Các phương pháp phân tích vi sinh vật

CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH VI SINH VAÄT Phöông phaùp nuoâi caáyPhöông phaùp treân cô sôû kyõ thuaät sinh hoïc phaân töûPhöông phaùp treân cô sôû mieãn dòch hoïcPHAÂN TÍCH VSV BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁYPhöông phaùp ñoå ñóa (pour plate)Phöông phaùp caáy beà maët (spread)Phöông phaùp MPN (most probable number)Phöông phaùp nuoâi caáy kî khíPHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓAMuïc ñích söû duïng trong ñònh löôïng VSVKyõ thuaätMoâi tröôøng agar ñöôïc ñun chaûy vaø laøm nguoäi ñeán 45±1oCCaáy tối ña 1ml dòch maãu hay dòch pha loaõng vaøo ñóa petri troáng voâ truøng (Þ 9 – 10cm)Ñoå 10-15ml moâi tröôøng vaøo ñóaLaéc ngöôïc vaø xuoâi chieàu kim ñoàng hoàÑaët ñóa leân maët phaúng ngang cho moâi tröôøng ñoâng ñaëcUÛõ ngöôïc ñóa, trong ñieàu kieän vaø thôøi gian xaùc ñònhPHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓAÖu ñieåmCaáy ñöôïc theå tích maãu lôùn (1ml)Xaùc ñònh ñöôïc caùc VSV caàn dinh döôõng tieáp xaùc töø nhieàu phíaCho pheùp ñeám ñöôïc maät ñoä VSV cao, khoaûng 150 - 300 khuaån laïcNhöôïc ñieåmKhoâng ñònh löôïng ñöôïc nhöõng VSV quaù nhaïy nhieätKhoâng xaùc ñònh ñöôïc hình daïng khuaån laïc nhaát ñònhKhoù laøm thuaàn moät doøng VSVPHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ MAËTMoâi tröôøng phaûi ñöôïc chuaån bò treân ñóa tröôùc 1-2 ngaøy ñeå khoâ maëtPhöông phaùpCaáy 0,1 – 0,3ml vaøo ñóa moâi tröôøng (ñóa Þ 90mm) Caáy toái ña 1ml vaøo ñóa moâi tröôøng (ñóa Þ 140mm) Traûi ñeàu maãu leân beà maët moâi tröôøng baèng que trang tam giaùcÑeå ôû nhieät ñoä phoøng 15-20 phuùt cho khoâ maëtLaät ngöôïc ñóa ñeå uûPHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ MAËTÖu ñieåmÑònh löôïng ñöôïc caùc VSV nhaïy nhieätCoù theå nhaän daïng ñöïôc daïng khuaån laïc ñaëc tröngDeã daøng laøm thuaàn chuûng VSV muïc tieâuNhöôïc ñieåmChæ caáy ñöïôc theå tích maãu nhoû (neáu duøng ñóa thoâng thöôøng Þ90-100mm)Chæ cho pheùp ñeám ñöôïc soá löôïng khuaån laïc thaápPHÖÔNG PHAÙP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)Khaùi nieämCoøn goïi laø phöông phaùp pha loaõng tôùi haïnGiaù trò keát quaû nhaän ñöôïc laø soá löôïng VSV muïc tieâu coù xaùc suaát cao nhaát theo nguyeân taéc thoáng keâGiaù trò MPN laø giaù trò coù xaùc xuaát cao nhaátHeä thoáng MPNGoàm 3 hoaëc 5 laàn laëp laïi ôû moãi noàng ñoäLaëp laïi ôû 3 noàng ñoä pha loaõng lieân tieápChoïn caùc ñoä pha loaõng sao cho trong heä thoáng coù caû oáng döông tính vaø oáng aâm tínhKeát quaû MPN coù ñoä chính xaùc cao nhaát khi soá oáng döông tính vaø aâm tính trong heä thoáng töông ñöông nhauPHÖÔNG PHAÙP MPN Chia theo soá löôïng oáng trong heä thoáng - Heä thoáng 9 oáng: moãi ñoä pha loaõng laëp laïi 3 laàn - Heä thoáng 15 oáng: moãi ñoä pha loaõng laëp laïi 5 laànNguyeân taéc - Döïa treân keát quaû ñònh tính VSV muïc tieâu ôû caùc laàn laëp laïi treân cuøng moät ñoä pha