Bước đầu đánh giá hiện trạng vi khuẩn kháng sinh trong mẫu nước mặt trên địa bàn TP. Hồ Chí Minh

Kỷ yếu Hội nghị: Nghiên cứu cơ bản trong “Khoa học Trái đất và Môi trường” DOI: 10.15625/vap.2019.000214 597 BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HIỆN TRẠNG VI KHUẨN KHÁNG SINH TRONG MẪU NƯỚC MẶT TRÊN ĐỊA BÀN TP. HỒ CHÍ MINH Trương Thông1,2, Lê Thái Hoàng1*, Phạm Thị Phương Thùy3, Nguyễn Đức Hoàng2 1 Bộ môn Kỹ thuật Môi trường, Trường Đại học Quốc tế - ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh 2 Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh 3 Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM * Email: lthoang@hcmiu.edu.vn TÓM TẮT Tổng cộng có 12 mẫu nước mặt nằm dọc theo hệ thống sông rạch thuộc địa bàn TP. HCM được lấy để phân tích, đánh giá vi khuẩn kháng kháng sinh được phân bố tại những vùng chịu tác động bởi các hoạt động khác nhau của con người như công nghiệp, nông nghiệp, sinh sống và những khu vực ít chịu tác động bởi các hoạt động của con người. Vi khuẩn kháng kháng sinh được phân tích định lượng bằng phương pháp đỗ đĩa với môi trường R2A agar được bổ sung các kháng sinh mục tiêu gồm Amikacin, Amoxicillin, Ciprofloxacin, Sulfamethoxazole, Trimethoprim, và Cefixime với nồng độ theo hướng dẫn của CLSI. Kết quả cho thấy những điểm chịu tác động cộng gộp của nước thải công nghiệp và sinh hoạt có mật độ vi khuẩn kháng kháng sinh các loại cao nhất, xếp theo sau là khu vực chịu ảnh hưởng nặng bởi nước thải sinh hoạt (khu vực nội thị) và sau cùng vùng có hoạt động nông nghiệp chủ đạo và vùng ít chịu tác động của con người. Từ khóa: Vi khuẩn kháng kháng sinh, gen kháng kháng sinh, khánh sinh, nước mặt. 1. GIỚI THIỆU Hiện nay thuốc kháng sinh được sử dụng rộng khắp và việc điều trị nhiễm khuẩn bằng kháng sinh là hiển nhiên. Tổng lượng kháng sinh tiêu thụ cho người thống kê trong năm 2010 vào khoảng 70 tỷ đơn vị chuẩn (Standard unit SU), tăng 30% so với năm 2000, Penicillin và Cephalosporin chiếm 60%, đây là 2 loại kháng sinh dẫn đầu trong việc điều trị căn bản cho các căn bệnh nhiễm khuẩn thông thường trên toàn thế giới (Van Boeckel et al., 2014). Lượng kháng sinh sử dụng trong cho vật nuôi còn lớn hơn so với lượng sử dụng trong y tế, với mức ước tính trong năm 2010 là 63200 tấn chiếm 2/3 lượng kháng sinh sản xuất trên toàn cầu (100.000 tấn). Ước tính đến 2030, mức tiêu thu này sẽ vào khoảng 105.600 tấn (Van Boeckel et al., 2014). Trong số kháng sinh bán ra, có từ 20 đến 50% được sử dụng không phù hợp (Čižman, 2003). Có khoảng 80% của tất cả các loại kháng sinh được sử dụng bên ngoài bệnh viện (Kotwani, A. and Holloway, 2011). Ở Việt Nam, tự ý mua và sử dụng kháng sinh là một hình thức phổ biến; có đến 88 đến 91% doanh số bán kháng sinh từ các nhà thuốc không có đơn thuốc (Nga et al., 2014). Tình trạng sử dụng kháng sinh không phù hợp và thiếu kiểm soát có thể dẫn đến sự ô nhiễm kháng sinh trong môi trường, gây ra áp lực chọn lọc ngày càng cao, giúp cho các chủng vi khuẩn có tính kháng thuốc phát triển chiếm ưu thế và phát tán rộng hơn trong môi trường. Bên cạnh đó việc sử dụng và thải bỏ thiếu kiểm soát các chất diệt khuẩn và sự ô nhiễm các kim loại nặng trong môi trường cũng là những tác nhân làm