Phát triển mô hình gây co giật bằng Picrotoxin trên chuột nhắt và khảo sát tác động chống co giật của NL197 và nọc bò cạp

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 401 PHÁT TRIỂN MÔ HÌNH GÂY CO GIẬT BẰNG PICROTOXIN TRÊN CHUỘT NHẮT VÀ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG CO GIẬT CỦA NL197 VÀ NỌC BÒ CẠP Trần Hoàng Yến*, Trương Thị Thu Trang**, Nguyễn Ngọc Vinh***, Hoàng Ngọc Anh****, Phạm Thành Suôl*, Võ Phùng Nguyên** TÓM TẮT Mục tiêu: Phát triển mô hình gây co giật bằng Picrotoxin và khảo sát tác động chống co giật của NL197 và các phân đoạn nọc Heterometrus laoticus trên chuột nhắt trắng. Phương pháp: Xác định liều gây co giật động kinh và tử vong chuột nhắt trắng. LD100 được sử dụng để khảo sát tác động của NL197 và phân đoạn nọc bò cạp. Thời gian khởi phát cơn, số lần, thời gian co giật, thời gian mỗi loại, khoảng cách giữa các cơn co giật, thời gian và tỉ lệ tử vong và thời gian bám trên thanh quay được ghi nhận. Khảo sát sự thoái hóa tế bào thần kinh bằng nhuộm Hematoxylin Eosin và Cresyl violet. Kết quả: Picrotoxin 8 mg/kg SC gây co giật, tử vong 100% chuột thử nghiệm, làm giảm thời gian bám trên thanh quay và tổn thương vùng hải mã. NL197 PO liều 50, 73 và 100 mg/kg bảo vệ, chống co giật, làm tăng thời gian bám trên thanh quay và bảo vệ tế bào thần kinh. Phân đoạn nọc bò cạp chỉ kéo dài thời gian bám trên thanh quay. Kết luận: NL197 có tác động chống co giật, bảo vệ khỏi tử vong, tăng khả năng phối hợp vận động, giảm thoái hóa tế bào thần kinh. Các phân đoạn nọc bò cạp làm tăng khả năng phối hợp vận động của chuột. Từ khóa: Động kinh, Co giật, Picrotoxin, NL197, Nọc bò cạp, Mô hình thanh quay rotarod, Sự thoái hóa tế bào thần kinh. ABSTRACT DEVELOPMENT OF PICROTOXIN – INDUCED CONVULSIVE MICE MODEL TO EVALUATE ANTICONVULSIVE ACTIVITIES OF NL197 AND THE VENOM OF SCORPION Tran Hoang Yen, Truong Thi Thu Trang, Nguyen Ngoc Vinh, Hoang Ngoc Anh, Pham Thanh Suol, Vo Phung Nguyen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 401 - 405 Objectives: Picrotoxin (PTX)-induced seisure on mice was studied then applied to evaluate anticonvulsive activities of NL197 and venom from Heterometrus laoticus. Methods: LD100 SC PTX was used to evaluate anticonvulsive effect and protection from death of NL197 and the venom of scorpion. The following parameters: latency of onset, duration of convulsions, frequency of convulsions, classification – time of each convulsion, spread of convulsions, time of death, mortality and duration on rotating cylinder in rotarod test were recorded for evaluating the convulsive condition. Evaluate the degeneration of neurons by hematoxylin eosin and cresyl violet staining. Results: LD100 PTX 8 mg/kg SC caused the decrease in the time which mice spent on rota-rod and injured neurons in hippocampus. In PTX induced-seizure model, NL197, administered orally, had anticonvulsive activities at doses of 50 mg/kg, 73 mg/kg and 100 mg/kg, respectively, prolonged the time spent on the rotating * Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ ** Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh *** Viện Kiểm nghiệm Tp. Hồ Chí Minh **** Viện khoa học vật liệu ứng dụng Tp. HCM Tác giả liên lạc: DS. Trần Hoàng Yến ĐT: 01222 884 888 Email: thyen@ctump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 402 cylinder and showed protective effect on neurons. The fractions of scorpion’s venom only increased the duration mice spent on the rod in rotarod. Conclusions: In PTX induced-seizure model, NL197 had anticonvulsive effect and protection from death, strengthened motor coordination ability and prevented neurons from degeneration. Keywords: Epilepsy, Convulsion, Seizure, Picrotoxin, NL197, Venom of scorpion, Rotarod test, Degeneration of neurons. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vài thập niên gần đây, nhiều nghiên cứu thử nghiệm hiệu quả trị động kinh của các thuốc đã được báo cáo, tuy nhiên kết quả đạt được vẫn chưa thật sự hiệu quả và vẫn còn khoảng 1/3 bệnh nhân chưa có đáp ứng tốt với những thuốc điều trị hiện tại(4). Nhu cầu đặt ra là cần có mô hình để khảo sát tác động chống động kinh của thuốc mới, đặc biệt trong điều kiện thí nghiệm tại Việt Nam. Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phát triển mô hình gây co giật bằng tác nhân Picrotoxin (PTX) và khảo sát tác động bảo vệ chống co giật của NL197, một dẫn xuất 4(3H)-quinazolinon và các phân đoạn nọc bò cạp Heterometrus laoticus trên mô hình khảo sát. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực Swiss albino, 5 – 6 tuần tuổi, 18 – 22 g, nuôi ổn định trong hộp nhựa 2 ngày trước thử nghiệm, cung cấp đầy đủ thức ăn, nước uống trong chu trình 12 giờ sáng tối ở nhiệt độ 27 ± 1oC. Cường độ ánh sáng 100 ± 5 lux, đảm bảo yên tĩnh. Hóa chất nghiên cứu Picrotoxin (Sigma), Diazepam (DZP – Cty CPDLDP Pharmadic), NL197 (Viện Kiểm nghiệm), các phân đoạn (PĐ) nọc bò cạp (Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng). Phát triển mô hình gây cảm ứng co giật bằng picrotoxin Khảo sát tác động gây co giật và tử vong của PTX trong 30 phút sau khi tiêm dựa vào thời gian khởi phát cơn, số cơn, thời gian co giật, thời gian mỗi loại cơn, khoảng cách giữa các cơn, thời gian tử vong và tỉ lệ tử vong(3), (5) và khả năng phối hợp vận động. Liều LD100 PTX được sử dụng để khảo sát tác động chống co giật và bảo vệ chuột khỏi tử vong của PĐ nọc bò cạp và NL197. DZP 5 mg/kg uống 60 phút trước khi tiêm PTX được sử dụng đối chứng. Điều kiện sử dụng các chất là 0,1 mL/10 g thể trọng. Khảo sát tác động chống co giật của NL197 và các phân đoạn nọc bò cạp trên mô hình picrotoxin và so sánh với diazepam Trong thử nghiệm NL197, lô chứng uống nước cất, NL197 dạng hỗn dịch uống(8). Trong thử nghiệm nọc bò cạp, lô chứng SC dung dịch sinh lý, phân đoạn nọc SC 5 mg/kg. Sau 30 phút, tiêm PTX, SC. Ghi nhận các thông số khảo sát. Khảo sát tác động của các chất trên khả năng phối hợp vận động – Mô hình thanh quay Rotarod Huấn luyện chuột 2 ngày trước khi thử thuốc ở tốc độ 35 vòng/phút. Sau khi cho uống NL197 hoặc tiêm PĐ nọc bò cạp 30 phút hoặc uống DZP 60 phút, tiêm PTX, SC (liều LD100). Ghi nhận thời gian chuột bám trên thanh quay của mỗi lô. Khảo sát sự thoái hóa tế bào thần kinh – Phương pháp nhuộm mô tế bào Não chuột được đúc khuôn nến, cắt nhuộm với Hematoxylin Eosin (HE) và Cresyl violet (CV) và quan sát vùng hải mã dưới kính hiển vi quang học(1,2,6). Phân tích dữ liệu thống kê Dữ liệu được trình bày ở dạng số trung bình ± SEM. Phân tích bằng Mann-Whitney (Minitab 14), p<0,05 khác biệt có ý nghĩa thống kê. Dùng Sigma Plot 11.0 vẽ đồ thị. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 403 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Mô hình gây cảm ứng co giật bằng picrotoxin Hình 1. Thời gian khởi phát cơn (A), khoảng cách giữa các cơn (B), thời gian tử vong (C), số cơn (D), thời gian co giật (E) và tỉ lệ tử vong (F). ***p<0,001,**p<0,01,*p<0,05: so với PTX 5 mg/kg, SC; ##p<0,001: so với PTX 7 mg/kg, SC Trong mô hình gây co giật bằng PTX 8 mg/kg, SC, 100% chuột có biểu hiện co giật và tử vong. Như vậy, mô hình có thể áp dụng để khảo sát sơ bộ tác động chống co giật và bảo vệ chuột khỏi tử vong của NL197 và các PĐ nọc bò cạp. Tác động chống co giật của NL197 trên mô hình picrotoxin Hình 2. Thời gian khởi phát cơn (A), khoảng cách giữa các cơn (B), thời gian tử vong (C), số cơn (D), thời gian co giật (E) và tỉ lệ tử vong (F) ở chuột gây co giật bằng PTX 8 mg/kg, SC sử dụng NL197 PO 50, 73, 100 mg/kg, và DZP PO 5 mg/kg. ***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05: so với chứng, #p<0,001; ##p<0,001; ###p<0,001: so với DZP. . NL197 PO 50, 73 và 100 mg/kg và DZP PO 5 mg/kg đều có tác động chống co giật, kéo dài thời gian khởi phát cơn, khoảng cách giữa các cơn, thời gian tử vong và rút ngắn thời gian co giật có ý nghĩa so với lô chứng. Cả 3 liều NL197 đều làm giảm tỉ lệ tử vong so với lô chứng, trong T h ôøi g ia n k h ôûi p ha ùt cô n c o gi aä t (g ia ây ) 0 100 200 300 400 500 600 PTX 5 mg/kg (n=10) PTX 7 mg/kg (n=9) PTX 8 mg/kg (n=9) *** *** (A) (B) (C) K h oa ûn g ca ùch g iö õa c aù c cô n c o gi aä t (g ia ây ) 0 20 40 60 80 PTX 5 mg/kg (n=10) PTX 7 mg/kg (n=9) PTX 8 mg/kg (n=9) ** *** ## T h ôø i g ia n t ö û v on g (g ia ây) 0 500 1000 1500 2000 2500 PTX 5 mg/kg (n=10) PTX 8 mg/kg (n=9) PTX 7 mg/kg (n=9) ** ** T æ l eä t ö û v on g (% ) 0 20 40 60 80 100 PTX 5 mg/kg (n=10) PTX 7 mg/kg (n=9) PTX 8 mg/kg (n=9) (D) (E) (F) So á c ôn c o gi aä t 0 5 10 15 20 25 30 Toång soá côn co giaät Côn cuïc boä Côn toaøn theå * ** * ** PTX 5 mg/kg (n=10) PTX 7 mg/kg (n=9) PTX 8 mg/kg (n=9) T h ôø i gi a n c o gi aä t (g ia ây) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 * * Toång soá côn co giaät Côn toaøn theå Côn cuïc boä PTX 5 mg/kg (n=10) PTX 8 mg/kg (n=9) PTX 7 mg/kg (n=9) T h ô øi gi a n k h ôû i p h aù t cô n c o gi aä t (g ia ây ) 0 100 200 300 400 500 600 700 ED + PTX (n=10) DZP + PTX (n=10) NL197 50 m g/kg + PTX (n=10) NL197 73 m g/kg + PTX (n=10) NL197 100 m g/kg + PTX (n=10) ** *** ## *** *** K ho aû n g ca ùch g iö õa c aù c la àn c o gi aä t (g ia ây ) 0 10 20 30 40 50 60 70 ED + PTX (n=10) D ZP + PTX (n= 10 ) N L197 50 m g/k g + PT X (n=10 ) NL197 73 m g/k g + PTX (n= 10 ) NL197 100 m g/k g + PTX (n = 10 ) *** *** # ** ### *** ## (A) (B) (C) T h ôø i g ia n t ö û v on g (g ia ây ) 0 500 1000 1500 2000 2500 ** ** ** ED + PTX (n=10) DZP + PTX (n=10) NL197 50 m g/kg + PTX (n=10) NL197 100 m g/kg + PTX (n=10) NL197 73 m g/kg + PTX (n=10) K h ôn g có c h u ột t ử v on g (D) (E) T æ l eä t ö û v on g (% ) 0 20 40 60 80 100 ED + PTX (n=10) DZP + PTX (n=10) NL197 50 mg/kg + PTX (n=10) NL197 73 mg/kg + PTX (n=10) NL197 100 mg/kg + PTX (n=10) K h ôn g có c h u ột t ử v on g (F) S oá c ôn c o gi aä t 0 