Bài giảng Thực hành Hóa sinh động vật

THỰC HÀNH HÓA SINH ĐỘNG VẬT 1. THỦY PHÂN MỠ BỞI LIPASE M ỡ = Este của glycerol và acid béo - Mu ốn cắt lk ester cần enzyme esterase. - Lip ase tuyến tụy thuỷ phân mạch ester trong mỡ. - Đ/kiện cho lipase hđ: t° thích hợp, thời gian hđ, mỡ được nhũ tương hoá nhờ các acid mật. - Lip ase thuỷ phân mỡ, cho ra glycerol và các acid béo (mt acid). Chuẩn độ acid bằng base (NaOH 0,1N) với chỉ thị màu fenolftalein (0,1% trong cồn). - N ếu lipase hđ càng mạnh, acid mật h/hoá và nhũ hoá mỡ càng tốt, thời gian càng lâu → l ượng acid béo sinh ra càng nhiều, lượng NaOH chuẩn độ càng tốn. Thí nghiệm : A B Hai bình tam giác, cho v ào mỗi bình: 40 ml s ữa tươi 2 ml chi ết xuất lipase (dịch tuỵ) Th êm 0,5 ml dịch mật Th êm 0,5 ml nước cất L ắc trộn đều L ấy từ mỗi bình 10 ml đem chuẩn độ bằng NaOH 0,1N, tới khi có màu hồng bền nửa phút, ghi lại số ml NaOH. M ột giọt fenolftalein S ố dd còn lại cho vào tủ ấm 37-40°C C ứ sau 15 phút lại lấy tiếp 10 ml chuẩn độ tiếp (4 lần ch/độ) T ừ kết qủa thu được sẽ lập được đồ thị 15’ 30’ 45’ NaOH 0,1N ? ? Th ời gian 2. ĐỊNH LƯỢNG CATALASE TRONG MÁU 2.1. Catal ase là gì? - L à E phân huỷ perhydrol thành nước và ôxy H 2 O 2 Catal ase H 2 O + O 2 perhydrol - Ở đ.vật, catalase có nhiều trong hồng cầu, lách , gan - C ó nhiều cách định lượng E: Tr ực tiếp: tìm xem có bao nhiêu mg E Gi án tiếp: thông qua chất khác mà E tác dụng Định lượng catalase gián tiếp; thông qua lượng H 2 O 2 bị catalase của máu phân giải. Cơ sở của phản ứng: 2KMnO 4 +8H 2 SO 4 + 5H 2 O 2 → 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 + 8H 2 O L ượng H 2 O 2 biết trước, KMnO 4 chuẩn độ cũng biết 2.2. Ý nghĩa của việc định lượng catal ase? Ý nghĩa của việc đ/lượng E nói chung: tìm ra kh/năng trao đổi sâu kín của t/bào Đ/lượng catalase có t/dụng gì? H 2 O 2 l à sản phẩm OXH của cơ thể; VD: trong ph/giải acid amin, oxidase có nhóm ghép FMN hay FAD tách cặp hydro của cơ chất. Bình thường cặp hydro tách ra sẽ vào chuỗi hô hấp, nhường cho coenzyme Q, nhưng trong tr/hợp OXH aa, cặp hydro được nhường tr/tiếp cho ôxy, tạo H 2 O 2 . H 2 O 2 sinh ra được catalase ph/giải. Có tr/hợp bị peroxydase ph/giải cho H 2 O và O (ôxy nguyên tử) Ôxy nguyên tử dễ t/động với acid béo gây độc (làm rách màng TLT, chuỗi hô hấp ngừng) → catal ase có tác dụng khử độc N ếu qt OXH mạnh → H 2 O 2 sinh ra nhiều → lượng catalase cũng nhiều và h/động mạnh. Qua vi ệc đ/lượng catalase, đánh giá được tình trạng sức khoẻ của gia súc, gia cầm 2.3. C ách làm thí nghiệm - L ấy máu: tĩnh mạch (tai thỏ, cánh gà) - L ấy 0,1 ml máu, cho vào bình định mức đã có 100 ml nước cất, thổi nhẹ máu xuống, hút nước cất lên vài lần và lại thổi nhẹ vào bình → m áu bị pha loãng 1 0 / 00 L ấy 2 bình nón, cho vào mỗi bình 7-8 ml nước cất và 1ml máu pha. M ột bình đem đun sôi 2 phút để khử men (ĐC), rồi để nguội. Cho v ào cả 2 bình: 2 ml H 2 O 2 1% Để 30 phút - Th êm vào mỗi bình 4-5 ml H 2 SO 4 10% (để làm ngừng phản ứng và tạo m/trường để chuẩn độ) - D ùng KMnO 4 0,1N để chuẩn độ lượng H 2 O 2 dư, khi thấy xuất hiện màu hồng bền nửa phút thì dừng lại - L ấy số liệu bình đối chứng (khử men) trừ số liệu bình không khử men (thí nghiệm) và nhân với 1,7 ra số catalase, là số mg H 2 O 2 bị catalase của 1 μ l m áu (1ml máu pha) ph/giải S ố catalase = (ĐC – TN). 1,7 = số mg H 2 O 2 Ch ỉ số catalase/hồng cầu = S ố catalase S ố hồng cầu [mg] 1 μ l m áu gà có 2,5x10 6 hồng cầu