Bước đầu phân lập và sàng lọc một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn mạnh nhằm ứng dụng trong sản xuất probiotic

710 BƢỚC ĐẦU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN MẠNH NHẰM ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT PROBIOTIC Phạm Minh Nhựt, Trần Trung Cƣơng, Nguyễn Thị Mỹ Huyền, Nguyễn Hoàng Thành Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Tp.HCM TÓM TẮT Từ các sản phẩm lên men truyền thống bao gồm nem chua, cải chua, kim chi, nem Huế, củ kiệu đã tiến hành phân lập được 5 chủng vi khuẩn lactic. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn này đối với 19 chủng vi khuẩn chỉ thị thuộc nhóm Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Listeria, Vibrio, Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Kết quả cho thấy 5 chủng này đều thể hiện hoạt tính kháng khá mạnh với đường kính vòng kháng từ 8,50 mm – 14,17 mm và phổ kháng khuẩn khá rộng (kháng được từ 15 – 17 chủng vi khuẩn chỉ thị). Kết quả này cho thấy rằng 5 chủng vi khuẩn lactic phân lập được có hoạt tính kháng mạnh có tiềm năng ứng dụng trong việc sản xuất probiotic. Từ khóa: Đối kháng, hoạt tính kháng khuẩn, vi khuẩn lactic, vi khuẩn chỉ thị, ức chế. 1. GIỚI THIỆU Trong những năm gần đây, tuy nền công nghiệp và dịch vụ nước ta đang trên đà phát triển nhưng nông nghiệp vẫn giữ vai trò chủ đạo trong nền kinh tế. Sản lượng nông sản có xu hướng ngày càng tăng và sản lượng xuất khẩu cũng tăng, đặc biệt là các sản phẩm thủy hải sản. Để ngày càng nâng cao chất lượng của nông sản, việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản để sản xuất ra thủy hải sản sạch không có dư lượng kháng sinh và sử dụng các chế phẩm sinh học nhằm kéo dài thời gian bảo quản đối với rau quả và các sản phẩm thủy hải sản đồng thời an toàn đối với người tiêu dùng đang là mục tiêu cấp thiết. Hiện nay, phương pháp bảo quản được sử dụng rộng rãi và phổ biến là bảo quản lạnh. Việc sử dụng nước đá để nhằm mục đích kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây hư hỏng hiện diện trên nông sản giúp kéo dài thời gian bảo quản. Tuy nhiên, việc sử dụng nước đá để bảo quản nông sản trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến chất lượng của nông sản nên việc sử dụng một số hợp chất kháng khuẩn nhằm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây hư hỏng trên sản phẩm nông sản là một hướng tiếp cận mới có tính khả thi khá cao. Trong số các hợp chất đối kháng do vi sinh vật sản xuất thì những hợp chất thu được từ vi khuẩn lactic đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng khá nhiều. Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra các chất ức chế: sản xuất ra một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có trọng lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển, có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh bằng cách làm giảm pH môi trường ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh. Đối với hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn do khả năng việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl (Davidson và Branen, 1993). Đối với bacteriocin, cơ chế kháng 711 khuẩn của bacteriocin do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứuđầu tiên ở nisin, bacteriocin Gram dương. Dựa trên bản chất cation và tính kỵ nước, hầu hết các peptide hoạt động như màng tế bào thấm. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Do đó, việc sử dụng các hợp chất sinh học chiết xuất từ vi sinh vật là một hướng tiếp cận tương đối khả thi trong lĩnh vực bảo quản nông sản thực phẩm và trong lĩnh vực nuôi trồng. Chính vì thế, việc phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính đối kháng mạnh với vi khuẩn gây bệnh đồng thời tìm ra môi trường tối ưu để chúng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao nhất là mục tiêu của nghiên cứu. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguồn mẫu phân lập và vi khuẩn chỉ thị Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các sản phẩm lên men chua truyền thống vì những sản phẩm này chứa một số lượng lớn vi khuẩn lactic. Các mẫu phân lập bao gồm: cải chua, nem chua, nem Huế, kim chi, củ kiệu. Các chủng vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm này bao gồm vi khuẩn gồm 3 chủng Shigella spp., 4 chủng Salmonella spp., 4 chủng Escherichia coli, 4 chủng Vibrio spp., 2 chủng Listeria spp., Staphylococcus aureus, Enterococus feacalis. 