phát sinh và/hoặc làm tăng cường tính kháng trong quần xã vi sinh vật trong môi trường do kháng kim loại và kháng kháng sinh có thể chia sẻ với nhau một số cấu trúc và cơ chế kháng (Baker-Austin et al., 2006). Các nghiên cứu nhiều nơi trên thế giới cho thấy có nhiều loại vi khuẩn kháng kháng sinh tồn tại trong hầu hết các loại mẫu nước (từ nước thải đến nước máy). Ở Việt Nam nói chung và khu vực TP.HCM nói riêng chưa có nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn kháng kháng sinh trong mẫu nước mặt. Báo cáo này là một trong những nỗ lực đầu tiên đánh giá bước đầu hiện trạng vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi trường nước mặt tại TP.HCM và phân tích các yếu tố ảnh hưởng từ các Kỷ yếu Hội nghị: Nghiên cứu cơ bản trong “Khoa học Trái đất và Môi trường” 598 hoạt động của con người lên sự hình thành và phát tán vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi trường. Đối tượng được khảo sát là mẫu nước mặt dọc theo hệ thống sông kênh thuộc khu vực đô thị, các khu công nghiêp, các khu nông nghiệp và những khu vực ít chịu tác động của con người thuộc địa bàn TP. HCM. 2. PHƯƠNG PHÁP 2.1. Khảo sát thực địa và thực hiện lấy mẫu nước chịu tác động bởi các hoạt động của con người 2.1.1. Bố trí các điểm lấy mẫu Tổng cộng có 12 điểm lấy mẫu nước mặt được bố trí dọc theo hệ thống sông rạch thuộc địa bàn TP. HCM trong đó có 3 điểm thuộc khu vực nội thành (SH1: nằm cuối kênh Nhiêu Lọc-Thị Nghè, SH2: gần điểm giao giữa cách kênh: kênh Tẻ, kênh Đôi, kênh Tàu Hủ và rạch Bến Nghé, SH3: dưới cầu Đỏ thuộc rạch Sơn gần điểm tiếp giáp với rạch Lăng và gần điểm tiếp giáp với sông Bình Triệu) 3 điểm phân bố vào các khu công nghiệp tiêu biểu (CN1: Điểm giao giữa các dòng kênh chảy qua các khu công nghiệp Tân Phú Trung, CN2: gần điểm giao nhau giữa các nhánh kênh 19 tháng 5, kênh Tham Lương đổ ra từ KCN Tân Bình, CN3: Thuộc khu vực Trung tâm khu Công nghệ cao Quận 9); 3 điểm nằm trong khu vực có hoạt động nông nghiệp (NN1: Điểm trên sông Sài Gòn sát khu NN CN cao TP. HCM, NN2: Trên rạch lớn chảy qua khu nông nghiệp tập trung với rất nhiều vườn cây ăn trái lớn, NN3: Gần các trang trại chăn nuôi heo & trồng nấm phân bố khá tập trung) và 3 điểm phân bố vào khu vực ít chịu tác động của con người: Đền Bến Dược, Trạm bơm Hòa Phú và khu BCR (Hình 1). Hình 1. Sơ đồ và tọa độ các điểm khảo sát lấy mẫu. 2.1.2. Phương pháp lấy mẫu Các mẫu nước sông tại các vị trí mục tiêu được thu thập từ ngày 01/8/2019 đến ngày 31/8/2019, nhằm vào giữa mùa mưa tại TP.HCM, là thời điểm mà mưa hầu như xảy ra vào mỗi buổi chiều và thỉnh thoảng vào buổi sáng. Việc lấy mẫu được thực hiện vào buổi sáng khi không có mưa lớn, trong thời gian từ 9h đến 12h khi nhiệt độ trung bình tại các khu vực lấy mẫu dao động trong khoảng 28-33 oC. Tại mẫu vị trí, mẫu nước mặt được tiến hành lấy bằng xô nhựa 5L cách bề mặt 20-30 cm, lấy 03 lần gộp chung vào xô lớn trước khi phân vào các chai chứa mẫu. Tại các vị trí lấy mẫu dưới cầu (CBR, SH2, SH3, NN2, CN2, CN3) trong 03 xô mẫu được lấy có 01 xô được lấy ở giữa dòng, 2 xô còn lại lấy lệch về 2 bên bờ nhưng chưa chịu tác động cục bộ của bờ. Tất cả các mẫu nước ngay khi lấy đều được trữ lạnh trên đá trong thùng cách nhiệt