Báo cáo Ứng dụng áp suất cao trong bảo quản và chế biến thịt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO MÔN HỌC CNCB THỊT & THỦY SẢN Đề tài ỨNG DỤNG ÁP SUẤT CAO TRONG BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN THỊT GVHD: Th.S Nguyễn Thị Hiền SVTH : HC07TP NĂM HỌC 2010- 2011 MỞ ĐẦU Theo xu hướng toàn cầu hóa, các nhà sản xuất các sản phẩm thịt đang phải cạnh tranh gay gắt với nhau. Để giữ vững và nâng cao vị trí của họ, các công ty thực phẩm và thịt cần quan tâm đến sự thay đổi trong thói quen mua sắm và tiêu thụ sản phẩm của người tiêu dùng, cũng như quan điểm và nhu cầu của họ. Nhu cầu của người tiêu dùng thay đổi liên tục nhưng một vài quan điểm chính không thay đổi. Nhìn chung, người tiêu dùng luôn đòi hỏi chất lượng cao và sự tiện dụng của các sản phẩm thịt, với mùi vị tự nhiên. Bên cạnh đó, họ còn yêu cầu sự an toàn và các sản phẩm phải tự nhiên không bổ sung phụ gia như các chất bảo quản, chất giữ ẩm… Để đáp ứng tất cả những yêu cầu này mà không làm giảm độ an toàn thực phẩm cần phải áp dụng các công nghệ mới trong công nghiệp thực phẩm nói chung và trong công nghiệp thịt nói riêng. Hơn nữa, các sản phẩm thịt đóng gói chân không dạng lát mỏng và dạng ướp là những dòng sản phẩm có nhu cầu gia tăng rất cao trong vài năm gần đây. Những sản phẩm này có khả năng nhiễm khuẩn trước khi đóng gói. Vì thế, giải pháp cần thiết là ứng dụng các kỹ thuật mới cho các dòng sản phẩm trên. Hiện nay, một vài công nghệ mới đang được nghiên cứu trong đó áp suất cao là một phương pháp có tiềm năng ứng dụng rất cao. Áp suất cao là một kỹ thuật rất hứa hẹn đối với các sản phẩm thịt và nó cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các dòng sản phẩm mới tiêu thụ ít năng lượng. Lịch sử phát triển: Giáo sư PW Bridgman (1914), một người tiên phong trong vật lý áp suất cao, báo cáo về albumin lòng trắng trứng và lòng đỏ bị đông tụ dưới áp suất thủy tĩnh cao 500-600 MPa mà không có sự phân rã của lớp vỏ. Điều này cho thấy rằng áp suất thủy tĩnh cao (cao áp) là một công cụ hữu ích cho chế biến thực phẩm thay vì xử lý nhiệt. Tuy nhiên ứng dụng của áp suất cao để chế biến thực phẩm đã gần như bỏ qua cho đến khi sự khởi đầu của dự án "Phát triển áp suất cao lên men sử dụng Dense-Mass" được hỗ trợ bởi Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thuỷ sản (1989) tại Nhật Bản . Đặc biệt, các nhà khoa học về thịt ở Úc đã tiến hành áp dụng áp suất cao kể từ đầu những năm 1970 (Macfarlane 1973; Bouton, Ford, Harris, Macfarlane, O'Shea 1977). Kể từ khi khởi phát của các dự án tại Nhật Bản, việc áp dụng áp suất cao để chế biến thực phẩm đã thu hút nhiều sự chú ý ở Nhật Bản và Châu Âu bởi vì những thay đổi trong đặc tính của nguyên liệu thực phẩm gây ra bởi áp suất trong các phương thức khác nhau từ nhiệt (Cheftel 1992 ; Hayashi 1992; Johnston 1995; Knorr 1996). Một số loại thực phẩm được chế biến bằng việc sử