loaõng vaø ôû caùc ñoä pha loaõng khaùc nhau - Vi sinh vaät muïc tieâu phaûi coù nhöõng bieåu hieän ñaëc tröng treân moâi tröôøng nuoâi caáy loûng nhö Söï taïo hôi: Coliforms, E. coli Söï ñoåi maøu: S. aureusÑaëc ñieåmCho pheùp ñònh löôïng ñöôïc maät ñoä VSV thaáp trong theå tích maãu lôùnHEÄ THOÁNG MPNHeä thoáng 9 oáng10ml moâi tröôøng noàng ñoä thöôøng (ñôn)Heä thoáng 15 oángHEÄ THOÁNG MPN10ml moâi tröôøng noàng ñoä ñoâi10ml moâi tröôøng noàng ñoä ñôn (thöôøng)ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP MPN1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.510ml LSB10-110-210-31ml1ml1mlÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP MPN(tt)1.11.21.31.41.52.22.33.310ml EC1.11.21.52.21.11.2Endo/EMBIndol2,0,0 4,5 MPN/gKeát quaû 2,0,0  = 4,5 MPN/gCoâng thöùc tính chæ soá MPNTrong ñoù:∑ gj : soá löôïng oáng döông tính trong daõy daõ choïn∑ tjmj :Khoái löôïng maãu trong daõy ñaõ choïn ∑ (tj-gj)mj Khoái löôïng maãu trong taát caû caùc maãu aâm tính.GIỚI HẠN TIN CẬYTrong ñoù: ∑ gj : soá löôïng oáng döông tính trong daõy daõ choïn ∑ tjmj :Khoái löôïng maãu trong daõy ñaõ choïn ∑ (tj-gj)mj Khoái löôïng maãu trong taát caû caùc maãu aâm tính. t: Số ống trong hệ thốngCHÆ SOÁ MPN CÔ BAÛNLaø chæ soá tra ñöôïc töø baûng keát quaû MPN coù soá löôïng maãu trong từng daõy laëp laïi nhö sau:- Daõy 1: 1g hoaëc 1ml maãu- Daõy 2: 0,1g hoaëc 0,1ml- Daõy 3 0,01g hoaëc 0,01mlCOÂNG THÖÙC CHUYEÅN ÑOÅI KEÁT QUAÛ MPNCs = M x F/V0 x Vs Cs: là khả năng lớn nhất của vi sinh vật có trong thể tích Vs M : chỉ số MPN tra từ bảng đối với độ pha loãng cơ bản V0 F : nghịch đảo hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thấp nhất của dãy Vs: Thể tích chuẩn được chọn để biểu thị mật độ vi sinh vậtNếu tính kết quả là MPN/g thì Vs = 1Nếu tính kết quả là MPN/100g thì Vs = 100 V0: Thể tích mật độ pha loãng cơ bản ( V0 = 10) PHÖÔNG PHAÙP MAØNG LOÏCKích thöôùc loå loïc 0,47µm hay 0,22µmÑöôøng kính vaø hình daïng maøng loïc phuï thöïc vaøo ñöôøng kính pheåu loïcÑöôøng kính maøng thöôøng laø 45mmTHIEÁT BÒ LOÏC NHIEÀU PHEÅU(MULTIFOLDER)CAÙC BOÄ PHAÄN CUÛA THIEÁT BÒ LOÏC VSVPHÖÔNG PHAÙP LOÏC VSVPheåu loïc, giaù ñôû maøng loïc phaûi ñöôïc voâ truøng sau moãi laàn loïcMaät ñoä VSV trong dòch loïc thích hôïp: <150 khuaån laïc/maøngTheå tích dòch loïc trong 1 laàn: 50 -100mlNeáu theå tích dòch loïc nhoû hôn thì phaûi pha loaõng baèng dd pha loaõng hay nöôùc caát voâ truøngPHÖÔNG PHAÙP MAØNG LOÏCÖu ñieåmXaùc ñònh ñöôïc maät ñoä VSV cuï theå trong moät theå tích maãu lôùn: 10ml, 100ml Nhöôïc ñieåm - Khoâng thích hôïp cho vieäc phaân tích caùc maãu thöïc phaåm raénKHUAÅN LAÏC VSV TREÂN MAØNG LOÏC1A1B1C1D. 2A2B2C2CE. coli treân moâi tröôøng ID Coli agarColiforms treân moâi tröôøng ID Coli agarPHÖÔNG PHAÙP MAØNG PETRI-FILMCaûi bieân töø phöông phaùp ñeám khuaån laïc treân ñóaThích hôïp cho vieäc phaân tích maãu taïi hieän tröôøngKhoâng phaûi baûo quaûn hay vaän chuyeån