Báo cáo Tổng kết khoa học và kỹ thuật : Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản

Bộ khoa học và công nghệ Viện ứng dụng Công nghệ Trung tâm sinh học thực nghiệm C6 Thanh Xuân Bắc, Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài: Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản TS.Hoàng Thị Kim HOa 6123 25/9/2006 Hà nội, 12-2005 Bản quyền 2005 thuộc TTSHTN Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Giám đốc TTSHTN trừ tr−ờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Thông tin về đề tài Tên đề tài: “Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản”. 1. Chủ nhiệm : TS. Hoàng Thị Kim Hoa Điện thoại (CQ) : 8549438 2. Địa chỉ cơ quan : C6- Thanh xuân bắc - Đống đa – Hà Nội. 3. Thời gian thực hiện : 12 tháng (từ tháng 1/2005 đến tháng 12/ 2005) 4.Cơ quan chủ trì thực hiện : Trung tâm Sinh học Thực nghiệm 5. Cơ quan chủ quản : Viện ứng dụng công nghệ 6. Tên tổ chức KH & CN: Trung tâm Sinh học Thực nghiệm 7. Kinh phí Tổng số : 218.000.000 đ (Hai trăm m−ời tám triệu đồng) 8. Từ ngân sách SNKH : 218.000.000 đ (Hai trăm m−ời tám triệu đồng) Cán bộ thực hiện đề tài Chủ nhiệm đề tài: TS. Hoàng Thị Kim Hoa, Trung tâm Sinh học thực nghiệm. Các cán bộ thực hiện chính: - CN Trần Bảo Trâm - Trung tâm Sinh học thực nghiệm - Ths. Nguyễn Trâm Anh- Trung tâm Sinh học thực nghiệm. - CN. Nguyễn Thanh Mai- Trung tâm Sinh học thực nghiệm. - CN. Nguyễn Thị Huyền - Trung tâm Sinh học thực nghiệm. Mục tiêu: - Đ−a ra qui trình phân lập làm sạch và bảo quản 5 giống vi tảo có giá trị dinh d−ỡng cao ứng dụng trong nhân giống thuỷ sản là Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris. - Từng b−ớc xây dựng tập đoàn giống tảo có chất l−ợng tốt để cung cấp cho các cơ sở sản xuất giống thuỷ sản. Nội dung: - Nghiên cứu qui trình bỏ tảo lạ và động vật phù du tạo 5 giống tảo thuần (Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris). - Nghiên cứu ảnh h−ởng của một số loại kháng sinh lên sinh tr−ởng của tảo và vi sinh vật. - Nghiên cứu bảo quản thử 5 giống tảo bằng kĩ thuật làm bất động. - Đề xuất qui trình phân lập làm sạch và bảo quản giống tảo. Chữ viết tắt TA – Ký hiệu kháng sinh thuộc nhóm carbonhydrat NĐKS – Nồng độ kháng sinh TN – Thí nghiệm D. salina – Dunaliella salina N. oculata – Nannochloropsis oculata T. chuii – Tetraselmis chuii Ch. vulgaris – Chlorella vulgaris I. galbana – Isochrysis galbana EPA – Eicosapentaenoic acid DHA – Docosahexanenoic acid 1 Lời mở đầu Trong một số công trình nghiên cứu tr−ớc đây chúng tôi đã giới thiệu về giá trị dinh d−ỡng của vi tảo biển và sự cần thiết sử dụng tảo làm thức ăn cho con giống trong nuôi trồng nhân giống nhân tạo các loài hải sản. Do các loài vi tảo biển có giá trị dinh d−ỡng cao, giàu các chất có hoạt tính sinh học rất phù hợp cho động vật biển giai đoạn còn non nên ở các n−ớc có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển, vấn đề sản xuất tảo ở các trại giống rất đ−ợc chú trọng. Kinh phí đầu t− cho việc sản xuất tảo chiếm tới 50% kinh phí của trại giống. ở n−ớc ta, trong những năm gần đây các loài vi tảo biển đã đ−ợc nuôi trồng phục vụ nhân giống hải sản ở nhiều trại giống. Tuy nhiên việc sản xuất tảo ở các trại giống hải sản hiện nay gặp rất nhiều khó khăn do ch−a có nguồn giống ổn định. Thực tế cho thấy các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi trồng đều bị nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du, làm giảm năng suất và chất l−ợng tảo, ảnh h−ởng đến quá trình sản xuất giống hải sản. Vì vậy cần có nguồn giống tốt để th−ờng xuyên cung cấp cho sản xuất. Việc nghiên cứu qui trình phân lập, làm sạch và bảo quản lâu dài một số giống tảo có giá trị kinh tế cao để cung cấp giống chủ động, ổn định, kịp thời cho việc sản xuất giống thuỷ sản tại các trại giống là hết sức cần thiết. 