dụng áp suất đã có mặt trên thị trường. (Suzuki 2002). Nhìn chung, áp suất cao sử dụng trong khoảng 100-600 MPa tại nhiệt độ phòng. Áp suất cao làm phá hủy các tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn và vô hoạt enzyme, nhưng không làm thay đổi đặc điểm bề ngoài của sản phẩm và giữ lại một số vitamins. Tuy nhiên, khả năng chịu đựng của vi sinh vật rất khác nhau phụ thuộc vào giống và loại thịt được xử lý. Ảnh hưởng của xử lý áp suất cao cũng phụ thuộc vào áp suất sử dụng, nhiệt độ và thời gian. Sử dụng áp suất cao có thể gây ra những biến đổi đặc biệt về cấu trúc của sản phẩm và khả năng này có thể được sử dụng để phát triển một dòng sản phẩm mới hoặc gia tăng chức năng của một số thành phần nào đó. Vì thế, để có thể áp dụng kỹ thuật này trên quy mô công nghiệp với các nghiên cứu từ phòng thí nghiệm cần tiến hành: Thiết lập các điều kiện xử lý tốt nhất cho mỗi loại sản phẩm. Kết hợp áp suất cao với các hệ thống đóng gói mới, các chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên, enzyme… Ảnh hưởng của áp suất cao trong công nghiệp thịt Ảnh hưởng của áp suất cao lên các thành phần dinh dưỡng trong thịt Thịt là môi trường tốt cho sự phát triển của vi sinh vật, thành phần hóa học của thịt chủ yếu là nước, protein (15-21%), chất béo (0,5-25%), các vitamin (giàu vitamin nhóm B) và các oligonutrient. Theo quan điểm vật lý, khi gia tăng áp suất sẽ có một ảnh hưởng vật lý lên các phân tử làm chúng tiến lại gần nhau hơn dẫn đến sự chuyển pha, sự chuyển pha này có thể đảo ngược lại sau khi giảm áp. Điều này là những gì đã xảy ra với nước và chất béo. Theo quan điểm hóa học, áp suất cao tác động nhẹ hơn so với nhiệt độ. Các liên kết cộng hóa trị không bị phá vỡ nhưng các liên kết yếu như liên kết hydro và liên kết kỵ nước có thể bị biến đổi bất thuận nghịch (Cheftel, 1995). Ảnh hưởng của áp suất lên nước chủ yếu bao gồm sự giảm nhiệt độ nóng chảy và gia tăng sự ion hóa dẫn đến sự giảm pH. Những biến đổi này là thuận nghịch theo áp suất. Nhưng chúng góp phần làm biến đổi những đặc điểm của sản phẩm được xử lý áp suất cao. Calpastatin bị ức chế tại áp suất từ 200MPa trở lên trong khi calpain bị thoái hóa ở áp suất trên 400MPa. Tại áp suất thấp hơn 200MPa các lysosome bị phá vỡ, khả năng tự phân gia tăng và thịt mềm hơn. Cathepsin H và aminopeptidase bị vô hoạt ở áp suất từ 200MPa trở lên và cathepsin D bị vô hoạt khi áp suất đạt tới 500MPa (Montero & Gomez-Guillen, 2002). Các vitamin và đường trong thịt không bị biến đổi bởi áp suất cao nhưng các polysaccharide có thể bị biến đổi. Nhìn chung, sự hình thành gel bị ức chế bởi áp suất cao vì áp suất cao có thể biến đổi nhiệt độ chuyển pha từ sol đến gel. Sự đông lại có thể được tạo ra bởi áp suất và sau đó gel tạo thành sẽ mềm và sáng hơn.. Cấu trúc chính của protein bị ảnh hưởng nhẹ bởi áp suất cao, sự biến đổi các liên kết yếu có thể làm biến tính protein hoặc