2.2. Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic Cân chính xác 10 g mẫu cho vào erlen chứa 90 ml môi trường MRS. Sau đó đem ủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 300C trong vòng 24 giờ. Sau khi mẫu được tăng sinh, tiến hành pha loãng mẫu để được các độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7. Hút 0.1 ml dịch ở các độ pha loãng cấy vào môi trường MRS agar và ủ ở 300C trong 48 giờ. Chọn lọc vi khuẩn lactic dựa vào hình thái khuẩn lạc, sau đó làm thuần và bảo quản. Tiến hành một số thử nghiệm để định danh sơ bộ vi khuẩn lactic gồm nhuộm Gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase. 2.3. Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị Các chủng vi khuẩn lactic sau khi được phân lập trên môi trường MRS được sàng lọc dựa vào khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị. Đầu tiên, tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch (Olanrewaju, 2007). Tăng sinh vi khuẩn lactic trong môi trường MRS broth ở 30 0 C trong 24 giờ. Tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm và pha loãng để đạt mật độ 107 cfu/ml, sau đó cấy trang trên môi trường MRS agar và ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó sử dụng một ống trụ có đường kính 6 mm đục 3 khối thạch và dùng kẹp gắp 3 khối thạch MRS agar chuyển sang 3 lỗ trên môi trường TSA đã trải s n vi khuẩn chỉ thị ở mật độ 106 cfu/ml. Ủ 370C trong 24 giờ và đo vòng tròn kháng khuẩn. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 712 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic Từ các mẫu thực phẩm lên men truyền thống, đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn lactic. Các chủng này được nuôi cấy làm thuần và định danh sơ bộ. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic Nguồn mẫu Ký hiệu Hình dạng khuẩn lạc Gram Hình dạng Bào tử Catalase Cải chua CC01 Tròn, lồi, bóng, bờ láng, màu trắng, d > 1mm + Cầu – – Kim chi KC01 Tròn, lồi, bóng, bờ láng, trắng đục, d > 1mm + Que dài – – Nem chua NC01 Tròn, lồi, bóng, bờ láng, trắng đục, d > 1mm + Cầu – – Nem Huế NH01 Tròn, lồi, bóng, bờ láng, trắng đục, d = 0.5 – 0.8 mm + Que ngắn – – Củ kiệu CK01 Tròn, lồi, bóng, bờ láng, trắng đục, d > 1mm + Que ngắn – – (+): Dương tính; (–): Âm tính Theo Ashmaig và ctv (2009), vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử và không sinh enzyme catalase. Dựa vào kết quả phân lập và định danh sơ bộ được trình bày ở Bảng 1, 5 chủng vi khuẩn đều là vi khuẩn lactic nên chúng sẽ được bảo quản để tiếp tục cho những thử nghiệm tiếp theo. 3.2. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị Các chủng vi khuẩn lactic sau khi được định danh sơ bộ, tiến hành sàng lọc để chọn ra được chủng có khả năng đối kháng cũng như sinh các hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất đối với vi khuẩn chỉ thị. Theo Suskovic và ctv (2010), tế bào vi khuẩn lactic đã chứa s n các hợp chất kháng khuẩn như reuterin, reutericyclin và trong quá trình tăng trưởng chúng sản sinh ra thêm các hợp chất kháng khuẩn khác bao gồm acid lactic, bacteriocin, CO2, H2O2 và diacetyl. Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic đối với 19 chủng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, sau 24 giờ xuất hiện vòng kháng khuẩn với kích thước khác nhau được trình bày ở bảng 2. 713 Bảng 2. Đường kính vòng kháng vi khuẩn chỉ thị của sinh khối LAB (mm) CC01 NC01 NH01 KC01 CK01 E. coli O157:H7 11.67 ± 0.58 11.17 ± 1.53 10.33 ± 0.58 11.83 ± 0.29 11.33 ± 0.58 E. coli 0208 11.67 ± 0.58 11.67 ± 0.58 12.33 ± 2.08 10.67 ± 0.29 11.67 ± 0.29 E. coli 8.50 ± 0.50 12.00 ± 1.73 10.83 ± 0.76 10.50 ± 0.50 11.17 ± 0.29 ETEC 13.00 ± 0.00 14.00 ± 1.00 11.83 ± 0.76 12.33 ± 0.76 12.67 ± 0.76 L. innocua NA NA 13.00 ± 2.65 NA NA L. monocytogenes NA NA 10.50 ± 0.50 NA NA S. dublin 13.67 ± 1.15 15.00 ± 0.00 11.83 ± 1.61 14.00 ± 1.00 10.50 ± 1.00 S. enteritidis 14.17 ± 2.02 10.00 ± 0.58 NA 10.67 ± 0.29 10.50 ± 0.50 S. typhii NA NA 11.67 ± 2.08 NA NA