2 Phần I: Tổng quan tài liệu Các loài vi tảo biển có kích th−ớc bé, giàu dinh d−ỡng, giàu các chất có hoạt tính sinh học rất phù hợp để sử dụng cho động vật biển giai đoạn còn non. Vì vậy vi tảo đ−ợc sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản nh− là nguồn thức ăn t−ơi sống thiết yếu của động vật thân mềm 2 mảnh vỏ ( sò, điệp, ngao, vẹm, trai. . .), ấu trùng bào ng−, tôm, một số loài cá và động vật phù du sử dụng trong dây chuyền thức ăn phục vụ nuôi trồng thuỷ sản. Trong hơn bốn thập kỷ qua hàng trăm loài tảo đã đ−ợc thử nghiệm và đã chọn đ−ợc vài chục loài có khả năng nhân nuôi sinh khối ứng dụng trong thuỷ sản. Chúng thuộc ngành tảo lục (Chlorophycophyta), tảo khuê (Bacilariophyta) và tảo roi cụt (Haptophyta). Theo các tác giả Brown et al ( 1991, 1992, 1997, 1999), Renaud et al (1999), Knuckey et al (2002), các loại tảo này có kích th−ớc nhỏ, thành tế bào mỏng, dễ tiêu hoá, giàu dinh d−ỡng, hàm l−ợng protein, axit amin, lipít, cacbonhydrat và vitamin cao, thích hợp cho sinh tr−ởng của ấu trùng các động vật biển, đặc biệt các loài vi tảo này có hàm l−ợng a xít béo rất cao, trong đó có các axit béo không no mạch dài (DHA, EPA) chiếm từ 49,7-77,9% ở tảo lục và chroomonas, từ 19,8- 52,6% ở tảo diatoms và prymnesiophytes ). Các axít này rất cần thiết cho sinh tr−ởng và phát triển của động vật biển giai đoạn ấu trùng. (inquiries@aquafauna.com). Vì vậy các trại giống rất chú trọng đến việc nuôi tảo. Kinh phí để sản xuất tảo chiếm từ 15-50% kinh phí của trại giống. Để đảm bảo hiệu quả của quá trình sản xuất hải sản, cần có nguồn thức ăn tảo với chất l−ợng cao, muốn vậy nguồn giống tảo cho quá trình sản xuất sinh khối phải đạt chất l−ợng tốt. Th−ờng các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi trồng đều bị nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du. Để đáp ứng nguồn tảo giống cho các trại sản xuất th−ờng xuyên phải cung cấp giống mới (sạch, tốt) từ tập đoàn giống gốc. Vì vậy, giống cần đ−ợc th−ờng xuyên phân lập và bảo quản trong điều kiện thích hợp. ở các n−ớc có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển nh− Mỹ, úc, Tây Ban Nha, Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan, Hàn Quốc, Singapore … đều có các cơ sở cung cấp giống tảo chất l−ợng cao và các 3 dịch vụ đi kèm nhằm đảm bảo có giống tốt, cung cấp ổn định cho sản xuất. Tuy nhiên việc phân lập tảo gặp nhiều khó khăn do kích th−ớc tế bào tảo nhỏ, sống kết hợp với vi sinh vật và các loài ký sinh khác. Vì vậy việc tách vi khuẩn khỏi tảo là rất khó. Gerloff và cộng sự (1950), Kbutko (1961) đã làm sạch tảo lam bằng cách sử dụng tia cực tím. Tuy nhiên ph−ơng pháp này có nh−ợc điểm là có thể gây đột biến di truyền. Baccep và cộng sự (1989) đã sử dụng ph−ơng pháp cấy tảo trên thạch. Sau đó chọn khuẩn lạc mong muốn và cấy tiếp vào môi