Bài giảng học phần Thực tập vi sinh vật kỹ thuật môi trường

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG CAO ĐẲNG CÔNG NGHIỆP TUY HÕA KHOA CÔNG NGHỆ HÓA    \ BÀI GIẢNG HỌC PHẦN: THỰC TẬP VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI TRƢỜNG DÀNH CHO SINH VIÊN BẬC CAO ĐẲNG NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT MÔI TRƢỜNG TUY HÒA – 2010 Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 2 CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM 1.1. Trang thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm 1.1.1. Máy móc a) Nồi hấp vô trùng ở áp suất cao ( autoclave): Dùng để khử trùng rất nhiều loại dụng cụ, môi trường nuôi cấy và một số nguyên liệu khác. Nó đạt hiệu quả cao nhất trong các thiết bị vô trùng vì nó sử dụng hơi nước bão hòa ở áp suất cao để đốt nóng môi trường. b) Tủ sấy: Thiết bị này được làm bằng kim loại chịu nhiệt. Phía bên trên tủ có nút điều chỉnh nhiệt độ tùy theo yêu cầu sử dụng. Nó dùng để khử trùng và làm khô các loại dụng cụ bằng sắt, bằng thủy tinh có khả năng chịu nhiệt cao. c) Tủ cấy vô trùng: Đó là thiết bị có cấu trúc dạng hộp, bằng kính, có khả năng vô trùng nhờ hệ thống đèn tử ngoại hoặc bộ phận thổi khí vô trùng. d) Dụng cụ lọc vi khuẩn: Dùng để khử trùng các loại môi trường không chịu được nhiệt độ và áp suất cao. e) Tủ ấm: Thiết bị này có khả năng duy trì nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi cấy để nghiên cứu các đặc điểm sinh lý vi sinh vật. g) Máy lắc: Thiết bị này dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi theo các chiều khác nhau một cách đều đặn để tăng lượng ooxxi hòa tan trong môi trường. h) Máy li tâm: Máy này dùng để tách sinh khối tế bào trong môi trường nuôi cấy hoặc tách các tiểu phần có độ lắng khác nhau trong thành phần của tế bào. i) Máy đo pH: Dùng để xác định pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật k) Cân phân tích: Dùng để định lượng các chất trong quá trình làm môi trường nghiên cứu vi sinh vật. 1.1.2. Các dụng cụ và thiết bị trong phòng thí nghiệm a) Phiến kính: Dùng làm tiêu bản trong nghiên cứu hình thái, sinh lý tế bào b) Lá kính: Dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản giúp cho việc quan sát, nghiên cứu vi sinh vật dễ dàng hơn. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 3 c) Phiến kính lõm: Phiến kính này giúp ta nghiên cứu khả năng di động, sự hình thành bào tử và các đặc điểm về sinh sản của tế bào vi sinh vật. d) Hộp lồng ( đĩa pêtri): Dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và phân lập của tế bào vi sinh vật e) Bình tam giác: Dùng để nuôi cấy, nhân giống, chứa các loại môi trường. Nó gồm nhiều loại: 100 ml, 250ml, 500 ml Trong đó loại 250 ml là được sử dụng nhiều nhất g) Que gạt: Dụng cụ này để phân lập, tuyển chọn tế bào vi sinh vật h) Que cấy: Gồm có 3 loại que cấy: que cấy đầu tròn, que cấy đầu nhọn, que cấy đầu hình thước thợ. Công dụng chủ yếu của nó để lấy giống, cấy truyền và làm tiêu bản vi sinh vật. i) Các nguyên liệu và dụng cụ khác: - Agar: Thường dùng ở dạng thạch dùng để nấu môi trường - Các loại thuốc nhuộm - Dầu bách hương: Dùng khi quan sát mẫu vật ở bội giác có độ phóng đại lớn của kính hiển vi - Axeton: Dùng để lau vật kính và các tiêu bản có dầu. - Vải xô: Dùng để lọc tiêu bản và làm nút bông: - Giấy lọc. - Giấy báo cũ dùng để bao gói các dụng cụ. - Bông thấm nước. - Bông mỡ ( không thấm nước) để làm nút bông cho ống nghiệm và bình tam giác. - Các loại dụng cụ để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật: dao, thớt, xoong nhôm, vá 1.1.3: Kính hiển vi: Là dụng cụ rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật. Nó cho phép ta quan sát, nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý tế bào nhờ khả năng phóng đại từ hàng chục đến hàng vạn lần hình ảnh của mẫu vật quan sát. Tùy theo yêu cầu mà người nghiên cứu có thể lựa chọn và sử dụng các loại kính hiển vi khác nhau a) Kính hiển vi thông thường:Dùng ánh sáng thường từ dưới chiếu lên. Kính này cho phép ta quan sát và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh lý nói chung của tế bào nên được sử dụng phổ biến trong giảng dạy và học tập. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 4 b) Kính hiển vi nền đen: Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu trúc đặc biệt của kính tụ quang nên ánh sáng chiếu vào mẫu vật từ phía bên. Kính này cho phép ta nhìn thấy các cấu trúc khó quan sát trên kính hiển vi thường, ở tiêu bản không nhuộm màu và tiêu bản các tế bào sống. c) Kính hiển vi đổi pha: Cũng dùng ánh sáng thường nhưng nhờ cấu trúc đặc biệt của kính tụ quang, vật kính, thị kính làm đổi pha dao động của ánh sáng. Kính này cho phép ta nhìn thấy rõ các cấu trúc nhỏ, rõ nét hơn như tiên mao, các lớp màng, không bào, ti thể d) Kính hiển vi huỳnh quang: Dùng chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bởi các chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác sẽ phát quang với màu sắc khác nhau cho phép ta phân biệt rõ chúng. e) Kính hiển vi điện tử: Dùng chùm tia điện tử với độ phân giải cao thay cho ánh sáng thường cho phép nhìn thấy ảnh của mẫu vật được phóng đại từ 30- 50 vạn lần. Có 2 loại: - Kính hiển vi điện tử truyền suốt: Dùng để nghiên cứu các đại phân tử sinh học. - Kính hiển vi điện tử quét: Dùng để nghiên cứu các cấu trúc có kích thước lớn hơn các đại phân tử sinh học. Tuy nhiên kính hiển vi điện tử thường được trang bị tạ các phòng thí nghiệm có quy mô lớn với các cán bộ chuyên môn có đủ trình độ và kinh nghiệm mới sử dụng được. 1.2. Quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi 1.2.1. Phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật 1.2.1.1 Phương pháp làm tiêu bản tạm thời: - Cách làm tiêu bản giọt ép: + Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi. + Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không để tạo thành bọt khí.Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống. + Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi. - Cách làm tiêu bản giọt treo: Dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích + Dùng phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn ở giữa. + Bôi vazolin quanh phần lõm của phiến kính. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 5 + Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính. + Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía đươi rồi đặt lên phần lõm của phiến kính. - Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu: a. Nguyên tắc: Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm. b. Cách nhuộm: + Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh meetylen 0,001% lên phiến kính. + Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm. + Đậy lá kính lên giọt dịch + Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40) 1.2.1.2 Phương pháp làm tiêu bản cố định: - Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định: 1. Làm vết bôi: 2. Cố định vết bôi: Các cách cố định : + Cố định bằng nhiệt: + Cố định bằng hóa chất: * Phương pháp này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao. * Người ta thường dùng các hóa chất là rượu và axeton để cố định vết bôi. * Cách cố định: Có thể thực hiện một trong những cách sau:  Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 950 ngâm vết booit ừ 5-15 phút. Với rượu CH3OH ngâm khoảng 2-5 phút.  Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút  Nhỏ vài giọt rượu 90-950 lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy vài lần rồi để khô. 1.2.2. Phương pháp nhuộm vi sinh vật 1.2.2.1 Nhuộm màu tiêu bản cố định a. Nguyên tắc: Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 6 - Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành các hợp chất màu đặc trưng bền vững. - Tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế bào mà chọn thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp. - Có 2 cách nhuộm chính: + Nhuộm đơn: Chỉ dùng một loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản + Nhuộm kép: Dùng đồng thời 2 hay nhiều thuốc nhuộm trên một tiêu bản. b) Cách nhuộm đơn: - Đặt tiêu bản lên cầu thủy tinh ( đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thủy tinh). - Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziel, để yên từ 1 -2 phút. - Rửa vết bôi bằng cách nghiên phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa. - Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn -Quan sát tiêu bản ở vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x100) dùng dầu soi. c) Nhuộm kép: Việc sử dùng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta có thể quan sát và phân biệt cấu trúc dễ dàng hơn. - Phương pháp nhuộm Gram : + Nguyên tắc:Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên 2 loại phức chât khác nhau.  Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram dương.  Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram âm.\ + Cách tiến hành:  Làm tiêu bản: * Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm 3 vết bôi trên phiến kính ( hai đầu và giữa phiến kính). * Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi theo thứ tự sau:Bên trái phiến kính là Bac. Subtilis bên phải phiến kính là E. Coli, ở giữa phiến kính là Bac. Subtilis trộn lẫn với E. Coli. * Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 7  Nhuộm tiêu bản: * Đặt 3 miếng giấy lọc lên ba vết bôi. * Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong một phút * Nhuộm lugol trong một phút * Rửa nước * Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. * Rửa nước * Nhuộm bổ sung Fuchsin hay saframin từ 10-30 giây * Rửa nước * Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu.  