Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh vi khuẩn gây bệnh thường gặp

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 252 ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP Nguyễn Thị Ngọc Thu*, Nguyễn Trọng Hiệp*, Bùi Tùng Hiệp** TÓM TẮT Mở đầu: Việc định danh nhanh chóng vi khuẩn là điều cốt yếu trong việc điều trị bệnh nhân, đặc biệt trong những nhiễm trùng nặng. Trong những phương pháp hiện đang sử dụng tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng để chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn, nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp thường sử dụng nhất. Tuy nhiên, nuôi cấy đòi hỏi thời gian ít nhất từ 18-24 giờ cho vi khuẩn mọc và phải thêm nhiều thời gian nữa cho những thử nghiệm tính chất sinh-hóa để để định danh. Mục tiêu: Khảo sát thêm một phương pháp có khả năng định danh các vi khuẩn gây bệnh thường gặp. Phương pháp: Mười một vi khuẩn gây bệnh thường gặp, bao gồm 6 vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, và Pseudomonas aeruginosa) và 5 vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 51299, Bacillus subtilis ATCC 6633, Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696) đã được khuếch đại vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA ribosom của tiểu đơn vị nhỏ và lớn, với những mồi P1(5’-TTG TAC ACA CCG CCC GTC A-3’) và P2 (5’- GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’). Kết quả: Mỗi loài vi khuẩn khảo sát cho được một mẫu riêng biệt. Các mẫu này gồm nhiều vạch DNA khuếch đại tạo ra, có tính khác biệt rõ ràng giữa các loài. Kết luận: Các số liệu cho thấy tính hữu dụng của phương pháp này, có thể sử dụng, mang tính hiệu qủa và chuyên biệt cao, giúp phân biệt giữa những loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp. Từ khóa: Vi khuẩn gây bệnh thường gặp, họ Enterobacteriaceae, vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA ribosom (rRNA) của tiểu đơn vị nhỏ và lớn, PCR, Staphylococcus aureus kháng methicillin ABSTRACT APPLYING THE MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUE FOR IDENTIFICATION OF COMMON PATHOGENIC BACTERIA Nguyen Thi Ngoc Thu, Nguyen Trong Hiep, Bui Tung Hiep * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 252 - 257 Background: Rapid identification of bacteria is crucial in patient therapeutics, especially in severe infections. Among the various methods currently used in clinical laboratories for detection of bacterial infections, culture is the most frequent one. However, culture method requires at least 18-24 h of incubation, additional time is needed to perform biochemical tests to identify the bacteria. Objectives: To develop an alternative method for identification of common pathogenic bacteria. Method: Eleven common pathogenic bacteria, including six Gram-negative bacteria (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, and Pseudomonas aeruginosa), and five Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis, Corynebacterium diphtheriae) were amplified in the intergenic 16S-23S spacer regions *Khoa Dược- ĐH Y Dược TP HCM, TP. HCM **Bệnh viện cấp cứu Trưng Vương, TP. HCM Tác giả liên hệ: TS. Nguyễn Trọng Hiệp ĐT: 0907429991 Email: ntronghiep@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 253 of bacterial rRNA genes by using the PCR with primers P1(5’-TTG TAC ACA CCG CCC GTC A-3’) and P2 (5’-GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’). Results: Each studied species gave a specific ribotyping pattern. The pattern of DNA multiple bands is produced which is very discriminatory. Conclusion: These data demonstrated the utility of this method can very efficiently and specifically differentiate between the common pathogenic bacteria. Keywords: Common pathogenic bacteria, Enterobacteriaceae, the intergenic 16S-23S spacer regions of bacterial rRNA genes, PCR, methicillin-resistant Staphylococcus aureus ĐẶT VẤN ĐỀ Việc định danh chính xác vi khuẩn gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm là yêu cầu quan trọng, thiết yếu của một phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Một số vi khuẩn mọc chậm hoặc/ và yêu cầu nuôi cấy khó khăn thì các phương pháp nuôi cấy cổ điển thường qui gặp nhiều khó khăn hay mất nhiều thời gian nhiều tuần, đôi khi nhầm lẫn. Nhiều nghiên cứu cho thấy các phương pháp định danh cổ điển dựa trên hình thể học và phản ứng sinh hóa của những bộ kit thương mại thông dụng, phổ biến trên thế giới như API hoặc hệ thống định danh tự động VITEK 2 (automated identification system) khá đắt tiền dành cho vi khuẩn gây bệnh cũng có một tỉ lệ không định danh được hoặc nhầm lẫn(1). Các phương pháp sinh học phân tử với ưu thế cho kết qủa định danh nhanh chóng (khoảng 1 ngày so với trung bình 3 ngày của phương pháp cổ điển), chính xác vi khuẩn gây bệnh là hết sức cần thiết trong những bệnh nhiễm nặng (nhiễm trùng huyết, viêm màng não vv), để từ đó có kết qủa kháng sinh đồ phù hợp, phác đồ điều trị kháng sinh hiệu qủa góp phần trong chiến lược sử dụng kháng sinh tốt trong bệnh viện. Tất cả sẽ ảnh hưởng đến việc làm giảm thời gian và chi phí điều trị, tỉ lệ tử vong cũng như kiểm soát việc gia tăng tính đề kháng kháng sinh(2,4). Trong vòng 10 năm qua, kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng rộng rãi xác định tính đa hình hoặc/và để định danh vi khuẩn tới loài, dựa trên việc khuếch đại những vùng bảo thủ trong vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA ribosom (rRNA) cho tiểu đơn vị nhỏ và lớn (16S và 23S rRNA), gọi chung là phương pháp định týp ribosom (ribotyping). Số lượng và kích thước những vùng DNA khuếch đại mang tính đặc trưng cho từng loài sẽ giúp định danh các vi khuẩn gây bệnh(3,6,7,8,9,10). Chưa có nhiều nghiên cứu định danh các vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật này tại Việt nam. Đề tài nhằm khảo sát thêm một phương pháp áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử, có khả năng định danh các vi khuẩn gây bệnh thường gặp. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi khuẩn 11 chủng đại diện được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Vi sinh – Ký sinh gồm 6 vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) và 5 chủng vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 51299, Bacillus subtilis ATCC 6633, Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696). Định danh vi khuẩn Trước hết, những chủng vi khuẩn đại diện Gram âm và Gram dương, được định danh bằng bộ kit API 20E (BioMerieux®) hoặc bằng phương pháp thường qui. Kỹ thuật sinh học phân tử Sau đó tất cả những chủng đại diện này được thực hiện bằng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA ribosom của tiểu đơn vị nhỏ và lớn (16S và 23S rRNA) với những mồi P1 (5’-TTG TAC ACA CCG CCC Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 254 GTC A-3’) và P2 (5’- GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’), được thiết kế bổ sung với những đoạn có trình tự bảo thủ gần đầu 3’ của vùng 16S và đầu 5’ của vùng 23S trên gen mã hóa cho RNA ribosom. Chiết DNA vi khuẩn Hoạt hóa vi khuẩn trên môi trường Trypticase soy broth, sau đó thực hiện chiết DNA bộ gen vi khuẩn bằng bộ kit Wisard® SV genomic DNA purification system (A2361- Promega) theo qui trình của nhà cung cấp. Thực hiện phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi P1 và P2, phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt (ATC401 model; Apollo-CLP). Thông số chạy PCR gồm biến tính ban đầu 1 phút ở 940C; 30 chu kỳ (1 phút ở 940C, 1 phút ở 500C, 1 phút 30 giây ở 720C); 5 phút ở 720C) với GoTaq® Flexi DNA polymerase (M8295- Promega). Sản phẩm khuếch đại được điện di trong điện trường 100V trong 2 giờ trên gel agarose 2.5 % có chứa ethidium bromide. Sản phẩm được phát hiện dưới tia UV 254 nm, chụp hình bằng hệ thống chụp gel (UV Transilluminator- Wealtec), phân tích bằng phần mềm Cross checker 2.91. KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN Những chủng đại diện vi khuẩn Gram âm (E. coli, K. pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) những chủng lâm sàng ESBL E. coli, Klebsiella pneumoniae đã được định danh bằng bộ kit API 20E (BioMerieux®), tất cả đều cho kết qủa định danh với tỉ lệ % Id từ 73.2 đến 99.9%. Những chủng đại diện vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis, Corynebacterium diphtheriae) đều cho kết qủa định danh phù hợp bằng phương pháp thường qui. Với kỹ thuật PCR định týp ribosom, chúng tôi nhận thấy các băng DNA khuếch đại ảnh hưởng nhiều bởi thông số thành phẩn MgCl2 và enzyme Taq polymerase của phản ứng, cụ thể trong nghiên cứu này thì MgCl2 (1.5mM) và enzyme Taq polymerase (2.5U) cho kết qủa tốt nhất. Kỹ thuật định týp ribosom giúp định danh một cách nhanh chóng những vi khuẩn gây bệnh thường gặp Gram âm và Gram dương vì số lượng và kích thước những vùng DNA khuếch đại mang tính đặc trưng cho từng loài(3,6,7,8,9,10). Kết qủa cho thấy, với những vi khuẩn Gram âm: Shigella flexneri được quan sát có ba sản phẩm khuếch đại ở vị trí 1100, 800 và 700 bp. Salmonella typhi cũng cho ba băng kích thước 1200, 900 và 700 bp. Proteus mirabilis cho bốn băng với kích thước 1100, 900, 850 và 750 bp. Riêng Pseudomonas aeruginosa chỉ có duy nhất một băng ở vị trí 850 bp (Hình 1). K. pneumoniae thì cho ba băng ở những vị trí kích thước 850, 700, 550 bp. Với E. coli, chúng tôi nhận thấy vi khuẩn này cho bốn băng với kích thước 1200, 850, 800 và 700 bp (Hình 2). Hình 1. Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR trên vi khuẩn Shigella flexneri; Salmonella typhi; Proteus mirabilis; Pseudomonas aeruginosa A: Shigella flexneri. B: Salmonella typhi. C: Proteus mirabilis. D: Pseudomonas aeruginosa. M: Marker 100 bp. A B C D M 1.5 kb 1 kb 700 bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 255 Hình 2. Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR trên vi khuẩn K. pneumoniae và E. coli E: Klebsiella pneumoniae. F: E. coli. M: Marker 100 bp Hình 3. Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR trên vi khuẩn Gram dương G: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. H: Staphylococcus aureus. I: Corynebacterium diphtheriae. J: Streptococcus faecalis. K: Bacillus subtilis. M: Marker 100 bp. M2: Marker 1 kb Trên những vi khuẩn đại diện Gram dương cũng cho kết qủa tương tự, các băng DNA khuếch đại thu được đều có sự khác biệt, giúp nhận diện tới loài nhờ vào số lượng và kích thước của những băng khác nhau như: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus đều cho ba băng kích thước 800, 750, 550 bp. Vi khuẩn Corynebacterium diphtheriae cho ba băng kích thước 750, 700, 550 bp. Streptococcus faecalis cho bốn băng kích thước 730, 700, 600, 550 bp và Bacillus subtilis thì có được ba băng ở những vị trí 730, 700, 550 bp (Hình 3). Ở Việt Nam, để định danh những vi khuẩn gây bệnh, phần lớn các bệnh viện áp dụng phương pháp cổ điển gồm nuôi cấy vi khuẩn kết hợp với những thử nghiệm đặc tính sinh hóa. Với những bệnh viện lớn có điều kiện thì có thể dùng bộ kit nhóm API (20E, 20NE...), đây là bộ kit sử dụng rất thông dụng ở những nước phát triển. Theo một nghiên cứu năm 1981, Kenneth E. Aldridge và cộng sự(5), đã