tr−ờng lỏng để tảo phát triển, tiếp tục lấy tảo từ môi tr−ờng lỏng cấy tiếp vào môi tr−ờng thạch. Quá trình đ−ợc lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đ−ợc tảo sạch. Cách phân lập này hiện nay vẫn đ−ợc sử dụng phổ biến.Tuy nhiên với ph−ơng pháp nh− trên tốn rất nhiều thời gian và cũng không loại bỏ đ−ợc vi khuẩn bám chặt vào lớp nhầy quanh tế bào tảo. Stein (1973) cho thấy tảo sạch cũng có thể nhận đ−ợc bằng cách rửa kỹ và sử dụng một hoặc nhiều loại kháng sinh để diệt khuẩn nh−ng không nêu sử dụng loại kháng sinh nào Để nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian phân lập, Alenkhina và cộng sự (2001) đã sử dụng chất diệt khuẩn Methiolat để tách vi khuẩn ra khỏi tảo lam. Kết quả cho thấy nồng độ Methiolat 2ppm có tác dụng diệt khuẩn nh−ng không làm ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của chủng tảo lam nghiên cứu. Việc nghiên cứu làm sạch khuẩn các loài vi tảo biển nói chung và các chủng tảo Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Isochrryis galbana, Tetraselmis chuii, Chlorella vulgaris còn ít đ−ợc công bố. Sau khi có đ−ợc tảo sạch, vấn đề giữ giống cũng rất quan trọng. Th−ờng tảo đ−ợc giữ ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thấp để hạn chế sinh tr−ởng. Tuy nhiên trong điều kiện này giống giữ không đ−ợc lâu, dễ nhiễm, chất l−ợng kém. Vì vậy, vấn đề bảo quản giống trở nên bức xúc và đ−ợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Morris (1978), Fenwick và cộng sự (1992), Pedro Canavate và cộng sự (1995), Hong Quan Liu và cộng sự (2004) đã nghiên cứu bảo quản một số loài tảo bằng kỹ thuật đông lạnh, ph−ơng pháp này đòi hỏi phải áp dụng một số ph−ơng thức đặc biệt nhằm hạn chế tổn th−ơng đối với tế bào (Moris, 1987) nh− dùng các chất chống đóng băng, điều khiển tốc độ làm lạnh, tốc độ làm ấm, 4 sử dụng các yếu tố điều hoà nhiệt độ, nồng độ muối,... Các tác giả trên cũng cho thấy: Có hai ph−ơng pháp đông lạnh là đông lạnh một b−ớc và đông lạnh hai b−ớc. Đông lạnh một b−ớc là tảo sau khi ủ, cho vào cọng rạ và đ−a thẳng vào nitơ lỏng (-196 o C) (Tsuzu, 1973; Beu-Amotz và Gilboa, 1980). Đông lạnh 2 b−ớc là đầu tiên tảo đ−ợc đông lạnh trong điều kiện có kiểm soát nhằm giảm h− hại do quá trình tạo băng, sau đó đ−a vào nitơ lỏng. Kết quả nghiên cứu của Pedro canavate và cộng sự (1995) cho thấy: Tuỳ theo ph−ơng pháp làm lạnh, nồng độ chất chống đóng băng, nồng độ muối, môi tr−ờng và đặc điểm của từng giống nên khả năng sống của tảo sau khi bảo quản rất khác nhau. Đối với Chaetoceros glacilis, tỉ lệ sống chỉ đạt 2,9-7,3%; Rodomonas baltica 2,2-3,1%; Isochrysis galbana từ 9,3-25,8%, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis gaditana và Nannochloropsis atomus không bị ảnh h−ởng bởi quá trình làm lạnh. Theo nhận xét của nhiều tác giả: bảo quản bằng kĩ thuật đông lạnh phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố. Ngoài ra trong quá trình đông lạnh, sự hình thành băng đột ngột có thể xảy ra làm h− hại tế bào (Moris, 1987), hơn nữa việc sử dụng các hoá chất chống lạnh gây độc đối với tế bào và có thể làm ảnh h−ởng đến khả năng sống của tảo. Điều này đã đ−ợc mô tả đối với tảo Chlorella (Moris.1976), tảo khuê (Mclellan, 1989) và Tetraselmis suecica (Fenwiek and Day, 1992). Ngoài ra, sử dụng kĩ thuật đông lạnh còn đòi hỏi một số