già màu đen, bên trong có nhiều bào tử. Bào tử hình trứng hay hình bán cầu, mặt thường có nếp nhăn, kích thước 5 - 8μm.Nhiệt độ phát triển thích hợp 32-340C. Rhizopus sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp nhưng ít gặp. Chủ yếu sinh sản dinh dưỡng bằng hậu bào tử, khuẩn ty và sinh sản vô tính bằng bào tử nội sinh. Nhìn bề ngoài dễ nhầm lẫm Rhizopus với Absidi. Absidi khác với Rhizopus ở chỗ : bào tử nang hình quả lê và giả căn mọc ở giữa thân bò, không cùng gốc cuống bào tử nang. Rhizopus, Absidi thường thấy trên củ, hạt ẩm, bánh mì, cơm, xôi …để trong không khí vài ngày. Bằng mắt thường thấy khuẩn ty của chúng như những “tấm” mạng nhện, bào tử nang lúc non trắng, khi già đen nhạt có những chấm nhỏ. Bào tử dễ bay trong không khí, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm. Rhizopus thường được nuôi cấy, phát triển trên môi trường dịch thể giàu dinh dưỡng và có thông khí, hệ enzym amylase tương đối hòan chỉnh, nên thường được dùng trong sản xuất rượu theo phương pháp amilose và nuôi cấy nấm mốc lỏng (phương pháp bề sâu). 2. Mucor Mucor và Rhizopus rất giống nhau. Song có thể phân biệt giữa Mucor và Rhizopus ở 3 điểm : Mucor không có thể giả căn, cuống bào tử nang có thể sinh ra ở bất kỳ chỗ nào có nang trụ không có hình bán cầu, không sát với vách bào tử nang Khuẩn ty của Mucor có 2 loại (+) và (-) màu trắng phân nhánh, giống nhau về hình thái, khác nhau về sinh lý. Từ một lọai khuẩn ty có thể sinh sản vô tính. Từ 2 loại khuẩn ty có thể sinh sản hữu tính theo kiểu tiếp hợp để cho bào tử nang đa hạch, về sau là các bào tử nội sinh. Trong sản xuất thường gặp các loại : Mucor rouxii, Mucor mucedo, Mucor javanicus, Mucor hydrophilus… Nhưng sử dụng phổ biến trong sản xuất rượu ở nước ta là Mucor rouxii. Ở Mucor rouxii, ngoài hệ men amylase còn có enzym rượu hóa nên trong điều kiện yếm khí, enzym của Mucor rouxii có thể biến đường thành rượu. Hiện tượng này rất hay gặp trong quá trình sản xuất nấm mốc bề mặt trên môi trường chất rắn có tinh bột giữ ở nhiệt độ cao (39-400C). Mucor rouxii phát triển mạnh trên môi trường thạch Csepek, khuẩn ty phân nhánh nhiều, không vách ngăn, đa nhân, khuẩn lạc cao, không nếp nhăn, bán vào nắp hộp lồng (petrie). Đặc biệt cuống bào tử nang phân nhánh không có thứ tự nhất định. Bào tử nang thường tròn, đường kính 60-80 μm. Nang trụ 20-25 μm. Bào tử tròn, đường kính 6-7 μm. Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt. Bào tử nang từ màu trắng chuyển dần sang màu hơi vàng, đỏ xám, đen, làm cho màu khuẩn lạc xám dần. Mặt dưới khuẩn lạc không có nếp nhăn, không màu. 3. Aspergilus Aspergilus có thể tìm thấy dễ dàng ở khắp mọi nơi, trên mọi cơ chất. Vào khoảng năm 1877, ở Nhật, người ta đã phát hiện và sử dụng Aspergilus vào sản xuất rượu, phân giải acid… Aspergilus gồm rất nhiều loại, nhưng trong công nghiệp sản xuất rượu thường dùng các loại : Asp.flavus, Asp.orysee, Asp.batatae, Asp.awamorii, Asp.niger,Asp.usami… Aspergilus có đặc điểm sau : khuẩn ty không màu hay vành nhạt. Có 2 loại : khuẩn ty ký sinh phát triển trên mặt môi trường và khuẩn ty dinh dưỡng ăn sâu vào trong môi trường. Khuẩn ty phân nhiều nhánh, có nhiều ngăn tế bào mỗi tế bào có một nhân. Nang và nang bào tử là quả thể màu vàng kim. Khi Aspergilus hình thành đính bào tử dễ phân biệt với các mốc khác. Cuống đính bào tử dài và thẳng, không phân nhánh mà đầu phình to tạo thành chop nang. Tế bào sinh cuống đính bào tử phân biệt với các tế bào khác gọi là tế bào chân. Chóp nang có thể hình cầu, hình chùy, hình bán cầu… Xung quanh đầu có nhiều cuống nhỏ. Tùy loài mà cuống nhỏ có 1 hay 2 tầng. Theo Thom và Raper (1945), gọi chúng là cuống nhỏ sơ sinh và cuống nhỏ thứ sinh. Tất cả cuống nhỏ đều có hình chai. Đính bào tử xếp thành chuỗi dài, càng gần bào tử càng lớn dần. Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng tỏa tròn trên chóp nang. Đính bào tử thường có hình cầu đơn bào, đa nhân, bề mặt xù xì. Do cuống đính bào tử và bào tử có màu sắc, phát triển mạnh, nên màu của chúng trở nên màu của khuẩn lạc. Màu khuẩn lạc Aspergilus rất khác nhau : đen, ghi, nâu, vàng, vàng lục, lục vàng, lục, trắng… Màu sắc có thay đổi tùy điều kiện môi trường, thời gian nuôi cấy… trên môi trường nhất định (ví dụ môi trường Csepek); màu khuẩn lạc là một dấu hiệu để phân loại. Asp rất nhạy đối với nguyên tố vi lượng, tạo ra màu sắc đặc biệt của khuẩn lạc. Mulder đã xác định : Asp. Niger có màu sẫm nhất khi môi trường có Cu2+ với nồng độ 0,00025%; ở nồng độ thấp hơn, màu khuẩn lạc nhạt dần. Khi không có đồng, đính bào tử có màu vàng (bình thường là đen hay nâu) Aspergilus Orysee : nuôi trên thạch Csepek thì trên vùng bào tử có màu vàng lục trội về màu vàng. Vùng không có bào tử hẹp và trắng. Khuẩn lạc không có nếp nhăn hoặc không rõ rệt. Bào tử nang đầu tròn 40-60 μm, cuống đính bào từ dài 0,8-1,5mm, đường kính 8-12 μm, có thể thấy bằng mắt thường. Đính bào tử hình bầu dục hay quả lê, kích thước 4-6×5-7 μm. Tế bào chai đặc trưng của Aspergilus dễ thấy. Bào tử nang lúc non trắng, lúc già vàng lục, càng già màu càng sẫm. Đính bào tử trần dễ bay. Mốc này sinh ra các enzym amylase, invectase, maltase, protease và catalase. Hoạt tính men amylase, protease rất cao. Mốc này phát triển trong khoảng nhiệt độ 15 - 400C, tối thích 30 - 320C. Mốc này được sử dụng nhiều rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu, tương, chao, thuộc da, nước chấm lên men v.v… Aspergilus Flavus : nuôi trên thạch Csepek thì mặt trên vùng bào tử có màu lục vàng, trội về màu lục. Khuẩn lạc thấp, đính bào tử nằm sát mặt thạch, do cuống ngắn. Mặt dưới khuẩn lạc thường không màu, đôi khi vàng nhạt. Bào tử nang đầu tròn 40 - 60 μm. Cuống đính bào tử ngắn 0,3 - 0,5mm. Đính bào tử tròn hay bầu dục 3,5 - 5 μm. Tế bào chân rõ dễ thấy. Bào tử dễ bay. Aspergilus orysee rất giống Asp. Flavus, chỉ khác là kích thước lớn hơn, khuẩn lạc có màu trội hơn về màu vàng. Mốc này sinh ra hệ enzym giống A.Orysee, đặc biệt là protease rất hoạt động và chế phẩm tinh khiết của enzym này được dùng làm tác nhân ổn định bia. Ở một số môi trường có chất béo (trên lạc), mốc này có thể sinh ra độc tố aflatoxin. Có một số tác giả xếp hai giống mốc này thuộc nhóm A.orysee-flavus. Aspergillus niger : thường gọi là mốc đen. Trên môi trường thạch Csepek, khuẩn lạc tròn, xốp, vùng bào tử màu nâu đen hoặc đen. Khuẩn lạc có nếp nhăn rõ. Vùng giữa khuẩn lạc sau 3 - 4 ngày (2 - 4mm) cao hơn xung quanh. Mặt dưới thường không màu, đôi khi vàng nhạt, thấy rõ nếp nhăn từ tâm khuẩn lạc đi ra. Bào tử nang đầu tròn, khá lớn (100 - 160 μm). Cuống đính bào tử dài 0,5 - 1,5mm hoặc hơn, đường kính 7 - 17 μm, thấy rõ bằng mắt thường. Cuống nhỏ hay thể hình chai, có hai lớp hình lăng trụ. Lớp đầu dài lớn 15 - 25×3 - 4 μm. Đính bào tử tròn, đường kính 3 - 4 μm. Tế bào chân dễ nhận thấy. Mốc sinh ra enzym amylase, invectase, maltase, protease, pectinase, glucooxydase. Mốc này được dùng trong sản xuất rượu , sản xuất acid citric, acid fumaric. Protease do mốc này họat động ở pH 2,5 - 3,5 còn ở protease của A. orysee không hoạt động ở vùng pH này. Trên thế giới, 90% sản lượng acid citric được sản xuất bằng phương pháp lên men. Aspergillus usami (sử dụng ở nhà máy rượu Hà Nội) là chủng niger đã được đột biến bằng tia phóng xạ Coban 60. Qua nghiên cứu chúng tôi nhận thấy Asp.Usami của nhà máy rượu có những đặc điểm: Đính bào tử to, khi già có màu hơi nâu đen Nhiệt độ thích hợp 33 - 340C, độ ẩm 90 - 100% Hệ men amylase tương đối đầy đủ, nuôi trên môi trường rắn (cám, trấu, bột ngô) trong điều kiện thích hợp, chỉ sau 36 - 40 giờ, khả năng tích lũy men cao nhất. Ngoài tích lũy amylase, Asp.usami còn sinh ra một lượng acid khá lớn (2 - 3% trong môi trường), vì vậy amylase của Asp.usami có thể thủy phân tinh bột ở pH 4 - 4,5. Mặt khác amylase của Asp.usami vẫn giữ được hoạt tính ở nhiệt độ cao 600C ± 10C.