Kết quả: * Vết bôi của Bac. Subtilis màu tím – gram dương * Vết bôi trộn Bac. Subtilis với E. Coli có màu hồng lẫn màu tím * Vết bôi của E. Coli có màu hồng – gram âm. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 8 CHƢƠNG 2 NUÔI CẤY VI SINH VẬT 2.1. Chuẩn bị dụng cụ và nuôi cấy vi sinh vật 2.1.1. Chuẩn bị dụng cụ Qúa trình chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy bao gồm các bước sau: - Xử lý dụng cụ - Bao gói dụng cụ - Khử trùng dụng cụ 2.1.1.1 Xử lý dụng cụ 1. Nguyên tắc chung Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật sạch và trong, không bị nứt mẻ. 2. Phương pháp xử lý Phương pháp xử lý gồm 2 giai đoạn: trung tính dụng cụ và rửa dụng cụ a) Phương pháp trung tính dụng cụ: - Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7 - Hấp khử trùng dụng cụ ở 1200C trong 30 phút bằng nồi hấp. - Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra pH của nước trong dụng cụ. - Nếu nước có pH > 7 thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2% cho đến khi kiểm tra pH = 7 thì thôi. - Rửa kĩ bằng nước nhiều lần là dùng được. b) Phương pháp rửa dụng cụ: * Phiến kính: - Với phiến kính cũ( đã dùng làm tiêu bản) + Chùi sạch mỡ hoặc vazolin trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen hoặc ngâm tiêu bản vào dung dịch sunphôbicromat trong 48h. + Ngâm tiêu bản vào nước xà phòng và đun sôi trong 1h. + Rửa nước, để ráo. + Ngâm tiêu bản vào cồn 900 trong 12h. + Lau khô chúng bằng vải mịn rồi sấy khô. - Với phiến kính mới cần kiểm tra độ pH và xử lý để đạt độ trung tính * Ống nghiệm: Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 9 - Với các ống nghiệm cũ đã bị nhiễm khuẩn : + Hấp trùng ở 1200C trong 30 phút. + Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm đi. + Ngâm ống nghiệm vào nước ấm . + Rửa ống nghiệm bằng cách: Dùng chổi chấm xà bông hay tro bếp cọ xát vào thành ống đều khắp nhiều lần. Rửa nước 2- 3 lần. Úp ống nghiệm cho thật ráo nước và khô. Sấy khô ở 700C. - Với các ống nghiệm không nhiễm khuẩn hay chứa các vi khuẩn không gây bệnh thì không phải hấp khử trùng và tiến hành rửa như trên. * Đĩa pêtri: - Đặt ngữa đĩa petri trong lòng bàn tay trái. - Tay phải dùng dẻ có chấm tro hoặc xà bông xát vào 2 mặt của đĩa, các khe ở chân đĩa và thành đĩa. - Rửa nước 2 -3 lần. - Úp nghiêng các đĩa trong giỏ nhựa cho thật khô. * Các dụng cụ thủy tinh khác: phễu, chai lọ, bình cầu, bình tam giác. - Dùng giẻ với nước xà bông cọ rửa phần ngoại dụng cụ. - Dùng nước xà bông đặc lắc kĩ để rửa phần trong dụng cụ. - Rửa nước nhiều lần cho sạch và để ráo. * Nút ống cao su: - Phân loại các dụng cụ này theo kích thước to, nhỏ, tốt, xấu, sạch hay bẩn. - Ngâm từng loại riêng vào nước ấm ( 50 – 800C) trong 3- 4 h. - Cọ rửa kĩ trong nước xà bông. - Rửa nước lã nhiều lần. - Phơi nắng 2 -3h rồi cất đi dùng dần. 2.1.1.2 Bao gói dụng cụ 1. Nguyên tắc - Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô. - Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 10 2. Phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu: - Làm nút bông : cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que gạt. - Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh. 2.1.1.3. Khử trùng dụng cụ 1. Nguyên tắc - Sau khi khử trùng cần đảm bảo: + Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ. + Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật. 2. Các phương pháp khử trùng Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật có thể bị tiêu diệt dễ dàng trong các bào tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó. Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào: - Tính chất môi trường - Số lượng tế bào - Độ pH của vật định khử trùng. Do vậy, để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và các bào tử của chúng có trong dụng cụ khử trùng. 2.1.2 Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy vi sinh vật 2.1.2.1 Môi trường dinh dưỡng 1. Khái niệm - Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. - Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường. 2. Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng - Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. - Có độ pH thích hợp. - Có độ nhớt nhất định. - Không chứa các yếu tố độc hại. - Hoàn toàn vô trùng. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 11 3. Phân loại môi trường dinh dưỡng Người ta dựa trên cơ sở khác nhau để phân loại môi trường. a) Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc: Có 3 loại môi trường là: - Môi trường tự nhiên: Có thành phần môi trường là các sản phẩm tự nhiên như sữa, trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám. Thành phần hóa học của loại môi trường này không được xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm tự nhiên. - Môi trường tổng hợp: Là môi trường gồm các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. - Môi trường bán tổng hợp:Là môi trường mà thành phần gồm cả hóa chất lẫn các chất hữu cơ tự nhiên. b) Căn cứ vào tính chất lý học: Có thể chia môi trường thành 3 loại. - Môi trường lỏng ( dịch thể): Thành phần môi trường này không chứa thạch và thường được dùng để nghiên cứu quá trình vi tổng hợp của vi sinh vật. - Môi trường đặc: Trong thành phần môi trường này chứa 1,5 -2% agar hoặc 10 -20% gelatin và dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí của vi sinh vật. - Môi trường bán lỏng: Môi trường này chứa 0,35 – 0,7% agar. c) Căn cứ vào công dụng : Có thể gồm các loại môi trường sau: - Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều vi sinh vật khác nhau: - Môi trường chọn lọc: Là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu thế của 1 loài hay một nhóm vi sinh vật xác định nào đó. - Môi trường kiểm định: Là môi trường cho phép phân biệt được một số đặc điểm của một số loại vi khuẩn cần xác định. Thông thường người ta dùng chất chỉ thị màu hay một số hóa chất để tạo ra những phản ứng màu đặc trưng. Ví dụ: Môi trường kiểm định kháng sinh, môi trường lên men các loại đường. 4. Phương pháp làm môi trường Làm môi trường để thực hiện được việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng. a) Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường: Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 12 - Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật. - Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chát trong thành phần môi trường. - Đảm bảo các điều kiện hóa lí cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. b) Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng: - Pha chế: Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự + Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi hòa tan vào nước . + Môi trường đặc:  Cân agar rồi ngâm vào nước.  Cân hóa chất rồi hòa tan trong nước.  Vớt agar ra, vắt khô, bỏ vào xoong môi trường để đun. - Làm trong môi trường: Việc làm trong môi trường sẽ giúp dễ dàng quan sát sự phát triển của vi sinh vật, bao gồm các bước sau: + Cách 1 : Lọc bằng bông, vải thưa hay giấy lọc + Cách 2: Lọc bằng lòng trắng trứng gà. Cứ 1 lít môi trường dùng lòng trắng trứng gà.Lấy lòng trắng trứng + lượng nước bằng lượng lòng trắng đánh tan cho sủi bọt. Đỗ hỗn hợp dịch trứng và nước trên vào môi trường.Trộn đều, đun sôi 10- 15 phút.Để lắng rồi mới lọc. - Điều chỉnh độ pH của môi trường: + Người ta dùng HCl 10% hay NaCl 10%. Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác như H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3. + Sử dụng máy đo pH, và giấy quỳ để kiểm tra độ pH. - Phân phối môi trường vào dụng cụ: Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Trình tự phân bố như sau: + Môi trường cần được đun cho hóa lỏng rồi đổ qua phễu thủy tinh vào các dụng cụ. + Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường. + Tay phải kẹp nút bông và kéo ra. Bài giảng: Thực tập Vi sinh vật kỹ thuật Môi Trường 13 + Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại. + Chú ý:  Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường phân phối chiếm ¼ thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm.  Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm ½ - 2/3 thể tích của bình.  Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc các nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc. - Khử trùng môi trường: Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau. Các phương pháp khử trùng thường sử dụng là: phương pháp Pasteur, phương pháp Tyndal, phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn và phương pháp hấp hơi nước bão hòa ở áp suất cao.  Đối với các dụng cụ chịu nhiệt ( sứ, vải, thủy tinh) khử trùng ở 1,5 atm / 20 phút -30 phút.  Đối với dụng cụ chứa 1l môi trường trở lên thì hấp ở 1atm/30 phút.  Với các loại môi trường chứa đường dễ bị biến chất ở nhiệt độ cao thì hấp khử trùng ở 0,5 – 0,6 atm/15 phút. - Làm thạch nghiêng, thách đứng, đổ thạch vào đĩa Pêtri: + Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc.  Đặt ống nghiệm có môi trường lên g