thiết bị đặc chủng, chi phí cao, khó thực hiện. Vì vậy, công nghệ bảo quản mang tính −u việt hơn: ít phức tạp, chi phí thấp, phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm và cơ sở sản xuất đang đ−ợc các nhà khoa học nghiên cứu áp dụng. Đó là bảo quản tảo bằng cách làm bất động (immobilization) (Tamponet và cộng sự ,1985; Hertherg and Jensen, 1989; Susana Romo and Carmen Berer-Martiner ,1997; Yean- Chang-Chen, 2001,2003) .Kết quả nghiên cứu của Tamponnet và cộng sự (1985) và Hertzberg and Jensen (1989) cho thấy các giống tảo khuê đ−ợc làm bất động trong gel vẫn duy trì đ−ợc cấu trúc nguyên vẹn và hoạt tính sinh lí trong một số tháng, điều này gợi ý có thể sử dụng kĩ thuật này trong bảo quản giống tảo. Tuy nhiên các tác giả trên cũng l−u ý rằng trong 7 giống tảo thí nghiệm thì chỉ có 2 giống tảo Phaeodactylum tricornutam và Skeletonema costatum là cho kết quả 5 tốt. Tác giả Susana Romo and Carmen Perez Martinez (1997) đã thử nghiệm kĩ thuật làm bất động để bảo quản giống tảo lam Pseudanabaena galeata Bocher (cyanobacteria) và đánh giá khả năng sống, đặc điểm sinh lí, sinh hoá và cấu trúc của chúng sau thời gian bảo quản 14-18 tháng. Kết quả cho thấy tảo sau khi đ−ợc bảo quản tỉ lệ sống đạt 93%, sinh tr−ởng tốt, không có sự khác biệt về cấu trúc tế bào, sinh hoá và tốc độ sinh tr−ởng giữa tảo thí nghiệm và tảo đối chứng. Các tác giả trên nhận xét việc xử lí d−ờng nh− không có ảnh h−ởng đến khả năng sinh tr−ởng và chức năng của tảo Pseudanabaena galeata, hàm l−ợng C, H, N và P trong tế bào tảo đ−ợc bảo quản và tế bào tảo đối chứng không có sự khác biệt đáng tin cậy. Tảo sau khi bảo quản đ−ợc đ−a vào môi tr−ờng thích hợp để sinh tr−ởng. Tác giả Yean-Chang-Chen (2001) đã nghiên cứu kĩ thuật làm bất động Scenedesmus quadricauda trong hạt gel để bảo quản tảo lâu dài. Tảo đ−ợc cố định bằng kĩ thuật làm bất động vẫn giữ đ−ợc hoạt tính sinh lí sau 3 năm bảo quản trong điều kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 4o C, không có môi tr−ờng dinh d−ỡng. Sau khi cho vào môi tr−ờng thích hợp trong 4 tuần, số l−ợng tảo đã tăng lên 40 lần. Kết quả quan sát cho thấy sau quá trình bảo quản dài ngày, một số cơ quan tử (pyrenoids) của Scenedesmus quadricauda bị tiêu huỷ. Tuy nhiên cơ quan tử này sẽ phục hồi khi đ−a vào điều kiện nuôi thích hợp về dinh d−ỡng và ánh sáng. Kết quả nghiên cứu của Yean – Chang - Chen (2003) đối với tảo Haptophyta; Laz E. de Bashan và công sự (2002) đối với tảo Chlorella và Azospirillum cho thấy giống tảo sau khi bảo quản bằng ph−ơng pháp làm bất động có độ nảy mầm cao, sinh tr−ởng tốt và đặc biệt là chi phí bảo quản thấp. Giống có thể bảo quản đ−ợc 1 – 3 năm vẫn đảm bảo chất l−ợng tốt. Qua những kết quả thu đ−ợc, các tác giả trên nhận xét có thể sử dụng kĩ thuật làm bất động để bảo quản tảo lâu dài trong phòng thí nghiệm và ứng dụng vào thực tế sản xuất nuôi trồng thuỷ sản nhằm giảm chi phí sản xuất so với các ph−ơng pháp truyền thống. ở n−ớc ta trong những năm gần đây, tảo đã đ−ợc sử dụng làm thức ăn t−ơi sống phục vụ nhân giống hải sản (tôm, cá, bào ng−, ngao, sò, động vật hai 6 mảnh vỏ...). Hiện nay nhu cầu về tảo trong các trại giống rất lớn. Nh−ng để sản xuất tảo mang lại hiệu quả nh− mong muốn, vấn đề giống là khâu đặc biệt quan trọng. Các cơ sở nhân giống thuỷ sản lớn nh−: Trạm nhân