Sơ lược về chitin và chitinase

- 1 - Phần I: Tổng quan tài liệu Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1. SƠ LƯỢC VỀ CHITIN VÀ CHITINASE I.1.1. Chitin • Cấu tạo chitin Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô định hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận. Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4- O-glycoside. Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ. Sự khác nhau này biểu hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngượïc xen kẽ nhau, ở Hình 1.1: Cấu trúc của chitin Nguyễn Quang Nhân - 2 - Phần I: Tổng quan tài liệu β-chitin thì cùng hướng và ở δ-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược. Dạng chiếm nhiều nhất là α-chitin. Hình 1.2: Cấu trúc chuỗi α-chitin • Phân bố và số lượng Chitin có mặt ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau. Ở nấm, chitin là thành phần chính yếu và kết hợp với các hợp chất khác tạo ra thành của khuẩn ty và bào tử nấm sợi như: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes. Ở những loài động vật không xương sống như: Crustacea (giáp xác), Onychophora (nhóm có móng), Myriapoda (đa túc) và Arachnida (nhện), chitin đóng vai trò là bộ xương ngoài dưới dạng phức hợp chitin-protein. Tỉ lệ chitin : protein thông thường khoảng 55 : 45 và tỉ lệ này thay đổi trong suốt quá trình phát triển và khác nhau giữa các loài. Ở Insecta (côn trùng), chitin là vỏ bọc cơ thể và màng bao chất dinh dưỡng. Ngoài ra, chitin còn có ở tảo lục và nhuyễn thể (Mollusca), trùng đốt (Annelida), ruột khoang (Coelenterata-Cnidaria). Ở các loài thực vật, chitin và đường amin đóng vai trò không quan trọng trong quá trình trao đổi chất hay về cấu trúc hình thái. Về số lượng, chitin là một trong ba loại polysaccharide phong phú nhất trong thiên nhiên (cellulose, tinh bột và chitin). Chitin là đứng ở vị trí thứ hai sau cellulose. Chitin và cellulose tương ứng với nhau về nhiều điểm về cấu tạo và Nguyễn Quang Nhân - 3 - Phần I: Tổng quan tài liệu chức năng. Về chức năng, chitin và cellulose đều là những polysaccharide cấu trúc. Về cấu trúc phân tử, chitin có cấu trúc tương tự cellulose ngoại trừ nhóm OH ở C2 được thay thế bằng một nhóm acetylamine. Chitin có thể thay thế một phần hay toàn bộ cellulose hoặc glucan trong thành tế bào nấm và vài loại tảo. • Đặc điểm khác Chitin không tan trong nước, dung dịch kiềm loãng và thuốc thử Schweitzer. Chitin có thể tan trong một số dung dịch như HCl đậm đặc, HNO3, acid fomic khan và một số muối trung tính. Nếu đun nóng chitin trong dung dịch kiềm mạnh, một phần nhóm N-acetyl bị khử (deacetyl hóa) tạo thành chitosan. Ngược lại, trong dung dịch HCl đậm đặc, quá trình thủy phân chitin xảy ra ở các nối -1,4-glycoside làm [β α]D từ -14o dần đổi sang +56o, sau đó là sự thay đổi ở các nhóm acetyl. Độ nhớt của chitin trong dung dịch acid nitric là 14,3.10-3 đối với chitin nguyên chất từ vỏ cua, 13,1.10-3 đối với chitin từ nấm. Các giá trị này xấp xỉ như nhau chứng tỏ trọng lượng của chúng gần như nhau. Trong việc định tính cũng như so sánh chitin từ những nguồn thực vật, động vật khác nhau, phương pháp nhiễu xạ tia X có lẽ là phương pháp vật lý duy nhất có ý nghĩa và có giá trị. Trong khi đó, các phương pháp định lượng chitin đều có độ chính xác giới hạn, những điều kiện cần thiết cho việc tinh chế chitin có khả năng làm thay đổi polysaccharide này, vì vậy khó đạt được chitin tinh khiết. Ngoài ra, người ta có thể tạo thành chitin từ Uridin-diphosphate-N-acetyl- D-Glucosamine nhờ enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) trích từ nấm. • Ứng dụng Với kỹ thuật chế biến hiện đại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm năng to lớn đặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến thực phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm. Nguyễn Quang Nhân - 4 - Phần I: Tổng quan tài liệu Chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phẩm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…). Chitin làm chất mang trong cố định enzym hay cố định tế bào, làm chất mang tạo các giá thể trồng cây cảnh. Còn chitosan, dẫn xuất của chitin, có độ bền dai, đàn hồi, có thể tạo thành các màng mỏng gần như trong suốt, sử dụng các màng chitosan để bảo quản các loại trái cây, làm màng bao thuốc, màng bao thực phẩm (thịt nguội, lạp xưởng…) còn làm nguyên liệu để cố định enzyme hay cố định tế bào vi sinh vật. Chitosan được đánh giá cao trong hàng loạt những ứng dụng trong y học như: băng bó và làm lành vết thương, màng thẩm tích, chỉ khâu vết thương tự tiêu huỷ, nhân tố ổn định liposome, diệt vi khuẩn, diệt virus, chống ung thư, chất làm giảm lượng cholesterol trong máu, chất kích thích của hệ thống miễn dịch. Sự phân hủy tự nhiên của chitin rất quan trọng không chỉ trong chu trình tuần hoàn của carbon và nitơ mà còn tạo ra các chất phản ứng hóa học quan trọng. Các đơn phân của chitin và chitosan là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN), là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột và viêm dạ dày [15]. Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối u, kháng nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có vai trò quan trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác. Hàng ngàn bài báo về chitin và các dẫn xuất của chúng đã được xuất bản cùng với khoảng gần 200 bằng sáng chế đã được lưu hành tại Mỹ. Các công trình nghiên cứu và bằng sáng chế về các chế phẩm này cũng đã xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới. Các nhà khoa học từ hàng chục nước trên thế giới trong đó có Mỹ và Nga đã tập trung lại 3 năm một lần để trao đổi các bài báo, nghiên cứu khoa học mới nhất về chitin và các dẫn xuất của chúng. Những điều đó cho Nguyễn Quang Nhân - 5 - Phần I: Tổng quan tài liệu thấy chitin và các dẫn xuất của chúng rất được quan tâm trên thế giới vì khả năng ứng dụng rất rộng cùng với những đặc tính đặc biệt của chúng. Hàng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới. Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ được thải ra hằng ngày từ ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản. Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và các loài giáp xác trên biển là nguồn cung cấp chitin tốt nhất. Trong vỏ tôm cua, chitin chiếm từ 20-50% trọng lượng khô, khoảng 12% trong tôm nước ngọt, còn lại là các chất vô cơ, chủ yếu là carbonate calci. Nếu tận dụng được nguồn cung cấp chitin này thì vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường, vừa tạo thành các sản phẩm thực sự có giá trị. I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) Chitinase (còn gọi là [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase]) là enzyme thủy phân chitin thành các đơn phân N- acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, động vật không xương sống, động vật có vú, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus. Chân khớp và nấm cần chitinase trong sự phân chia tế bào để tăng trưởng. Chitinase được tạo thành trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm. Đối với nấm sợi, chitinase tham gia nhiều chức năng như phân giải thành tế bào, nảy mầm bào tử, phát triển khuẩn ty và tự phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, đồng hóa chitin và ký sinh. Ở vi khuẩn, chitinase được tạo ra để sử dụng chitin làm nguồn carbon và Nguyễn Quang Nhân - 6 - Phần I: Tổng quan tài liệu năng lượng. Ở thực vật, chitinase là một phần của phản ứng chống lại sự xâm nhiễm và stress, phối hợp hoạt động với các protein phòng vệ khác [9]. Chitinase thương phẩm có giá rất đắt, đặc biệt là chitinase đã tinh sạch. Vì thế việc sử dụng enzyme thô trở thành thay thế thú vị trong việc tạo ra GlcNAc và các oligomer có nguồn gốc chitin [15]. I.1.2.1. Phân loại chitinase • Dựa vào cấu trúc phân tử: Chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thủy phân đường): - Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetylglucosaminidase. Trong họ này, chitinase từ các prokaryote chỉ có 2 motif trình tự ngắn được bảo tồn cao (bao gồm 1 gốc acid glutamic được bảo tồn) giống với enzyme của eukaryote (10% của toàn bộ các gốc giống nhau). Tuy nhiên, cả 2 loại chitinase đều có cùng domain xúc tác barrel (βα)8. Trong cả 2 enzyme, rãnh gắn cơ chất đều nằm ở đầu C của sợi β trong cấu trúc barrel (βα)8 và gốc acid glutamic cho proton xúc tác có 1 vị trí tương đương. Không giống với các glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng bất thường bao gồm việc tác động lên nhóm N-acetyl của cơ chất trên nguyên tử C anomer. Việc này dẫn đến việc tạo ra chất trung gian bao gồm vòng pyranose của glucosamine kết hợp với vòng 5 oxazoline. Nguyễn Quang Nhân - 7 - Phần I: Tổng quan tài liệu - Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme (EC 3.2.1.17) của động vật và phage, bao gồm motif cuộn α + β và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18. • Dựa vào trình tự amino acid: Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm: - Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có vùng đầu N giàu cysteine chứa khoảng 40 acid amin (giống với vùng đầu N ở hevein và các enzyme khác có ái lực đối với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C)(peptid nhận biết). Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác. Các vùng gắn chitin này không phải luôn đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính xúc tác enzyme mà chúng cần để tạo các đặc tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở nhiều loài khác nhau. Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở đầu C giúp định vị chitinase trên thành tế bào nấm men, đóng vai trò trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị em. Ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, các chitinase này nằm trong không bào và được cảm ứng từ sự nhiễm nấm, vi khuẩn hay virus Nguyễn Quang Nhân - 8 - Phần I: Tổng quan tài liệu [13]. Chitinase nhóm I của thuốc lá có vùng đầu C giàu cystein đóng vai trò là vùng gắn chitin [24]. - Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác có trình tự amino acid tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu đoạn giàu cysteine ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein nhóm II thuộc loại protein kháng bệnh và được tế bào tiết ra dưới nhiều điều kiện stress khác nhau. - Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II, nhưng rất giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang hoạt tính lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh và được tiết ra ngoại bào. - Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có đoạn giàu cysteine nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. - Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cysteine) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao. • Dựa vào phản ứng phân cắt: Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β- chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1=36kDa, pI1=5,3±0,2 và M2=40kDa, pI2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8). Nguyễn Quang Nhân - 9 - Phần I: Tổng quan tài liệu Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) từ đầu khơng khử tạo thành các sản phẩm chính là các chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2). N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D- glucosamin. Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N-acetyl-D- glucosamin. Ngoài ra, đối với chitosan - dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase (EC 3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tương ứng. I.1.2.2. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase • Chitinase vi khuẩn Vi khuẩn sản sinh enzyme chitinase nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng. Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase để có thể phân cắt được các loại chitin đa dạng trong tự nhiên. Như vậy, chitinase vi khuẩn đĩng vai trị quan trọng trong chu trình chitin trong tự nhiên. Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là ở nhóm Streptomycetes. Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm chitin-cơ chất của enzyme chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính enzyme chitinase sau quá trình chiết tách. Vi khuẩn Nguyễn Quang Nhân - 10 - Phần I: Tổng quan tài liệu tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường tạo nguồn carbon cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển. • Chitinase nấm Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, … đặc biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus … Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm. • Chitinase thực vật Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), lúa mạch đen, cà rốt, bắp cải, bắp, khoai tây, đậu Hà Lan, đậu nành, củ từ … và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase. Chitinase thực vật tồn tại chủ yếu ở các mô nhất định hoặc cơ quan sinh sản như hạt giống, củ, hoa và được cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân gây hại trên thực vật. Bên trong tế bào thực vật, chitinase nằm trong không bào cùng với các enzyme chống bệnh khác. Ví dụ các endochitinase mang tính base trong lá đậu tập trung trong không bào và có chứa hầu hết các hoạt tính chitinase nội bào. Nhờ vậy, không bào thực vật được xem tương tự như tiêu thể ở động vật. Bởi vì bản thân thực vật không có chứa cơ chất của những enzyme phân giải như chitinase và β-1,3-glucanase, sự tồn tại của những enzyme này cho thấy chúng có vai trò kháng khuẩn, kháng nấm ký sinh gây bệnh và cả côn trùng. Các protein kháng khuẩn (pathogenesis-related protein) khác nhau được phân lập từ thực vật bao gồm thionin, protein bất hoạt ribosome, defensin, Nguyễn Quang Nhân - 11 - Phần I: Tổng quan tài liệu β-1,3-glucanase và chitinase.nsLTP và các enzyme phân giải như Nhiều chitinase, giống như các protein khác đóng vai trò bảo vệ, có thể chịu được các protease ngoại bào, hoặc mang tính acid hoặc mang tính base (thông thường các protein mang tính acid được tiết vào apoplast hoặc môi trường ngoại bào, trong khi dạng base thường tập trung nội bào trong các không bào). Trình tự của các chitinase acid giống với các chitinase base, chỉ khác ở chỗ chúng không có vùng đầu N hevein. Xét về đặc tính phân cắt, chitinase thực vật thường là endochitinase phân cắt ngẫu nhiên. Một số chitinase thực vật có hoạt tính lysozyme cắt liên kết β- 1,4 giữa acid N-acetylmuramic và các gốc N-acetylglucosamine trong peptidoglycan. Ví dụ như chitinase phân lập từ đu đủ, Rubus hispidus và Parthenocissus quinquefolia. • Chitinase động vật Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được enzyme chitinase. Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ. Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu n