Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin

Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 3 Giới thiệu chung 1.Rifamycin: Là nhóm chất kháng sinh trao đổi bậc hai, được thu nhận tự nhiên từ quá trình lên men vi khuẩn Amycolatopsis mediterranei, hoặc được tổng hợp. Nó là phân lớp của họ Ansamycin. Rifamycin đặc biệt có hiệu quả chống lại mycobacteria, nó được sử dụng để chữa trị bệnh lao, phong và các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây bệnh phong và lao gây ra. Rifamycin được dùng để tổng hợp nên những loại thuốc đặc hiệu cao, gồm các dẫn xuất Rifampicin (Rifampin), Rifabutin và Rifapentine. Rifamycins được phân lập lần đầu tiên năm 1957 từ quá trình lên men Streptomyces mediterranei ở phòng thí nghiệm Gruppo Lepetit SpA, Milan bởi Piero Sensi và Pinhas Margalith. Có tất cả 7 loại Rifamycins được tìm ra: Rifamycin A, B, C, D, E, S và SV. Trong đó, Rifamycin B được sản xuất công nghiệp đầu tiên. Lepetit nhận bằng sáng chế cho Rifamycin B ở Anh vào 8/1958, ở Mỹ vào 3/1959. Thuốc được sử dụng để chống lao từ 1960. Hình 1. Công thức cấu tạo của Rifamycin B và Rifamycin SV Vi khuẩn kháng rifampicin là do có sự thay đổi cấu trúc ở tiểu đơn vị beta của enzym ARN - polymerase. Tuy vậy, kháng thuốc của các vi khuẩn lao với rifampicin thường thấp hơn các vi khuẩn khác. Nên rifampicin được giành riêng cho điều trị nhiễm khuẩn lao và các nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn nhạy cảm đã kháng nhiều thuốc. 2. Sơ đồ tổng hợp Rifamycin B: Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 4 Hình 2. Sơ đồ tổng hợp AHBA, tiểu đơn vị cấu thành nên Riafamycin B Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 5 Hình 3. Tổng hợp Rifamycin B từ AHBA I. NGUYÊN LIỆU: 1. Giống: a) Streptomyces mediterranei: - Lĩnh giới: Bacteria - Giới: Eubacteria - Ngành: Actinobacteria - Bộ: Actinomycetales - Họ: Streptomycetaceae - Chi: Streptomyces - Loài: Streptomyces mediterranei S. mediterranei thuộc ngành xạ khuẩn (Actinobacteria) là vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. S. mediterranei là vi khuẩn Gram dương, khuẩn lạc hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể có dạng sợi, phân nhánh như nấm (myces). Hình 4. Streptomyces mediterranei Streptomyces mediterranei lần đầu tiên được phân lập năm 1957 từ một mẫu đất được thu thập ở bãi biển của thị trấn St Raphael miền Nam nước Pháp. Tên ban đầu được đưa ra bởi hai Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 6 nhà vi sinh vật học làm việc với công ty dược phẩm của Ý Group Lepetit SpA tại Milan, Grazia Beretta và Pinhas Margalith. Năm 1969 vi khuẩn này đã được đổi tên thành Nocardia mediterranei khi một nhà khoa học có tên Thiemann phát hiện thấy rằng nó có thành tế bào điển hình của các loài Nocardia. Sau đó, vào năm 1986 nó đã được đổi tên lần nữa thành Amycolatopsis mediterranei, như là loài đầu tiên của một giống mới, bởi vì một nhà khoa học có tên Lechevalier khám phá ra rằng thành tế bào của nó thiếu mycolic acid và nó không có khả năng bị tấn công bởi các thể thực khuẩn ăn Nocardia và Rhodococcus. b) Phân lập giống Streptomyces mediterranei: - Bào tử của Streptomyces mediterranei được xử lý với N-methyl-N'-nitroso-N-itroguanidine nồng độ 1 mg/ml với pH 9.0, trong 60ph ở 28°C. Bào tử đã được gây đột biến rửa, đổ lên hộp petri chứa môi trường agar Bennett. Sau 14 ngày nuôi cấy ở 28°C, khuẩn lạc nào còn sống sót sẽ được lựa chọn sản xuất Rifamycin B trên môi trường lỏng. Streptomyces mediterranei bị đột biến được gọi là M 18 ATCC 21789 2290 2240. - Một hệ thống nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình sản xuất Rifamycin B được ứng dụng dựa trên giống S. mediterranei, trong quá trình sinh trưởng trên môi trường agar Bennett nó sẽ tạo thành 6 dạng khuẩn lạc có hình thái khác nhau. Có sự tương quan rõ ràng giữa hình thái của khuẩn lạc và khả năng sản xuất Rifamycin B. Hiệu suất sản xuất Rifamycin cao nhất đạt được khi sử dụng khuẩn lạc có màu đỏ cam, hình hoa hồng trống ở giữa và đường kính dài 2-3mm. Tuy nhiên do tính chất thay đổi của những dạng thù hình còn có những cụm vi khuẩn có hình thái khác cũng thích hợp được lựa chọn để làm giống cho nghiên cứu. Hình 5. 6 dạng thù hình của khuẩn lạc - Từ hai phương pháp lựa chọn khuẩn lạc và gây đột biến giống S. mediterranei như trên các nhà khoa học đã tìm ra được giống S. mediterranei XC 9-25 có thể tổng hợp được 17,25g/l – 19,11 g/l Rifamycin B dùng cho sản xuất công nghiệp với năng suất lên men lên đến 60m3. - Trong bài này chúng ta sử dụng S. mediterranei XC 9-25 để sản xuất Rifamycin B. 2. Môi trường: Khuẩn lạc dạng 1 Khuẩn lạc dạng 2 Khuẩn lạc dạng 3 Khuẩn lạc dạng 4 Khuẩn lạc dạng 5 Khuẩn lạc dạng 6 Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 7 a) Hóa chất và nguyên liệu sử dụng trong quá trình gồm: Glucose ( ADWIC, Egypt) KNO3 ( ADWIC, Egypt) CaCO3 (E.Merck, Darmstadt, Germany) KH2PO4 (E.Merck, Darmstadt, Germany) CoCl2 (E.Merck, Darmstadt, Germany) Chất chiết nấm men Cao thịt Tinh chất malt Agar Tinh bột Peptone Bột đậu nành Bột yến mạch Bột cá Nước cất b) Môi trường lên men: 12% glucose, 2% bột đậu nành, 1% peptone, 0,5% bột cá, 0,8 % KNO3, 0,05% KH2PO4, 0,0001% CoCl2, 0,5 % CaCO3. II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: Quy trình sản xuất gồm 2 giai đoạn chính:  Lên men  Xử lý dịch lên men và tinh chế thu Rifamycin B Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 8 Sơ đồ khối: III. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: 1. Nhân giống:  Mục đích: gia tăng sinh khối vi sinh vật  Quá trình gồm 2 giai đoạn:  Cấy giống trên thạch nghiêng: - Tỉ lệ thành phần cho 1l môi trường: 4g chất chiết nấm men, 4g tinh chất mạch nha, 4g glucose, 20g bột yến mạch, 20g agar, nước cất cho đủ 1l. - Thời gian ủ: 7-8 ngày - Nhiệt độ: 28oC Tẩy màu Kết tinh Chưng cất Trích ly Lên men Nhân giống Nocardia mediterranei Môi trường Môi trường Tiệt trùng Rifamycin B Sấy Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 9 - Độ ẩm tương đối: 40%-50% Hình 6. Cấy giống trên thạch nghiêng  Cấy khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch sang môi trường lỏng: - Cấy giống vào erlen dung tích 250ml chứa 25 ml môi trường. - Thành phần môi trường: 2% tinh bột, 1,5% glocose, 1% peptone, 0,05% KNO3, 0,03% KH2PO4, 0,3% CaCO3. - Các erlen được đặt trên Rotary Shaker với tốc độ quay 220 rpm. - Thời gian nuôi cấy: 48h - Nhiệt độ: 28oC - Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10% (v/v) => Để lên men 30m3 môi trường cần có 120 erlen. Khi nhân giống cho các mẻ lên men tiếp theo ta có thể lấy 2ml canh trường của các erlen này cho vào erlen mới có thành phần giống như erlen đã lên men, bỏ qua giai đoạn cấy giống trên thạch nghiêng. Hình 7. Rotary Shaker Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 10 2. Tiệt trùng:  Mục đích: chuẩn bị môi trường vô khuẩn cho lên men.  Thiết bị tiệt trùng: YHC-20 - Nhiệt độ tiệt trùng: 130oC - Thời gian môi trường lưu ở nhiệt độ tiệt trùng: 6 phút - Năng suất tiệt trùng: 20m3/h - Lượng nước ngưng: 0,5m3 /h  Nguyên tắc hoạt động: - 8 . hơn 140o . 3,5m/s Hình 8. Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 11 Hình 9. Bộ đun nóng và bộ giữ nhiệt của YHC-20 Hơ 0,6 9 2,5 3 - ng 1,5 m3 a 100 n 130o ng 0,5m3 - n 90o . 9 - 6000 1,7m3. 35 p 50mm. 100m2. Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 12 i YHC- 77%. - . 3. Lên men:  Mục đích: Streptomyces mediterranei tổng hợp rifamycin B từ môi trường lên men.  Điều kiện lên men: - Lên men hiếu khí. Lượng oxy cung cấp chiếm 25% thể tích môi trường lên men. Hình 10. Mối quan hệ giữa nồng độ oxy thêm vào và lượng Rifamycin B thu được. - pH môi trường trước khi lên men: 6,4-6,6. pH được ổn định nhờ bổ sung amino nitrogen (NH2-N) liên tục trong suốt quá trình lên men với hàm lượng 8,96mg/l. => Oxy và ammonia phải tuyệt đối vô trùng. - Trong quá trình lên men phải bổ sung thêm glucose để hàm lượng glucsoe tối thiểu còn lại trong dịch lên men lá 1-1,5%. - Nhiệt độ lên men: 28oC. - Thời gian lên men: 9 ngày. - Tốc độ khuấy trộn: 130 rpm.  : - . 63m3 9 . Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 13 Hình 11 63m3: - - - - - - - - - - - - - - - - - o; 18- - ả 600-1000 150-200 ục 2000- . – 8, 12, 14. 110- . 6- c 120-1 60m2 45m2 600 n 2,4m. Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 14 0,25MP 130-140o 50 n 1m3/ (m3 5-6 n 8m. 0,28Mp n 2,7 30-25o n 500 / . - 8000 n 0,25 0,250. Hình 12. Những biến đổi trong quá trình lên men 4. Trích ly:  Mục đích: tách Rifamycin B ra khỏi dịch lên men  Phương pháp : Rifamycin B thường được trích ly ra khỏi dịch lên men bằng dung môi ethyl acetate, dịch lên men được điều chỉnh đến pH 2.0 bằng HCl, nhiệt độ 10oC. Nhằm hạn chế lượng Rifamycin B bị phân huỷ, quá trình trích ly được thực hiện trong thời gian rất ngắn trong thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh. Đồng thời, trong thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ các thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn.... để hạn chế tổn thất do phân huỷ Rifamycin B. Dịch lên men sau khi lọc được bơm trộn đồng thời với dung dịch HCl loãng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ và bơm song song cùng với dung môi trích ly vào trong thiết bị. Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4 - 10V dịch lọc /1V dung môi. Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 15 Trong một số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta có thể áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung môi, với lần đầu trích ly Rifamycin B bằng ethyl acetate; tiếp theo Rifamycin B lại được trích ly ngược sang dung dịch đệm phosphate, pH 7.38. Sau đó Rifamycin B lại được trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi ít hơn. Hình 13. Sơ đồ trích ly Rifamycin B  Thiết bị: Robatel BXP 520 (France) - Lưu lượng tối đa của dòng lưu chất qua thiết bị: 1500 l/min - Khối lượng tối đa của dòng lưu chất qua thiết bị: 140 kg - Nhiệt độ cho phép: 5-85oC. Chọn nhiệt độ trích ly là 10oC Hình 14. Máy trích ly Robatel BXP 520 Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 16 5. Chưng cất:  Mục đích: cô đặc dung dịch sau trích ly, thu hồi dung môi.  Nguyên tắc: dung môi ethyl acetate bay hơi ở nhiệt độ 77,2oC, còn Rifamycin B không bay hơi.  Phương pháp: - Chưng cất có hồi lưu sản phẩm đỉnh, cấp nhiệt gián tiếp bằng hơi nước. - Sử dụng tháp chưng cất nhiều mâm. - Nhập liệu ở giữa tháp. - Thu sản phẩm đáy có nồng độ Rifamycin B ≥ 70% - Nhiệt độ chưng cất 78oC. Hình 15. Sơ đồ tháp chưng cất 6. Tẩy màu:  Mục đích: để tẩy màu và loại bỏ một số tạp chất khác. Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 17  Phương pháp: Người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa Rifamycin B sau trích ly, sử dụng phổ biến nhất là than hoạt tính. Sau đó than hoạt tính được tách và rửa lại bằng sử dụng thiết bị lọc hút băng tải hoặc thiết bị lọc hút kiểu thùng quay. Phần than sau lọc được đưa đi chưng thu hồi dung môi và xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho các mẻ sau. 7. Kết tinh:  Mục đích: thu nhận Rifamycin B dưới dạng tinh thể.  Phương pháp: Việc kết tinh Rifamycin B dưới dạng tinh thể có thể được thực hiện rất đơn giản, bằng cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau khi tẩy màu một lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) tiến hành cô chân không ở nhiệt độ thấp, sau đó bổ sung mầm để Rifamycin B tự kết tinh. Có 2 phương pháp bổ sung mầm: - Mầm thêm vào là bột sản phẩm - phương pháp bỏ bột: dùng dung môi là cồn để khuấy bột để chúng phân bố đều và nhanh trong dung dịch với hàm lượng: 100-150g cho 1 tấn sản phẩm. - Mầm được chuẩn bị từ trước – phương pháp giống: thực hiện quá trình kết tinh tạo 1 sản phẩm rồi dùng nó làm nhân cho mẻ sau, phương pháp này tương đối dễ thao tác. Lượng giống cần phải thêm vào là 2% so với khối lượng dung dịch. Các thông số công nghệ của quá trình kết tinh là : - Nồng độ Rifamycin B trong dung môi: ≥ 70 % - Nồng độ muối acetat: 0,1% - Nhiệt độ kết tinh 28oC  Thiết bị kết tinh: Giống thiết bị cô đặc chân không, nhưng vì dung dịch đặc, đối lưu khó nên thiết bị truyền nhiệt có chiều cao thấp hơn và đường kính rộng hơn. Các thiết bị làm lạnh yêu cầu bề mặt tiếp xúc lớn, và có bộ phận khuấy đảo với tốc độ chậm để tránh tinh thể lắng xuống đáy thiết bị và tăng tốc độ kết tinh. Hệ thống thiết bị phải bao gồm cả hệ thống kiểm tra như: đo nhiệt độ, áp suất, hệ số quá bão hòa, kích thước và số lượng tinh thể... Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 18 Hình 16. Sơ đồ thiết bị kết tinh Sau khi kết tinh, tinh thể Rifamycin B được lọc tách bằng máy lọc hút thùng quay. Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, có thể tiến hành hòa tan và kết tinh lại Rifamycin B. 8. Lọc, sấy thu Rifamycin B tự nhiên:  Mục đích: đuổi hết dung môi trích ly, giảm hàm ẩm, hoàn thiện sản phẩm.  Phương pháp: Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không dưới 99,5%, chúng được lọc tánh tinh thể; tiếp theo rửa và làm khô sơ bộ bằng dung môi kỵ nước như izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi rồi sấy bằng không khí nóng đến dạng sản phẩm tinh thể Rifamycin B.  Thiết bị sấy chân không kiểu thùng quay (thích hợp cho dược phẩm) Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 19 Hình 17. Máy sấy chân không đảo trộn SZG-0.1 - Thùng sấy hình trụ ngang có 2 vỏ, vỏ ngoài được gia nhiệt bằng hơi quá nhiệt. Thùng sấy được quay đảo liên tục, nguyên liệu sấy bên trong luôn được tiếp xúc với bề mặt gia nhiệt. - Gia nhiệt kiểu gián tiếp nên tránh được ô nhiễm. - Thiết bị sấy chân không kiểu này hiệu suát tăng nhiều lần so với loại thông thường. - Nhiệt độ sấy: 80oC - Độ ẩm sau sấy: 3-5% IV. SẢN PHẨM 1. Một số chỉ tiêu sản phẩm của Rifamycin B: - Yêu cầu sản phẩm đạt độ tinh khiết trên 99,5% - Độ ẩm: 3-5% - Tinh thể Rifamycin B dạng kim, có màu vàng, đồng đều. - Đạt tiêu chuẩn: BP/USP/EP/CP/JP Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 20 Hình 18. Một số đặc tính hóa học của Rifamycin Hình 19. Rifamycin B (antibiotic) crystals 2.Các sản phẩm tổng hợp được từ Rifamycin B: Rifamycin B được sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm cần thiết khác: Rifamycin O, S, SV và Rifampicin. Dựa vào các phản ứng hóa học đặc trưng để chuyển từ Rifamycin B thu được thành Rifamycin: O, S, SV, Rifampicin. - Rifamycin B với sự có mặt của sodium persulphate, bị oxy hóa thành Rifamycin O. - Rifamycin O bị thủy phân bởi acid sulfuric và tetra-hydzofuan thành Rifamycin S. - Rifamycin S phản ứng với t-butyl-amine và manganese-di-oxide, sau đó thủy phân bằng acid ascorbic và acid sulfuric để tạo 3- formyl-rifamycin-SV (3FRSV). Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 21 - Giai đoạn cuối cùng là cho 3FRSV phản ứng với 1-amino-e-methyl và 1 số dung môi khác để tạo Rifampicin. Rifampicin: Hình 20. Rifampicin BD-05 Là sản phẩm tổng hợp từ Rifamycin B. Công thức: 3-{[(4-Methyl-1-piperazinyl)imino]-methyl}rifamycin. Rifampicin có tác dụng tốt với các chủng vi khuẩn Mycobacterium đặc biệt là Mycobacterium tuberculosis, vi khuẩn phong Mycobacterium laprae và các vi khuẩn cơ hội M.bovis, M.avium. Nồng độ ức chế tối thiểu với trực khuẩn lao là 0.1-2microgam/ml. Rifampicin còn là kháng sinh phổ rộng có tác dụng tốt với các vi khuẩn gram dương và âm (trừ cầu khuẩn đường ruột) như lậu cầu, não mô cầu, liên cầu, kể cả chủng kháng methicillin Haemophilus influenzae. Cơ chế tác dụng của Rifampicin: thuốc gắn vào tiểu đơn vị beta của ARN-polymerase, làm sai lệch thông tin của enzym này, do đó ức chế sự khởi đầu để tổng hợp ARN mới. Trên người ARN-polymerase ít nhạy cảm với thuốc nên ít độc, trừ khi dùng liều rất cao. VI. THÀNH TỰU KHOA HỌC Hàm lượng Rifamycin B sản xuất trên tế bào cố định bằng hạt alginate (alginate natri hoặc alginate canxi) cao hơn so với trên tế bào tự do. Hạt alginate có thể tái sử dụng thêm sáu lần lên men với môi trường sạch. Sản lượng khi tái sử dụng không giảm trong ba lần đầu, sau đó giảm dần. Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 22 Hình 21. Hạt alginate cố định tế bào Các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu để tạo ra các giống đột biến tổng hợp được nhiều Rifamycin hơn. Ngành công nghiệp kháng sinh cần phải tự động hóa và điều khiển các thông số lên men thông qua bộ vi xử lý. Kỹ thuật sản xuất thủ công cần phải loại bỏ dần. Phát triển công nghệ sản xuất Rifamycin không phải là công việc ngắn hạn, vì vậy việc cập nhật công nghệ là vô cùng cần thiết. Nguồn thông tin ít ỏi khiến việc cập nhật trở nên rất khó khăn. Báo cáo Công nghệ lên men Rifamycin 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Bạch Tuyết, Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, 360 trang, 1996. 2. Trương Thị Minh Hạnh, Giáo án môn học Công nghệ dược phẩm, Đà Nẵng, 2007. 3. Lê Văn Hoàng, Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học trong công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, 356 trang, 2004. 4. Nguyễn Lân Dũng, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, ( 5. W. R. Strohl, Biotechnology of antibiotics, edition 2, published by Information Health Care, 1997 6. Optimization of industrial production of rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei, African Journal of Biotechnology Vol. 3 (5), pp. 266-272, May 2004. 7. Scale-up of rifamycin B fermentation with Amycolatoposis mediterranei, Journal of Zhejiang University SCIENCE. 8. Robert M. Sterritt, Microbiology for environmental and public health engineers, John N. Lester publication, London, E and F. N Spon Limited, 1998. 9. H.-J. Rehm and G. Reed n cooperation with A. Puhler and P. S tadler, Biotechnology second Completely Revised Edition, Volume 7, 1997. 10. A key to pharmaceutical and medicinal chemistry literature by American chemical society, 1155 sixteen Street, NW. Washington DC, 6/1956. 11. 12. EXECUTIVE SUMMARY