giống thuỷ sản n−ớc mặn tại Cát Bà, trạm nghiên cứu nhân giống thuỷ sản n−ớc lợ Quí Kim Đồ Sơn Hải Phòng, một số cơ sở nuôi trồng thuỷ sản ở Miền Trung (Nha Trang, Khánh Hoà, Cửu Hội, Nghệ An) đều có bộ phận nhân nuôi tảo phục vụ −ơm nuôi con giống. Tuy nhiên giống tảo sử dụng tại các trại giống hiện nay chủ yếu là nhập từ n−ớc ngoài, trong quá trình sử dụng giống th−ờng bị nhiễm dẫn đến giảm chất l−ợng. Các cơ sở này ít có điều kiện phân lập làm sạch. Vì vậy vấn đề sản xuất tảo nhân nuôi con giống gặp nhiều khó khăn. Ngoài ra, việc giữ giống th−ờng đ−ợc thực hiện bằng cách nuôi tảo trong môi tr−ờng lỏng, trong tủ mát với nhiệt độ 15-17oC. Trong điều kiện này tảo phát triển nhanh và dễ bị nhiễm tạp tảo lạ và vi khuẩn. Hiện nay công nghệ bảo quản bằng kỹ thuật làm bất động ở Việt Nam ch−a đ−ợc nghiên cứu áp dụng. Vì vậy việc nghiên cứu qui trình làm sạch tảo (bao gồm phân lập, loại bỏ tảo lạ, động vật phù du và làm sạch khuẩn tiến tới xây dựng tập đoàn giống có chất l−ợng tốt và nghiên cứu kỹ thuật nhằm bảo quản lâu dài các giống tảo nhằm chủ động phục vụ sản xuất là hết sức cần thiết. Với mục đích trên chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản”. 7 Phần II. Đối t−ợng và ph−ơng pháp nghiên cứu. II.1. Đối t−ợng nghiên cứu. Đối t−ợng nghiên cứu là tảo Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris. Tảo Dunaliella salina và Chlorella vulgaris đ−ợc lấy từ tập đoàn giống của Trung tâm sinh học thực nghiệm. Tảo Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Tetraselmis chuii đ−ợc lấy từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I, Hải phòng. Dunaliella salina là tảo đơn bào, màu xanh lục, kích th−ớc tế bào 7-12àm. Tế bào có dạng hình ovan, không có màng cứng bằng xenlulloza bao bọc mà chỉ có màng nguyên sinh chất, có khả năng chuyển động liên tục trong quá trình sống nhờ roi ở đỉnh. Tảo sinh sản bằng hình thức vô tính chia dọc hay ngang tế bào. Dunaliella salina chứa nhiều loại sắc tố đặc biệt là β-caroten (chiếm từ 8- 14% trọng l−ợng khô), hàm l−ợng dinh d−ỡng cao, axit béo không no chiếm 77,9% tổng l−ợng axit béo, Dunaliella salina rất thích hợp để làm thức ăn cho một số loài động vật biển. Nannochloropsis oculata có màu xanh, kích th−ớc nhỏ 2-4àm thành tế bào mỏng thích hợp làm thức ăn cho luân trùng. Đặc điểm của tảo Nanochloropsis oculata là hàm l−ợng axit béo không no omega-3 fatty unsaturated fatty acids (HUFAs) rất cao ( từ 16-42%) trong đó chủ yếu là EPA. (Eicosapentaenoic acid). Trong tảo chiếm một l−ợng lớn vitamin B12, vitamin này có ảnh h−ởng tốt đến tỉ lệ sống và sinh tr−ởng của ấu trùng cá. Vì vậy, Nannochloropsis oculata là tảo đ−ợc nuôi trồng phổ biến nhất trong các trại nuôi trồng thuỷ sản để phục vụ công tác nhân giống động vật biển. Isochrysis galbana có màu nâu vàng, có lông roi, kích th−ớc từ 4-7àm. Tảo này đ−ợc nuôi trồng phổ biến để làm thức ăn cho động vật hai mảnh vỏ (ngao, sò ...), kết hợp với tảo Chlorella hoặc tảo khác để làm thức ăn cho luân trùng. Hàm l−ợng axit béo không no EPA trong tảo Isochrysis galbana chiếm 2- 3,5% và DHA 3,5-4%. 