10 20 30 40 50 ** *** ## * ** * * * *** ## Toång soá côn co giaät Côn cuïc boä Côn toaøn theå ED + PTX (n=10) DZP + PTX (n=10) NL197 50 mg/kg + PTX (n=10) NL197 73 mg/kg + PTX (n=10) NL197 100 mg/kg + PTX (n=10) T h ôø i g ia n c o gi aä t (g ia ây ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 * * * * ** # ## * * * * T o ån g so á côn co g ia ät C ô n cu ïc b o ä C ô n toa øn the å E D + PT X (n = 10 ) D ZP + PTX (n = 10 ) N L1 97 50 m g /kg + PT X (n = 10 ) N L1 97 7 3 m g /kg + PT X (n = 10 ) N L1 97 10 0 m g /k g + P TX (n= 1 0) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 404 đó NL917 PO 100 mg/kg làm giảm tỉ lệ tử vong tốt nhất (60%). Tác động chống co giật của các phân đoạn nọc bò cạp trên mô hình picrotoxin Thời gian khởi phát cơn, khoảng cách giữa các cơn, thời gian tử vong, số cơn, thời gian co giật và tỉ lệ tử vong ở các lô sử dụng các PĐ nọc bò cạp SC 5 mg/kg, không khác biệt so với lô chứng tiêm nước muối sinh lý. Thử nghiệm khảo sát tác động của picrotoxin, NL197 và các phân đoạn nọc bò cạp lên chức năng phối hợp vận động – Mô hình thanh quay rotarod Hình 4. Ảnh hưởng của PTX (A) và tác động của NL197 (B) và các PĐ nọc bò cạp (C) trên chuột gây rối loạn phối hợp vận động bởi PTX SC 8 mg/kg. a: p<0,001: so với chứng trắng, b: p<0,001: so với chứng PO nước cất, c: p<0,001: so với chứng SC dung dịch sinh lý. PTX SC 5, 7 và 8 mg/kg làm giảm thời gian bám trên thanh quay so với lô chứng. DZP PO 5 mg/kg; NL197 PO 50, 73, 100 mg/kg và các PĐ nọc bò cạp SC 5 mg/kg kéo dài thời gian bám trên thanh quay bị giảm gây bởi PTX. Tác động của picrotoxin và các chất khảo sát trên tế bào vùng hải mã ( (A) (B) (C) (D) Hình 5. Mô thần kinh bình thường (A) và khi dùng PTX 5, 7 và 8 mg/kg (B,C và D) PTX SC 5, 7, và 8 mg/kg gây co cụm tế bào, màng tổn thương, mất nhân và thể Nissl. (A’) (B’) A B C D Hình 6. Mô thần kinh được bảo vệ bằng NL197 uống liều 50 mg/kg (A’), 73 mg/kg (B’), 100 mg/kg, (C’) và DZP uống liều 5 mg/kg (D’) trước khi gây độc bằng PTX liều 8 mg/kg, SC. T h ôø i g ia n ba ùm t re ân t h an h q u ay ( gi aâ y) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Khoâng duøng thuoác PTX 5 mg/kg PTX 7 mg/kg PTX 8 mg/kg a a a T h ôø i g ia n b aù m t re ân t h a n h q ua y (g ia ây ) 0 100 200 300 400 500 600 NaCl + PTX (n=8) Noïc PÑ1 5 mg/kg + PTX (n=8) Noïc PÑ2 5 mg/kg + PTX (n=8) Noïc PÑ3 5 mg/kg + PTX (n=8) c c c T h ôø i gi an b a ùm t re ân t h a n h q u ay ( gi aâ y) 0 200 400 600 800 ED + PTX (n=8) DZP + PTX (n=8) NL197 50 mg/kg + PTX (n=8) NL197 73 mg/kg + PTX (n=8) NL197 100 mg/kg + PTX (n=8) b b b b (A) (B) (C) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 405 Khi dùng DZP bảo vệ nhận thấy một số TB bị tổn thương nhưng ít co cụm hơn, TB còn màng, nhân và thể Nissl. Khi dùng NL197, màng bị tổn thương ít hơn, TB mất thể Nissl, nhân co cụm lại ít hơn so với lô chứng. Hình 7. Mô TK được bảo vệ bằng nọc bò cạp liều 5 mg/kg trước khi gây độc bằng PTX 8 mg/kg, SC. Màng TB tổn thương rõ, mất thể Nissl, TB co cụm thành đám. BÀN LUẬN Mô hình cảm ứng co giật bằng hóa chất có thể giúp định hướng sơ bộ chất có tác động chống co giật thông qua đánh giá các thông số khảo sát. Bên cạnh đó, dựa trên cơ chế cảm ứng của tác nhân có thể dự đoán cơ chế bảo vệ của từng