maãuNhöôïc ñieåm - Chæ aùp duïng haïn cheá ôû moät soá chæ tieâu deå nuoâi caáy - Chæ caáy ñöôïc theå tích maãu nhoûPHÖÔNG PHAÙP ÑÓA PETRI FILMÑaët maãu leân maøng PetrifilmDaøn ñeàu maãu treân maøngUÛ Petrifilm, ñeám tröïc tieáp hoaëc phaân laäpXanh: E. coliÑoû: ColiformsDifferent colors with indolyl substratesSalmon (6-Chloro-3indolyl)Magenta (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl)5-Iodo-3-indolylIndolylBCI (5-Bro4-chloro-3-indolyl)Green (N-Methyl-3-indolyl) Chromogenic SubstratesPHẢN ỨNG ENZYME TẠO MÀUß-D-Galactosidase95 % of Coliformsß-D-Glucuronidase94-97 % of E.coli Tryptophanase99 % E.coli có phản ứng Indole dương tínhCƠ CHẾ TẠO MÀUKhông màuENZYMECARBOHYDRATEINDOLYL+02Có màuENZYMEOXY HÓA+ CARBOHYDRATEO - CARBOHYDRATENHXYZNHXYOHZNHXYONHXYOZZHIỆN MÀU PHẢN ỨNG CHUNG CỦA CƠ CHẤT TẠO MÀUCOLIFORMS6-CHLORO-3-INDOLYL-ß-D-GALACTOPYRANOSIDE (SALMON-GAL)COLORLESSGALACTOSIDASE= ENZYME GALACTOSIDE=CARBOHYDRATEINDOLECHLOROINDIGOCOLORLESSO2+E.coli5-Bromo-4-CHLORO-3-INDOXYL-ß-D-GLUCURONIDE (X-GLUC)COLORLESSGLUCURONIDASE= ENZYME GLUCURONIDE=CARBOHYDRATEINDOLEBROMOCHLOROINDIGOCOLORLESSO2+E. coli VÀ Coliforms X-GLUC và Salmon-GAL Không màuGlucuronidase và Galactosidase= Enzyme Glucuronide và Galactoside=CarbohydrateIndolylBromochloroindigoKhông màuO22+ Chloroindigo E.coliColiformsand E.coliE.coliPHẢN ỨNG TẠO KẾT TỦA, PHÁT HUỲNH QUANGPhosphatidylinositol phosphalipase Listeria monocytogenesLecithinase Bacillus cereus Acid phosphatase phân cắt MUP (4-methylumbelliferylphosphate) tạo 4-methylumbellferone phát huỳnh quang dưới tia UVClostridium perfringensBiểu hiện của L. monocytogenes trên môi trường ALOA và Eggyolk*ALOAEGGYOLKHoạt tính enzym phosphatidylinositol phosphalipase ở L. monocytogenesClostridium perfringens phát huỳnh quan trong môi trường TSC agar có bổ sung MUPPseudomonas phát huỳnh quan trong môi trường Pseudomonas agar có Hecxadecyltrimethyl ammonium bromide(cetrimide)PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATPNguyeân taéc E + LH2 + ATP E – LH2 AMP + PPi (1)E – LH2 AMP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (2)Phaûn öùng treân coù theå vieát laïi nhö sau:E + LH2 + ATP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv +PPi E : luciferase LH2 :luciferin Aùnh saùng phaùt ra coù böôùc soùng 562nm, coù maøu vaøng.Mg2+PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATPATP chuû yeáu hieän dieän ôû teá baøo VSV soángÑònh löôïng VSV thoâng qua soá löôïng ATP cuûa VSV trong maãuSoá löôïng ATP phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän dinh döôõng, traïng thaùi teá baøoKhoâng phaân bieät ñöôïc caùc doøng, loaøi hay nhoùm VSV khaùc nhauPHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATPÖu ñieåmCho pheùp ñònh löôïng ñöôïc toång soá vsv trong maãuCho keát quaû ñònh löôïng nhanhThích hôïp cho vieäc giaùm saùt veä sinh treân daây chuyeàn saûn xuaátPHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATPNhöôïc ñieåmKhoâng phaân bieät ñöôïc ATP cuûa VSV vaø cuûa maãuKhoâng phaân bieät ñöôïc caùc doøng, loaøi hay nhoùm VSV khaùc nhauCaàn thieát bò tinh vi, coù ñoä nhaïy vaø ñoä chính xaùc caoCaùc hoaù chaát khoù baûo quaûn, nhaïy caûm vôùi aùnh saùngPHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATPPHÖÔNG PHAÙP ELISA (enzym linked immunosorbent assayThieát laäp treân nguyeân taéc cuûa phaûn öùng khaùng nguyeân – khaùng theåKhaùng nguyeân: ñoái töôïng caàn phaân tích trong maãuKhaùng theå: coá ñònh trong gieáng (well) vaø trong trong kítCoù hai loaïi phöông phaùt ELISAELISA thöôøng (thuaän)ELISA caïnh tranhPHÖÔNG PHAÙP ELISA (enzym linked immunosorbent assay)Boä kít cuûa phaûn öùng ELISA thuaän + Coù 2 khaùng theå trong moät phaûn öùng - Khaùng theå sô caáp: coá ñònh trong gieáng - Khaùng theå thöù caáp töï do coù gaén enzym taïo maøu + Cô chaát taïo maøu vôùi enzym + Chaát röûa + Chaát döøng phaûn öùng enzym NGUYEÂN TAÉC PHAÛN ÖÙNG ELISA THUAÄNKhaùng theå thu khaùng nguyeânKhaùng nguyeânKhaùng theå mang enzyme ñaùnh daáu“Sandwich”Cô chaátPhaùt quangÑAËC ÑIEÅMCöôøng ñoä maøu tæ leä thuaän vôùi haøm löôïng khaùng nguyeânKhoù phaùt hieän ñöôïc haøm löôïng khaùng nguyeân thaápPHÖÔNG PHAÙP ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)Boä kít cuûa phaûn öùng ELISA caïnh tranh + Coù 2 khaùng theå - Khaùng theå sô caáp: coá ñònh trong gieáng laø khaùng nguyeân cuûa khaùng theå sô caáp - Khaùng theå thöù caáp töï do: coù khaû naêng lieân keát mieãn dòch vôùi khaùng theå sô caáp vaø chaát caàn phaùt hieän, khoâng mang enzym + Chaát caïnh tranh coù mang enzym + Cô chaát taïo maøu vôùi enzym + Chaát röûa + Chaát döøng phaûn öùng enzym SÔ ÑOÀ PHAÛN ÖÙNG ELISA CAÏNH TRANHGieáng coù khaùng theå sô caápMaãu vaø chaát caïnh tranhKhaùng theå thöù caáo ñöôïc cho vaøoSöï taïo sandwich xaõy raRöûaHieän maøuDöøng phaûn öùng, so maøu1234567ÖU, NHÖÔÏC ÑIEÅM CUÛA ELISAÖu ñieåmNhanh, nhaïyDeã daøng töï ñoäng hoaùCoù theå thöïc hieän moät luùc nhieàu maãu Nhöôïc ñieåmTæ leä keát quaû döông tính giaû cao, caàn phaûi khaúng ñònh laïi khi kết quả ELISA dương tínhMoãi ñoái töôïng phaân tích phaûi coù moät boä kít rieângHoaù chaát deã hoûng, thôøi gian baûo quaûn ngaénPhương pháp Lateral Flow Test (LFT) bacteriumgold particleantibodymembrane*Phương pháp Lateral Flow Test (LFT)-Antigen-AntigenPHÖÔNG PHAÙP SÖÛ DUÏNG MAÃU DOØNguyeân taécTreân cô sôû phöông phaùp lai phaân töûCoù theå phaùt hieän ñoái töôïng baèng DNA hay RNAMöùc ñoä chuyeân bieät cuûa phöông phaùp phuïthuoäc vaøo söï chuyeân bieät cuûa maãu doø (probes)Maãu doø coù theå laø maïch RNA hay DNANguyên tắc phát hiện VSV bằng mẫu dòDịch tăng sinh Dịch chiết DNA vi khuẩnMẫu dò phát hiệnPhát hiệnĐặt mẫuCố định mẫuTế bào vi khuẩnChuyển lên màngLai với mẫu dòRửa màngPhát hiện với Kính hiển vi huỳnh quangPhương pháp GenTrapRNA muïc tieâuMaãu doøthu giöõMaãu doøphaùt hieänQue thöû Cô chaát phaùt quang