8 Tetraselmis chuii thuộc loài tảo lục, kích th−ớc 9-14àm, đ−ợc sử dụng nhiều trong nuôi trồng thuỷ sản. Trong tảo chứa khoảng 5% EPA và 7% DHA, đặc biệt trong tảo này có chứa axit béo 20 : 5n-3 và sterol 24-methychlesterol hoặc 24-methylenecholesterol với hàm l−ợng cao. Các hợp chất trên có rất ít trong thực vật phù du và rất thích hợp cho sinh tr−ởng của ấu trùng động vật biển nói chung và động vật thân mềm 2 mảnh vỏ nh− ngao, sò, hầu (Wikfors et al, 1991) Chlorella vulgaris là tảo lục giàu dinh d−ỡng đ−ợc sử dụng nhiều trong nuôi trồng thuỷ sản, ngoài việc làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng động vật biển (tôm, động vật 2 mảnh vỏ) ở một số giai đoạn phát triển, Chlorella vulgaris còn có tác dụng rất tốt trong xử lí n−ớc ao nuôi, gây màu n−ớc... II.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu Ph−ơng pháp phân lập, làm sạch tảo: dịch tảo đ−ợc làm sạch sơ bộ bằng cách lọc qua vải lọc hoặc bông để loại bỏ tạp chất, tảo sợi và động vật phù du. Sau đó tiến hành ly tâm để xác định tốc độ và thời gian ly tâm thích hợp đối với từng chủng tảo, dựa vào đó có thể ly tâm tách tảo để thu đ−ợc sinh khối chủng tảo mong muốn. Từ sinh khối tảo thu đ−ợc tiến hành phân lập theo 2 ph−ơng pháp: phân lập trên môi tr−ờng thạch và phân lập trong môi tr−ờng lỏng bằng ph−ơng pháp pha loãng. -Phân lập trên môi tr−ờng thạch: Mẫu tảo sau khi pha loãng đ−ợc cấy vào đĩa thạch có chứa dinh d−ỡng phù hợp với loài cần phân lập. Tảo đ−ợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng 1500lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 18oC. Sau 15-20 ngày, tảo mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, chọn khuẩn lạc mong muốn, dùng que cấy tách khuẩn lạc đã chọn cho vào môi tr−ờng lỏng, quá trình lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đ−ợc tảo mong muốn (không lẫn tảo lạ) Phân lập trong môi tr−ờng lỏng: Tảo sau khi đã làm sạch sơ bộ, đ−ợc pha loãng sao cho mỗi giọt có một tế bào tảo, sau đó chuẩn bị các ống nghiệm có môi tr−ờng dinh d−ỡng. Nhỏ vào mỗi ống nghiệm 1 giọt tảo đã đ−ợc pha loãng. 9 Để các ống nghiệm trong điều kiện ánh sáng yếu (1000lux) để tảo phát triển, sau 2-3 tuần kiểm tra để chọn ống nghiệm có tảo mong muốn. Sau khi thu đ−ợc tảo thuần, dùng kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn, thu tảo sạch khuẩn. Công việc đ−ợc tiến hành nh− sau: 1) Bổ sung kháng sinh vào môi tr−ờng thạch sau đó cấy dịch tảo lên mặt đĩa thạch để theo dõi sinh tr−ởng của vi khuẩn nhằm xác định sơ bộ loại kháng sinh, nồng độ kháng sinh thích hợp để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi tảo. 2) Bổ sung kháng sinh trực tiếp vào dịch tảo, sau đó theo dõi sinh tr−ởng của tảo và sự phát triển của vi khuẩn nhằm xác định chính xác loại kháng sinh và nồng độ kháng sinh thích hợp để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi dịch tảo. Sinh tr−ởng của tảo đ−ợc xác định bằng cách đo mật độ tảo (chỉ số OD) trên máy quang phổ (Đối với tảo Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata,, Chlorella vulgaris đo ở b−ớc sóng 640 nm, Isochrysis galbana đo ở b−ớc sóng 520nm). Xác định sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo bằng cách cấy dịch tảo lên môi tr−ờng thạch có chứa dinh d−ỡng phù hợp cho sinh tr−ởng của vi khuẩn và kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn để xác định nồng độ và loại kháng sinh thích hợp cho việc loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi tảo. Sinh tr−ởng của vi khuẩn đ−ợc tính bằng số khuẩn lạc hoặc diện tích