ngược lại làm hoạt hóa enzyme. Các ảnh hưởng này rất khác nhau phụ thuộc vào loại protein và điều kiện của quá trình xử lý. Áp suất cao mang lại sự chuyển pha thuận nghịch cho lipid từ lỏng thành rắn dẫn đến sự đông lại. Nếu là một hỗn hợp lipid, áp suất cao có thể tạo ra sự phân tách các pha khác nhau bằng việc phá hủy các tế bào membrane. Cheah và Ledward (1996) cũng nghiên cứu các ảnh hưởng của áp suất về quá trình oxy hóa chất béo trong cơ bắp băm nhỏ. Trên cơ sở dựa vào số đo của acid thiobarbituric (TBA), họ chỉ ra rằng trị giá TBA không tăng trong cơ bắp băm nhỏ tiếp xúc với áp suất cao lên đến 200 MPa, sau đó hơi tăng lên khi áp suất là 300 MPa, và tăng rõ rệt khi 800 MPa. Áp suất cao trên 300 MPa đến 400 MPa sẽ làm giảm myoglobin và oxymyoglobin, Fe2+ myoglobin trở thành Fe3+ metmyoglobin và protein globin bị biến tính., từ đó làm gia tăng quá trình oxy hóa lipid. Ngoài ra, nguyên nhân của sự gia tăng còn có thể do các kim loại trong thịt nằm trong các muối phospholipids hoặc muối acid hữu cơ với kim loại. Vì thế trong quá trình áp suất cao, các ion kim loại (có thể là Fe và Cu) đã giải thoát ra khỏi các phức chất này và xúc tác phản ứng oxy hóa chất béo. Hoặc sự gia tăng oxy hóa chất béo trong thịt ở áp suất cao có thể do sự thay đổi cấu tạo của hemoprotein làm bộc lộ các nhóm heme xúc tác oxy hóa chất béo. Ngược lại, Orlien và Hansen (2000) đã báo cáo quá trình oxy hóa lipid ở áp suất cao không liên quan đến việc giải phóng các nonheme sắt hay hoạt tính xúc tác của metmyoglobin, nhưng có thể liên quan đến sự phá hủy membrane. Theo Cheftel và Culioli (1997), sự oxy hóa gây ra bởi áp suất có thể được hạn chế các quá trình công nghệ cho các sản phẩm thịt, bằng cách đóng gói sản phẩm hay sử dụng các chất chống oxy hóa. Loại bỏ oxy hoặc thêm dioxide carbon (CO2) trước khi xử lý áp suất cao để ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid. Ảnh hưởng của áp suất cao đến độ mềm thịt Khi một con vật được giết mổ, quá trình co cứng sẽ phát triển trong vòng vài giờ với sự co của các sợi cơ và làm tăng độ nhớt của thịt. Miếng thịt sau đó sẽ mềm nhưng hương vị bị giảm sút đáng kể, và thịt đó thì không phù hợp cho nấu ăn và chế biến vì độ nhớt cao và khả năng giữ nước thấp. Nếu thịt được giữ ở nhiệt độ thấp trong một vài ngày, thịt trở nên mềm mại và giữ trạng thái đó trong vài tuần tiếp theo. Vì vậy, quá trình sử dụng rộng rãi nhất cho thịt với cải tiến của hương vị và mùi được gọi là conditioning và aging. Nếu những miếng thịt dai, đặt biệt là từ những con động vật già có thể được làm mềm bởi áp suất cao thì áp suất cao có tiềm năng lớn trong việc tận thu nguồn nguyên liệu từ thịt của các con vật già, tránh lãng phí. Một thử nghiệm để tăng độ mềm của thịt bởi áp suất cao lần đầu tiên được thực hiện bởi Macfarlane (1973) ở Úc. Một điều rất quan trọng là phải lựa chọn thời gian nào của thịt sau khi giết mổ thích hợp cho việc áp dụng áp suất cao. 2.2.1. Ảnh hưởng của áp suất cao lên cơ trước giai đoạn tê cứng: Macfarlane (1973) đã thực hiện các phép đo khác nhau trên các cơ Biceps femoris tại 100 MPa trong 2-4 phút. Kết quả cho thấy các cơ rút ngắn khoảng 35% so với các cơ không được xử lý áp suất. Tuy nhiên các phép đo lực cắt chỉ ra rằng áp suất làm tăng độ mềm của thịt. Kết quả nghiên cứu của Macfarlane cho thấy rằng việc sử dụng áp suất cao trong vài phút ở nhiệt độ môi trường đã làm giảm lực cắt lên cơ trước tê. Phương pháp làm tăng độ mềm cho thịt bởi áp suất cao cũng đã được báo cáo trong các tài liệu của Macfarlane (Macfarlane, Mckenzie, Turner, và Jones năm 1981; Macfarlane và Morton 1978) và những người khác (Elgasim và Kennick 1982; Kennick, Elgasim, Holmes, và Meyer 1980; Riffero và Holmes 1983). 2.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý nhiệt và áp suất cao lên cơ sau giai đoạn tê cứng Mặc dù việc sử dụng áp suất tác động lên cơ trước tê cứng là một cách hiệu quả trong việc xử lý độ dai của thịt. Quá trình còn có tiềm năng áp dụng cho thịt sau tê cứng. Bouton et al. (1977) chứng minh rằng cơ sau tê cứng của trâu, bò sẽ không đạt được biến đổi như vậy khi sử dụng lực cắt tương tự, trừ khi sử dụng áp suất cao ở nhiệt độ cao. Họ nói rằng khi áp suất là 150 MPa ở 60oC trong 30 phút là cần thiết để cải thiện giá trị cắt. Locker và Wild (1984) cũng cho rằng áp suất- nhiệt (PH) có hiệu quả trong việc giữ mềm thịt sau một thời gian đáng kể tại một nhiệt độ cao. Macfarlane (1985) đã trình bày một đề án bao gồm việc áp suất làm phân giải các protein và mức độ mềm thịt bằng cách kết hợp áp suất với nhiệt độ. Trong đề án của mình, các protein bị phân giải bởi áp suất cao là biến tính và không thể kết hợp bằng cách xử lý nhiệt, kết quả là làm mềm thịt. Việc sử dụng PH thì hiệu quả trong việc khắc phục độ dai. Tuy nhiên, quá trình này có ảnh hưởng không tốt cho thịt do màu nâu tạo ra bởi áp suất và nhiệt. 2.2.3. Cải thiện độ mềm của cơ sau tê cứng bằng cách sử dụng áp suất cao. Từ góc độ của các ứng dụng thương mại khi sử dụng áp suất cao, độ mềm của cơ sau tê cứng thì quan trọng hơn cơ trước tê cứng. Suzuki, Kim, Honma, Ikeuchi, và Saito (1992) đo độ cứng và độ đàn hồi của cơ bắp vai sau tê cứng thu được từ một con bò sữa già khi sử dụng áp suất cao từ 100-300 MPa trong 5 phút bằng máy Rheo Meter (Fudoh Công ty, Nhật Bản. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể nào về độ đàn hồi. Điều này cho thấy cơ sau tê cứng có thể được làm mềm bằng áp suất cao mà không cần xử lý nhiệt. Việc sử dụng P-H trong thời gian dài được Macfarlane đề xuất (1985), còn những người khác (Bouton et al 1977;. Riffero và Holmes 1983) thì cho rằng không cần thiết phải kết hợp với nhiệt độ trong việc làm mềm cơ sau tê cứng nếu áp suất sử dụng cao hơn so với trong thí nghiệm. Cơ chế làm mềm và sự gia tăng những biến đổi