chất thử nghiệm và định hướng nghiên cứu cho từng nhóm chất cụ thể. PTX là chất đối vận tại thụ thể GABAA gây tình trạng khử cực làm khởi phát các kích thích gây co giật động kinh. Trong mô hình cảm ứng co giật bằng Pentylentetrazol và Strychnin đã được nghiên cứu(7), NL197 thể hiện tác động chống co giật và bảo vệ chuột khỏi tử vong. Dựa trên cơ chế của chất gây cảm ứng PTX, Pentylentetrazol và Strychnin, NL197 có thể có cơ chế tác động liên quan đến thụ thể GABA. Để có kết luận chính xác hơn về cơ chế hoạt động của NL197 trên tác động chống co giật cần thực hiện thêm nhiều nghiên cứu trên các tác nhân cảm ứng khác kết hợp nghiên cứu trên cơ chế tế bào. KẾT LUẬN Trong mô hình cảm ứng co giật bằng PTX đã xác định được PTX liều 8 mg/kg, SC gây tử vong 100% thú thử nghiệm, dựa trên số liệu này để khảo sát tác động bảo vệ và giảm tỉ lệ tử vong trên chuột bị gây co giật bởi PTX. Trên mô hình cảm ứng co giật bằng PTX 8 mg/kg, SC, cả 3 liều NL197 là 50 mg/kg, 73 mg/kg và 100 mg/kg đều thể hiện tác động chống co giật làm kéo dài thời gian khởi phát cơn co giật, thời gian tử vong và khoảng cách giữa các cơn co giật; làm giảm thời gian co giật và tỉ lệ tử vong. Trong mô hình rotarod, NL197 làm tăng khả năng phối hợp vận động của chuột, làm kéo dài thời gian chuột bám trên thanh quay và thể hiện tác động bảo vệ tế bào thần kinh, làm tế bào ít bị tổn thương khi khảo sát sự thoái hóa tế bào thần kinh vùng hải mã. Các PĐ nọc bò cạp liều 5 mg/kg, SC chưa thể hiện tác động chống co giật và giảm tỉ lệ tử vong trên chuột khi gây co giật bằng PTX 8 mg/kg, SC và cũng như chưa thể hiện tác động bảo vệ tế bào thần kinh. Cả 3 PĐ làm màng tế bào bị tổn thương nhiều và có hiện tượng co cụm tế bào. Trong mô hình thanh quay rotarod, các PĐ nọc bò cạp thể hiện tác động làm tăng khả năng phối hợp vận động của chuột. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Acharya MM, Katyare SS (2006). Picrotoxin-induced convulsions alters rat brain microsomal membrane structural properties. Neuroscience Letters, 394(1): 9-12. 2. Andrew HF, Kenneth AJ, Jack R, Rolf Z (2006). Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. In: Spector and Goldman (eds). Basic Methods in Microscopy, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3. Asla P, Philip AS, Solomon LM (2006). Models of seizure and epilepsy. Elsevier Academic Press, pp 126-154. 4. Brodie MJ (2002). Staged approach to epilepsy management. Neurology, 58(5): 2-8. 5. Hans GV (2004). Drug Discovery and Eluvation pharmacological Assay Second Edition, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, pp 398. 6. Kiernan JA (2008). Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice 4th Ed., Bloxham, UK: Scion. 7. Lien Kieu Suong, Trinh Thi Phuong Lan, Vo Phung Nguyen (2009). Anti-convulsive activity of NL197, a derivative from 4(3H)-quinazolinon on chemical induced seizure mice. c015 - 13th International Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry, 30 November, 2009. 8. Nguyễn Xuân Dũng, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Ngọc Vinh (2008). Độc tính cấp và tác động dược lý của dẫn xuất 4(3H)- quinazolinon. Tạp chí Y học TP.Hồ Chí Minh, 12(1): 94-100. Ngày nhận bài báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014