S. typhimurium 10.67 ± 1.15 10.33 ± 0.58 11.83 ± 1.61 10.83 ± 1.04 10.17 ± 1.04 S. boydii 10.83 ± 1.26 11.00 ± 1.00 12.67 ± 2.52 10.83 ± 2.02 10.00 ± 1.00 S. flexneri 12.17 ± 10.4 11.67 ± 0.58 13.00 ± 2.65 12.83 ± 1.04 11.50 ± 0.87 S. sonnei NA NA 11.00 ± 1.73 12.00 ± 0.50 11.83 ± 0.76 V. alginolyticus 12.33 ± 0.58 10.83 ± 1.26 12.17 ± 0.29 9.33 ± 0.29 10.25 ± 1.77 V. cholerae 11.50 ± 0.50 11.17 ± 0.29 10.33 ± 0.58 10.83 ± 0.29 10.17 ± 0.29 V. harveyi 10.50 ± 0.87 11.33 ± 0.58 NA 12.33 ± 0.76 11.00 ± 0.87 V. parahaemolyticus 11.00 ± 1.00 10.67 ± 0.58 11.67 ± 1.15 10.83 ± 0.29 10.00 ± 0.50 S. aureus 13.00 ± 0.00 13.67 ± 1.15 10.83 ± 0.76 11.00 ± 1.32 9.67 ± 0.58 E. feacalis 12.00 ± 1.73 15.00 ± 0.00 12.33 ± 1.53 13.00 ± 0.87 13.17 ± 1.04 NA: no activity (không có hoạt tính đối kháng) 5 chủng LAB khảo sát đều có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt và phổ kháng khuẩn khá rộng. Chủng CC01 kháng được16/19 chủng vi khuẩn chỉ thị với đường kính từ 8,5mm – 14,17 mm; chủng NC01 kháng15/19 chủng với đường kính từ 10 mm – 14 mm; chủng NH01 kháng 17/19 chủng với đường kính từ 10,33 mm đến 13 mm; chủng KC01 kháng 16/19 chủng với đường kính từ 9,33 mm đến 14 mm và cuối cùng là chủng CK01 kháng 16/19 chủng với đường kính từ 10,17 mm – 12,67 mm. Theo nghiên cứu của Olanrewaju (2007) đối với vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ Kunnu và sữa bò, nghiên cứu của Pishva và ctv (2009) đối với các chủng Lactobacillus phân lập từ sữa chua truyền thống, nghiên cứu của Soleimani và ctv (2010) đối với các chủng vi khuẩn lactic probiotic thì các chủng này đều thể hiện tính kháng rất mạnh đối với S. aureus. Điều này chứng tỏ rằng các chủng vi khuẩn lactic dù khác nguồn gốc phân lập nhưng sinh khối của chúng đều đối kháng mạnh với S. aureus. Các chủng vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu đều là các nhóm vi khuẩn gây bệnh ở người và động vật như bệnh tiêu chảy ở người và động vật. Bệnh tiêu chảy do nhiều nguyên nhân nhưng nguyên nhân chủ yếu là do các vi sinh vật gây ra nên trong thử nghiệm kháng khuẩn, các chủng vi khuẩn chỉ thị được sử dụng đều thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột bao gồm S. typhii gây bệnh thương hàn; S. enteritidis, S. flexneri gây bệnh tiêu chảy; S. sonnei, S. boydii gây bệnh lỵ; nhóm E. coli gây bệnh tiêu chảy; nhóm Vibrio sp. gây ra nhiều bệnh đường ruột trên người trong đó có một số bệnh nguy hiểm như 714 bệnh tả (V. cholerae). Đồng thời, một số chủng chỉ thị thuộc nhóm Vibrio spp. cũng gây bệnht rên động vật thuỷ sản. Do đó, kết quả này đã cho thấy các chủng vi khuẩn lactic phân lập được có hoạt tính kháng khuẩn tốt với các chủng vi khuẩn này mở ra một tiềm năng về việc sản xuất các chế phẩm probiotic nhằm phòng bệnh ở động vật nuôi. 4. KẾT LUẬN Từ 5 loại sản phẩm lên men lactic đã phân lập 5 chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt và phổ kháng khuẩn rộng đối với 19 chủng vi khuẩn chỉ thị (kháng được tối thiếu 15/19 chủng). Các chủng này có tiềm năng ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm probiotic. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ashmaig A., Hasan A., El Gaali E., 2009. Identification of lactic acid bacteria isolated from traditional Sudanese fermented camel‘s milk (Gariss). African Journal of Microbiology Research 3(8): 451 – 457. [2] Ishola R. O. and Adebayo – Tayo B. C, 2012. Screening lactic acid bacteria isolated from Fermented food for Bio – molecules production. AU Journal of Technolgy 15 (4): 205 – 217. [3] Olanrewaju O., 2007. Antagonistic effect of Lactobacillus isolates from kunnu and cowmilk on selected pathogenic microorganisms. Internet Journal of Food Safety 9: 63 – 66. [4] Soleimani N. A., Kermanshahi R. K., Yakhchali B., Sattari T. N., 2010. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli against Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. African Journal of Microbiology Research 4(20): 2169 – 2173. [5] Suskovic J., Kos B., Beganovi J., Lebos Pavunc A., Habjanic K., Matosic S., 2010. Antimicrobial activity – The most important property of probiotic and starter lactic acid bacteria. Food Technology and Biotechnology 48 (3): 296 – 307.