so sánh khả năng định danh của bộ kit này với những phương pháp thông thường như những phản ứng sinh hóa khi nghiên cứu 505 vi khuẩn thuộc Họ Enterobacteriaceae gồm 202 chủng lâm sàng và 303 chủng đã được lưu trữ từ trước. Nghiên cứu này cho thấy bộ kit API 20E thì chính xác và nhanh hơn những thử nghiệm đặc tính sinh hóa cổ điển. Tuy nhiên, bộ kit này cũng hiện diện những hạn chế với sai sót khi định danh hoặc tỉ lệ chính xác định danh yếu trên những loài vi khuẩn khó nuôi cấy hoặc không nuôi cấy được. Thực vậy, với việc sử dụng kit API 20E, 9 trường hợp của Shigella sonnei được định danh là Citrobacter freundii và trong 7 trường hợp của Serratia marcescens được định danh là Serratia liquefaciens, phần lớn những sai sót liên quan những chủng tồn trữ nhưng cũng có một số lượng có ý nghĩa chủng lâm sàng mới phân lập bị nhầm lẫn. Mặt khác, theo một nghiên cứu gần đây của Awong-Taylor J và cộng sự(1), để định danh những vi khuẩn Gram dương không lên men glucose bằng cách sử dụng bộ kit API 20NE, chỉ có 54% loài được nhận diện tới giống và để định danh đến loài thì chỉ được 7% các chủng. Bên cạnh đó, có tới 39% những chủng thử nghiệm không định danh được. Với hệ E M M F 1 kb 500 bp 1.2 kb 500 bp M G H I J K M2 1 kb Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 256 thống định danh tự động VITEK 2, các tỉ lệ tương ứng là 53%, 1%, và 46%. Trong nghiên cứu của chúng tôi, với số loài thử nghiệm còn ít nhưng với 11 loài thử nghiệm bằng kỹ thuật sinh học phân tử, tất cả đều có thể nhận định đến loài. Với kỹ thuật định t y pe ribosom, chúng tôi thấy những thuận lợi của phương pháp này như độ chính xác cao và nhanh chóng (chỉ mất từ 5-7 giờ thao tác thay vì từ 1-2 ngày như phương pháp cổ điển). Nghiên cứu của Fu Jun-fen năm 2002(3) thực hiện trên 27 loài vi khuẩn gồm những vi khuẩn Gram dương thường gây nhiễm trùng máu như Listeria monocytgenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus durans...và vi khuẩn Gram âm thường gây nhiễm trùng máu như Salmonella typhi, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa..., tất cả đều cho thấy khác biệt số lượng, kích thước các băng khuếch đại, giúp nhận định nhanh chóng loài (Bảng 1). Một nghiên cứu khác của Mehwish Jamil và cộng sự năm 2007(7), chỉ thực hiện trên vi khuẩn Gram âm, gồm năm loài vi khuẩn gây bệnh thuộc Họ Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Salmonella enterica serovar typhi (Salmonella typhi), Proteus vulgaris, Klebsiella aerogenes và Cirtobacter freundii) cũng như một vi khuẩn Gram âm khác thường xuyên gây bệnh là Pseudomonas aeruginosa. Tất cả đều được định danh một cách nhanh chóng và dễ dàng tuy kích thước và số lượng các băng khuếch đại có một số khác biệt so với nghiên cứu chúng tôi, điều này do các tác giả sử dụng những cặp mồi khác (Bảng 1). Bảng 1. So sánh kết qủa nghiên cứu với tác giả khác Kích thước của sản phẩm khuếch đại (bp) Vi khuẩn thử nghiệm Fu Jun-fen và cộng sự Mehwish Jamil và cộng sự Nghiên cứu của chúng tôi Escherichia coli 4 băng (không nêu kích thước) 1200, 850, 800, 700 1200, 850, 800, 700 Salmonella typhi 5 băng (không nêu kích thước) 3000, 1200, 900, 850, 700 1200, 900, 700 Pseudomonas aeruginosa 3150, 700 850 850 Klebsiella aerogenes Không thực hiện 3000, 870, 700, 520 Không thực hiện Klebsiella pneumoniae 3100, 900 Không thực hiện 850, 700, 550 Proteus vulgaris 320 900, 800, 750, 700 Không thực hiện Proteus mirabilis Không thực hiện Không thực hiện 1100, 900, 850, 750 Citrobacter freundii Không thực hiện 3000, 850, 700, 580 Không thực hiện Gram âm Shigella flexneri 2500, 800 Không thực hiện 1100, 800, 700 Staphylococcus aureus 1200, 600 Không thực hiện 800, 750, 550 Meticillin-resistant Staphylococcus aureus