trong suốt quá trình vận chuyển từ các vị trí lấy mẫu đến phòng thí nghiệm vi sinh tại Trường Đại học Quốc tế, ĐHQG TP.HCM. 2.2. Thử nghiệm, phân tích và định lượng vi khuẩn kháng kháng sinh Vi khuẩn kháng kháng sinh được thử nghiệm theo hướng dẫn của CLSI với liều thử cao hơn ngưỡng nhạy cảm (susceptible) 20% ứng với họ Enterobacteriacea trên môi trường thử nghiệm R2A Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019 599 agar, ủ ở 35oC trong 24h. Cụ thể, các kháng sinh tiêu biểu được dùng để thử nghiệm là kháng sinh được sử dụng phổ biến trong trên địa bàn TP. HCM được bổ sung vào môi trường R2A với nồng độ như sau: (1) hỗn hợp amoxicillin 9,6 µg/mL và acid clavulanic 4,8 µg /mL (AMC), (2) cefixime 1,2 µg/mL (CFM), (3) ciprofloxacin 1,2 µg/mL (CIP), (4) amikacin 19,2 µg/mL (AMK) và (5) hỗn hợp trimethoprim 2,4 µg/mL & sulfamethoxazole 45,6 µg/mL (SXT). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mật độ và tỷ lệ các nhóm vi khuẩn kháng kháng sinh (VKKKS) Tổng vi khuẩn dị dưỡng (VKDD) có mật độ trung bình cao nhất được ghi nhận trong khu vực bị ảnh hưởng cộng gộp bởi nước thải công nghiệp và sinh hoạt (4,3x105 CFU/ml), tiếp theo sau là khu vực chịu ảnh hưởng nước thải sinh hoạt (2,6x104 CFU/ml), khu vực ít bị tác động (2,4x103 CFU/ml) và giá trị thấp nhất được khi nhận tại khu vực chịu tác động bởi hoạt động nông nghiệp (1,3x10 3 CFU/ml). Sự dao động tổng VKDD khá lớn đặc biệt là giữa các điểm thuộc các khu công nghiệp với hệ số biến thiên (CV) lên đến 116,4%. Các nhóm vi khuẩn kháng kháng sinh khác nhau đều có sự dao động đáng kể giữa các khu vực khảo sát. Nhóm vi khuẩn kháng hỗn hợp AMC có mật độ cao nhất trong khu vực công nghiệp (2.2x104 CFU/ml), kế đến là khu vực đô thị (1.9x103 CFU/ml), khu vực nông nghiệp (1.1x102 CFU/ml) và sau cùng là khu vực ít chịu tác động (8.6x101 CFU/ml). Mức dao động chỉ số này giữa các các vị trí lấy mẫu trong từng khu vực không khác nhau nhiều với CV dao động từ 62.7 đến 96.3%. Xét trên giá trị trung bình của từng khu vực, tỷ lệ mật độ của vi khuẩn kháng AMC so với tổng VKDD không cao (3,4-10,9%) và có cùng khuynh hướng biến thiên với mật độ của chúng. Nhóm vi khuẩn kháng với hỗn hợp SXT có mật độ khá cao. Tương tự nhóm vi khuẩn kháng AMC, mật độ nhóm vi khuẩn kháng SXT cũng có giá trị cao nhất tại những điểm chịu ảnh hưởng chính bởi nước thải công nghiệp (3,9x104 CFU/ml), kế đến là những điểm trong khu đô thị (1,8x104 CFU/ml) và thấp như nhau tại 2 khu vực còn lại (khoảng 1,5x102 CFU/ml). Tuy nhiên tỷ lệ mật độ của nhóm này so với tổng VKDD cao nhất tại khu vực đô thị (66,4%) (Hình 2). Nhóm kháng với AMK là nhóm hiện diện với mật độ thấp nhất ở tất cả các điểm khảo sát, đặc biệt ở các điểm thuộc trong khu vực có hoạt động nông nghiệp (1,2 x101 CFU/ml) và những điểm ít có tác động của con người (7,5 x101 CFU/ml). Và do đó, tỷ lệ mật độ của nhóm kháng AMK so với tổng VKDD cũng rất nhỏ (0,7-3,2%). Hệ số biến thiên ghi nhận được giữa các điểm trong từng khu vực có giá trị khá tương đồng (63,8-81,4%). Nhóm kháng ciprofloxacin (CIP) cũng có mật độ trung bình tương đối cao tại các khu công nghiệp (4.7x104 CFU/ml) và khu đô thị (8,3x103 CFU/ml) nhưng lại rất thấp tại khu vực nông trại (3.8x10 1 CFU/ml). Tỷ lệ mật độ so với tổng VKDD cao nhất được ghi nhận tại các điểm thuộc khu vực nội thị (~28%), kế đó là những điểm tiếp nhận nước thải công nghiệp (~20%). Nhóm vi khuẩn kháng cefixime (CFM), có mật độ rất cao. Cao hơn nhiều so với các nhóm khác và xấp xỉ với tổng VKDD với tỷ lệ mật độ so với tổng vi khuẩn di dưỡng từ 60% đến >100%. Đặc biệt được ghi nhận trong khu vực được cho là ít chịu tác động. 3.2. Ảnh hưởng của các hoạt động con người lên sự kháng kháng sinh (KKS) trong môi trường nước mặt đô thị Có lẽ sự phong phú nguồn vi sinh và các hợp chất hữa cơ có trong nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp kết hợp với sinh hoạt là nguyên nhân làm gia tăng mật độ vi sinh vật trong các mẫu nước tiếp nhận trực tiếp các nguồn nước này. Ngoài ra, những nguồn nước thải nói trên cũng có khả năng bị ô nhiễm kháng sinh được thải ra qua người/súc vật được điều trị với kháng sinh, qua đó đã tạo nên áp lực chọn lọc cho phép sự tăng cao tỷ lệ nhóm vi khuẩn kháng thuốc. Bên cạnh đó, trong nước thải công nghiệp thường có một số thành phần độc hại như các kim loại nặng, các chất diệt khuẩn hay các chất có tính độc đối với vi khuẩn, cũng tạo ra áp lực chọn lọc tính kháng chất kháng khuẩn trong môi trường. Điều này lý giải tại sao các mẫu chịu tác của nước thải Kỷ yếu Hội nghị: Nghiên cứu cơ bản trong “Khoa học Trái đất và Môi trường” 600 sinh hoạt và tác động cộng gộp của nước thải công nghiệp và nước thải sinh hoạt có tổng VKDD cũng như các nhóm vi khuẩn kháng sinh hiện diện với mật độ cao. Hoạt động nông nghiệp tại khu vực nghiên cứu có đặc điểm nặng về trồng trọt và nhẹ về chăn nuôi nên có lẽ ít ảnh hưởng đến nguồn nước về khía cạnh nguồn vi khuẩn và áp lực chọn lọc tính kháng kháng sinh và đo đó có mật độ tổng VKDD cũng như mật độ các nhóm vi khuẩn kháng kháng sinh thấp. Bảng 1: Thống kê về mật độ (CFU/ml) vi khuẩn KKS tại các khu vực khảo sát Khu vực khảo sát Chỉ số thống kê Kháng AMC Kháng SXT Kháng AMK Kháng CIP Kháng CFM Tổng VKDD Các khu vực dân cư nội thành (SH) Trung bình 1,9x10 3 1,8x10 4 1,1x10 2 8,3x10 3 2,2x10 4 2,6x10 4 CV(%) 70,5 74,5 63,8 67,7 65,8 68,2 Các khu công nghiệp (CN) Trung bình 2,2x10 4 3,9x10 4 1,7x10 3 4,7x10 4 1,5x10 5 4,3x10 5 CV(%) 78,9 91,3 81,4 80,7 89,1 116,4 Các khu nông nghiệp (NN) Trung bình 1,1x10 2 1,6x10 2 1,2x10 1 3,8x10 1 9,8x10 2 1,3x10 3 CV(%) 96,3 78,8 77,6 95,6 69,1 55,8 Khu vực ít bị tác động (ITĐ) Trung bình 8,6x10 1 1,4x10 2 7,5x10 1 2,0x10 2 3,0x10 3 2,4x10 3 CV(%) 62,7 61,6 73,2 60,2 38,4 18,9 Hình 2: Tỷ lệ mật độ các nhóm vi khuẩn KKS so với tổng VKDD. 4. KẾT LUẬN Tổng vi khuẩn dị dưỡng cũng như tất cả các vi khuẩn kháng kháng sinh được phát hiện có mật độ cao ở các trạm phân bố trong khu dân cư tập trung và những điểm phân bố trong các khu công nghiệp. Mật độ này tại các điểm phân bố trong khu vực nông nghiệp và khu vực được cho là ít chịu tác động của con người thấp hơn nhiều. Trong các nhóm vi khuẩn kháng kháng sinh được khảo sát, nhóm kháng kháng sinh cefixime hiện diện với mật độ cao nhất, nhóm kháng kháng sinh amikacin có mật độ thấp nhất trong tất cả các điểm khảo sát. Các nhóm kháng với hỗn hợp kháng sinh sulfamethoxazole và trimethoprim, hỗn hợp amoxicillin và axit