của thịt khi sử dụng áp suất cao Ta biết rằng thịt của con vật sau khi chêt sẽ bị mềm sau một khoảng thời gian nhất định do những thay đổi xảy ra trong cơ, chủ yếu là do tác động của các protease nội sinh: - Sự suy yếu của tương tác actin-myosin - Phân mảnh của tơ cơ thành các phân đoạn ngắn do Z-line tan rã - Sự thoái hóa của các sợi đàn hồi bao gồm connectin (còn gọi là titin) - Suy yếu của mô liên kết. Để làm rõ cơ chế gây ra áp suất làm mềm thịt hoặc việc tăng tốc các biến đổi của thịt, các đối tượng sau đây đã được xem xét: - Áp suất ảnh hưởng lên tương tác của actin-myosin - Áp suất ảnh hưởng đến sự phân mảnh của tơ cơ, - Áp suất ảnh hưởng đến sự chuyển đổi a-connectin thành b -connectin - Áp suất ảnh hưởng lên mô liên kết Các ảnh hưởng từ sự tương tác của actin-myosin. Quá trình tương tác của actin-myosin và cơ cấu của các sợi cơ được biến đổi trong thời gian con vật sau khi chết được minh chứng bằng những thay đổi trong hoạt tính ATPase của tơ cơ. Ouali (1984) báo cáo rằng hoạt tính ATPase gia tăng tại cường độ ion thấp (khoảng dưới 0,2 M KCl), trong khi nó giảm ở những cường độ cao hơn (0,3 M hoặc cao hơn) khi gia tăng thời gian bảo quản. Ông kết luận rằng giá trị nghiêng (giá trị xác định sự nhạy cảm với cường độ ion) có thể là một thông số chỉ thị chính xác về mức độ lão hóa của cấu trúc các sợi cơ và được thể hiện bằng các chỉ số sinh hóa của Miofibrillar Aging (BIMA). Nishiwaki, Ikeuchi, và Suzuki (1996) đo hoạt tính của ATPase (cường độ ion là khoảng 0,06-0,32 M KCl) của các cơ được xử lý bằng áp suất cao (30-300 MPa, 5 phút) và ở 4oC trong 7 ngày. Sự thay đổi giá trị BIMA được hiển thị trong hình 8.1. Đối với cơ được xử lý như trên, giá trị BIMA tăng dần với sự gia tăng của thời gian lưu trữ và đạt khoảng 2,5 lần so với các cơ của con vật chết (hình 8,1). Giá trị BIMA của các tơ cơ gia tăng khi tăng áp suất lên 200 MPa và đạt đến mức giống như của các tơ cơ để ở 4oC trong 7 ngày. Tuy nhiên, khi áp suất cao hơn (300 MPa) sẽ làm sụt giảm đáng kể giá trị của BIMA. Sự thay đổi cấu trúc của các sợi mỏng gây ra bởi áp suất là yếu tố chính ảnh hưởng đến giá trị BIMA thu được trong các sợi cơ khi sử dụng áp suất cao trong một thời gian ngắn (5 phút). Những thay đổi cấu trúc mạnh mẽ được quan sát từ những sợi cơ được xử lý áp suất , những thay đổi đó không quan sát thấy trong các sợi cơ không xử lý bằng áp suất. Kết quả này gợi ý rằng việc áp dụng áp suất cao cho các sợi cơ là nguyên nhân gây ra những thay đổi trong hoạt tính của ATPase và giá trị BIMA của các sợi cơ. Hình 1: Ảnh hưởng của áp suất cao và thời gian lên giá trị BIMA Ảnh hưởng đến sự phân mảnh của tơ cơ Các tơ cơ khi sử dụng các điều kiện đồng hóa thì ngắn hơn và tạo ra những khúc cơ ngắn hơn là của những miếng thịt sau khi giết mổ (Takahashi, Fukazawa, và Yasui 1967) và sự phá vỡ các tơ cơ tại Z-line thì liên quan đến sự gia tăng độ mềm thịt (Davey