Không thực hiện “ 800, 750, 550 Staphylococcus epidermidids 1200, 600 “ Không thực hiện Streptococcus β-hemdyticus 4 băng (không nêu kích thước) “ Không thực hiện Streptococcus faecalis Không thực hiện “ 730, 700, 600, 550 Enterococcus durans 3100, 900 Không thực hiện Bacillus subtilis 3 băng (không nêu kích thước) “ 730, 700, 550 Corynebacterium diphtheriae Không thực hiện “ 750, 700, 550 Gram dương Listeria monocytogenes 1500 “ Không thực hiện Để kết luận, trước hết thuận lợi của phương pháp này là nhanh hơn những phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm các đặc tính sinh hóa hoặc sử dụng bộ kit định danh nhiều vì có thể đưa ra kết quả trong 5-7 giờ thay vì mất 36- 48 giờ. Hơn nữa, những phương pháp cổ điển có thể cho ra một tỉ lệ sai sót cao trong khi định danh vi khuẩn. Mặt khác, kỹ thuật định t ýp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 257 ribosom có thể định danh những vi khuẩn không nuôi cấy được cũng như những vi khuẩn không lên men đường glucose. Kỹ thuật này cũng có ưu thế hơn so với kỹ thuật PCR đơn thuần khuếch đại trình tự gen 16S của rRNA nếu áp dụng cho định danh, nhờ vào sự sử dụng một cặp mồi duy nhất. Thật vậy, với kỹ thuật PCR chỉ dựa trên trình tự gen 16S của rRNA, chúng ta phải sử dụng những cặp mồi đặc hiệu riêng cho từng loài hoặc nếu dùng mồi chung cho nhiều loài thì phải kết hợp với việc giải và so sánh trình tự sản phẩm PCR này. Do đó, chúng tôi thấy phương pháp định t ýp ribosom có thể thực hiện để định danh những vi khuẩn gây bệnh thường gặp, góp phần vào việc điều trị bệnh nhiễm trùng tại Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Awong-Taylor J, Craven KS, Griffiths L, Bass C, Muscarella M. (2008). Comparison of biochemical and molecular methods for the identification of bacterial isolates associated with failed loggerhead sea turtle eggs. J Appl Microbiol, 104(5): 1244-1251. 2. Bosshard PP, Abels S, Zbinden R, Bottger EC, Altwegg M. (2003). Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic Gram-positive rods in the clinical laboratory (an 18- month evaluation). Journal of Clinical Microbiology, 41(9): 4134- 40. 3. Fu Jun-fen, Yu He-yong, Shang Shi-qiang, Hong Wen-lan, Lu Miao-quan, Li Jian-ping. (2002). A molecular biological study on identification of common septicemia bacteria using 16S- 23S rRNA gene spacer regions. Journal of Zhejiang University (SCIENCE), 3(2): 237-242. 4. Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. (1994). PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol, 32: 335–351. 5. Kenneth E Aldridge, Rondy L Hodges (1981). Correlation studies of Entero-Set 20, API 20E and conventional Media systems for Enterobacteriaceae identification. Journal of Clinical Microbiology, 13(1): 120-125. 6. Koeck JL, Chakour M, Teyssou R. (2001). Apport de la biologie moléculaire au diagnostic bactériologique. Rev Fr Lab, 335: 37-41. 7. Mehwish Jamil, Saira Bashir, Mashkoor Mohsin, Ayesha Tariq, Aasia Bashir, Asma Haque, Yasra Sarwar, Aamir Ali, Abdul Haque (2007). Differentiation of common Gram negative pathogens by PCR-Ribotyping. Pak J Med Sci, 23(2): 233-237. 8. Mendoza M et al. (1998). Identification of Staphylococcus species by 16S-23S rDNA intergenic spacer PCR analysis. Int J Syst Bacteriol, 48(3): 1049-1055. 9. Riffard S, Lopresti F, Normand P et al. (1998). Species identification of Legionella via intergenic 16S-23S ribosomal spacer PCR analysis. Int J Sys Bacteriol, 48(3): 723-730. 10. Sogaard P, Gahrn-Hansen B, Hui-Ping Z, Frederiksen W. (1986). An investigation of three commercial methods for rapide identification of non-enteric gram-negative rods. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand Sect, 94: 357-363.