clavulanic và ciprofloxacin có mật độ nằm ở mức trung gian ở 2 nhóm kia và cao thấp khác nhau tùy vào trạm khảo sát. Đề có được thông đầy đủ về kháng kháng sinh trong nước mặt, các nghiên cứu tiếp theo sẽ được tiến hành bao gồm: phân tích định tính các chủng kháng kháng sinh thu nhận được; định lượng tương đối các gen mục tiêu đã xác định trong mẫu nước bằng kỹ thuật Real time PCR. Đánh giá những nhân tố tác động lên sự phát sinh phát tán vi khuẩn và gen KKS trong môi trường và đánh giá rủi ro do ô nhiễm vi khuẩn và gen KKS trong môi trường gây ra cho sức khỏe cộng đồng. Lời cám ơn Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 105.99-2018.19. Nhóm tác giả chân thành cám ơn. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019 601 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Baker-Austin C., Wright M. S., Stepanauskas R., McArthur J. V., (2006). Co-selection of antibiotic and metal resistance. Trends in microbiology, 14(4), pp. 176-82. [2]. Van Boeckel T. P., Gandra S., Ashok A., Caudron Q., Grenfell B. T., Levin S. A., Laxminarayan R., (2014). Global antibiotic consumption 2000 to 2010: an analysis of national pharmaceutical sales data. The Lancet. Infectious diseases. 14(8), pp. 742-750. [3]. Čižman, M., (2003). The use and resistance to antibiotics in the community. International Journal of Antimicrobial Agents, 21(4), pp. 297-307. [4]. Kotwani, A. and Holloway, K., (2011). Trends in antibiotic use among outpatients in New Delhi, India. BMC Infectious Diseases, 11, 2011., p. 99. [5]. Ng C., Tay M., Tan B., Le T. H., Haller L., Chen H., Koh T. H., Barkham T. M. S., Gin K. Y., 2017. Characterization of metagenomes in urban aquatic compartments reveals high prevalence of clinically relevant antibiotic resistance genes in wastewaters. Frontiers in Microbiology. Frontiers Media S. A., 8 (NOV). OCCURRENCE OF ANTIBIOTIC RESISTANT BACTERIA IN THE SURFACE WATER IN HO CHI MINH CITY Truong Thong 1,2 , Le Thai Hoang 1* , Pham Thi Phuong Thuy 3 , Nguyen Duc Hoang 2 1 Department of Environmental Engineering, International University-Vietnam National University HCMC 2 Center for Bioscience & Biotechnology, University of Science-VNU-HCMC 3 Department of Biotechnology, University of Food Industry HCMC * Email: lthoang@hcmiu.edu.vn ABSTRACT A total of 12 surface water samples which is located along the river system of the HCMC and affected by different human activities such as industry, agriculture, urban and less impacted areas was taken to analyze and evaluate antibiotic resistant bacteria (ARB). Total ARB was quantitatively analyzed by dish-pouring method with R2A agar medium supplemented with target antibiotics including Amikacin, Amoxicillin, Ciprofloxacin, Sulfamethoxazole, Trimethoprim, and Cefixime according to CLSI's guideline. The results showed that the sites which are cumulatively impacted of industrial and domestic wastewater have the highest density of total heterotrophic bacteria as well as the ARBs, followed by the area heavily affected by domestic wastewater (urban areas) and finally, the agricultural region and the region with little human impact. Keywords: Antibiotic resistant bacteria (ARB), antibiotics, surface water.