và Gilbert 1967; Fukazawa và Yasui 1967; Takahashi et al 1967). Do đó sự phân mảnh các sợi tơ cơ được coi là hữu dụng để dự đoán sự mềm của thịt (Calkins và Davis năm 1980; Olson, Parrish, và Stromer 1977). Suzuki, Watanabe, Iwamura, Ikeuchi, và Saito (1990) cho thấy mức độ phân mảnh trong tơ cơ từ các bắp thịt trâu, bò với áp suất (100-300 MPa, 5 phút) trong hình 8.2. Mức độ phân mảnh được thể hiện như tỷ lệ phần trăm của số cơ tơ đoạn gồm 1-4 sarcomeres (khúc cơ) để tổng số tơ cơ dưới kính hiển vi tương phản pha. Mức độ phân mảnh, thì ít hơn 10% so với các cơ bắp không được xử lý áp suất, đã được tăng tốc bằng cách tăng áp lên hơn 30%, 70%, 80%, và 90% tương ứng tại 100, 150, 200, và 300 MPa. Mức độ phân mảnh, 80% đến 90%, trên mức tối đa của các phân mảnh của tơ cơ trong các cơ tự nhiên. Từ các kết quả của sự phân mảnh này là sự tiếp xúc ngắn của các cơ sau tê cứng trong điều kiện áp suất cao có vẻ là hữu ích cho quá trình làm mềm thịt. Hình 2: Ảnh hưởng của áp suất cao lên mức độ phá vỡ tơ cơ Các yếu tố đặc trưng trong những báo cáo của Suzuki et al. (1990) đó là tác động của áp suất cao đến cấu trúc myofibrillar (sợi cơ tơ) sau tê cứng trong các bắp thịt trâu, bò. Trong tơ cơ được xử lý tại 100 MPa, quá trình co của các sarcomere được quan sát, và sự khác biệt trong mật độ giữa các A-band và I-band trở nên đồng nhất so với các mẫu bình thường (không qua xử lý). Đánh dấu sự vỡ của cấu trúc dạng sợi của I-band và sự biến mất của các M-line được quan sát trong tơ cơ của các cơ bắp tại tại áp suất 150 MPa. Trong tơ cơ của các cơ bắp tại 200 MPa, mạch liên tục cấu trúc của sarcomere đã gần như hoàn toàn bị mất, với tấm A-và I-sợi trải rộng trên các khúc cơ này. Sự biến mất của M-line và sự dày lên của Z-line, có thể là do sự co rút của I-filament, đã được quan sát. Sự phân tách của các A-band, thêm vào đó nhiều thay đổi đã được đề cập và được quan sát trong tơ cơ của các cơ bắp tại áp suất 300 MPa. Chiều dài của các sarcomere(khúc cơ), được xử lý tại 100 MPa, dường như đã dần dần phục hồi với sự gia tăng áp suất, vì những mất mát ngày càng nhiều của kết cấu liên tục. Như đã đề cập, phân mảnh của tơ cơ có nguồn gốc từ sự đứt đoạn của tơ cơ tại Z-line, trong khi các Z-line từ tơ cơ bị phân mảnh trong các cơ bắp được xử lý áp suất vẫn còn nguyên vẹn. Mặc dù việc xử lý áp suất cho các cơ sau tê cứng diễn ra trong thời gian ngắn (5 phút) và nhiệt độ thấp (khoảng 10oC), thì sự thay đổi siêu cấu trúc (ultrastructure) của tơ cơ phù hợp với những báo cáo của Macfarlane và Morton (1978) và Locker và Wild (1984). Việc áp dụng áp suất cao được biết là ảnh hưởng của tình trạng kết hợp của cả hai actin và myosin, đó là những thành phần chủ yếu của tơ cơ. Một số báo cáo mô tả sự khử polymer của actin-F (Ikkai và Ooi 1966; Ivanov, Bert, và Lebedeva 1960; O'Shea, Horgan, và Macfarlane 1976), myosin polymer (Josephs và Harrington 1966, 1967, 1968), và actomyosin (Ikkai và Ooi 1969) dưới áp suất cao đã được công bố. Mặc dù nó không rõ liệu sự khử polymer của actin-F xảy ra trong cơ và sự suy thoái của các sợi-I. (tức là, sự khử polymer của F-actin do áp suất cao) có thể là một trong những nguyên nhân của sự phân mảnh. Một khả năng làm tăng tốc sự phân mảnh của tơ cơ và đông tụ của các myofibrillar protein tại nơi phân tách đã được Macfarlane đề nghị (1985) có thể làm tăng độ mềm của thịt khi sử dụng áp suất cao. Từ những quan sát và phân tích ultrastructural SDS-PAGE của tơ cơ (dữ liệu không được hiển thị, Suzuki et al 1990)., Cơ chế cho sự rối loạn trong cấu trúc liên tục của tơ cơ gây ra bởi áp suất trong các điều kiện khác nhau. Ảnh hưởng từ sự chuyển đổi a-Connectin thành b-Connectin Nghiên cứu gần đây cho thấy một cách rõ ràng rằng một protein, thường được gọi là connectin (còn gọi là titin) duy trì tính đàn hồi và tính ổn định cơ học của cơ xương. Lúc chết, các a-connectin (khoảng 3.000 kDa) tồn tại cùng với một lượng nhỏ các phân đoạn phụ của nó, b-connectin (khoảng 2.000 kDa; Maruyama, Kimura, Yoshidomi, Sawada, và Kikuchi 1984; Wang, McClure và Tu 1979).  Hình 3: Biểu diễn kết quả chạy điện di trong gel 2% polyacrylamide chứa 0,1% SDS và 0,5% agarose. Chú thích: - a = a-connectin - b = b-connectin - 1200k = 1200 kDa peptide - N = nebulin - M = chuỗi myosin lớm Bởi vì khi sử dụng áp suất cao không tạo nên các chuỗi peptid , do đó nó được quan tâm để giải thích những nghi ngờ rằng tại sao việc chuyển đổi a-connectin thành b-connectin được gây ra bởi áp suất. Có hai lý thuyết về cơ chế tách connectin; một là sự phân hủy protein bởi calpain (protease làm tăng hoạt tính Ca2+) và cathepsin D (Kim et al 1993, 1995;. Suzuki, Kim, và Ikeuchi 1996), và hai là các phản ứng trực tiếp của ion Ca2+ (Tatsumi, Hattori, và Takahashi năm 1996). Báo cáo của Kim et al. (1993) cho thấy rằng hiệu quả của áp suất cao lên các connectin trong isolated myofibrils (cơ riêng biệt) tương tự như của connectin trong cơ bắp, được quan sát những phân tích của SDSPAGE. Họ tìm thấy hai loại chất ức chế protease, 1 mM leupeptin và 1 mM E64, hoàn toàn ngăn chặn sự suy thoái của connectin (100-400 MPa cho 5 phút), mặc dù các tơ cơ bên trong đều có sự hiện diện của 3mM CaCl2. Như vậy giả thiết về sự suy thoái của connectin do tác động trực tiếp của các ion canxi dưới áp suất cao như vậy là không thể xảy ra. Kết quả này chứng minh sự tham gia của một số protease nội sinh, đặc biệt là calpain, trong việc chuyển đổi a-connectin thành b-connectin. Điều này có thể được giải thích bằng cách giả sử rằng sự mẫm cảm của connectin đối với calpain được tăng rõ rệt bởi việc áp dụng các áp suất, nhưng khả năng của calpain để thủy phân connectin được giảm dần với tăng áp suất. Nó đã được chứng minh rằng áp suất cao 100 MPa hoặc cao hơn thì sẽ làm tăng tính mẫm cảm đến quá trinh proteol