Cấu tạo và tính chất của ligno-Cellulose

Cấu tạo và tính chất của ligno-cellulose Trong tự nhiên phế liệu chứa ligno-cellulose là nguồn chất hữu cơ thay thế được tạo ra trong quá trình quang hóa ở thực vật. Trong công nghiệp nó được tạo ra trong quá trình sản xuất gỗ, giấy và bột giấy. Ligno-cellulose chiếm khoảng 60% toàn bộ phế liệu từ gỗ được sản xuất trên trái đất. Ligno-cellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt. Tuy nhiên nó là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do đó việc tận dụng nguồn phế liệu ligno-cellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàn carbon toàn cầu. Về mặt hóa học, chúng gồm 2 polymer mạch thẳng cellulose và hemicellulose và một polymer có cấu trúc 3 chiều lignin. Cellulose được bao quanh bởi phân tử hemicellulose và lignin. Hình 2.1– Cấu trúc của ligno-cellulose Cellulose [2] Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50%. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài VSV. Ơû tế bào thực vật và ở tế bào một số loài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi. Khi đun sôi với acid sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose. Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các b-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết b-1,4 glucoside. Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết a-1,4 glucoside. Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như sau: Đầu không khử Đầu khử Hình 2.2- Cấu tạo phân tử cellulose. Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton. Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro. Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng: Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác. Ơû û vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này. Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals. Ở vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình. Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH. Hình 2.3–Cấu trúc của CMC Trong thiên nhiên, khi thực vật và VSV có chứa cellulose bị chết, cellulose của chúng chỉ bị phân hủy bởi cả một tập đoàn VSV. Các loài VSV sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạo của cellulose lại được đi vào các con đường chuyển hóa trong chu trình chuyển hóa vô tận của thiên nhiên. Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn. Số lượng cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể chiếm đến 80-90%. Ơû VSV cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự như ở thực vật. Ơû đó, cellulose thường thuộc loại vô định hình. Chính vì thế việc phân hủy chúng thường rất dễ thực hiện. Hemicellulose [1] Hemicellulose là polysaccharide có phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của cellulose rất nhiều. Chúng thường được cấu tạo từ 150 gốc đường. Các gốc đường này được nối với nhau bằng các liên kết b-1,4; b-1,3; b-1,6 glucoside. Chúng thường là những mạch ngắn, phân nhánh. Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng không hòa tan trong nước nhưng dễ dàng bị phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm. Hemicellulose cũng là thành phần của tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các phần như: vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose như manose, galactose, nhóm pentose như arabinose, xilose. Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như mannan, galactan, và pentozan. Các polysaccharide như mannan, galactan, araban và xilan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như: gỗ, rơm rạ,… Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng 30%), cây lá rộng (chiếm khoảng 20-25%). Ơû những cây lá kim thường chứa ít xylan. Lignin [21] Lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ở thực vật bậc cao. Ơû cây gỗ, lignin chiếm tới 20-30%. Trong thành phần của lignin, carbon chiếm tới 69%, hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24% Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và trong acid vô cơ. Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4 lignin bị phân giải tạo ra các hợp chất thơm. Trong thực vật chúng như chất ximang liên kết các tế bào lại với nhau, làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố, các VSV từ bên ngoài. Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin được tạo ra, không bị biến đổi sinh lý. Chúng có cấu tạo rất phức tạp, tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu khác nhau. Hình 2.4–Cấu tạo phân tử lignin Enzym cellulase [1,2,4,23] Phân loại enzym cellulase [4] Tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp chất cellulose. Tất cả các enzym cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết b-1,4 giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây: 1,4 b-D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH). Enzym cắt đầu cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzym này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase. 1,4 b-D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG). Enzym này tham gia phân giải liên kết b-1,4 glucoside trong cellulose và b-D-glucanase. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzym này còn có một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 b-D-glucanase, C-cellulase. b-D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzym này tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Trong các tài liệu khoa học, chúng có tên là cellobiase và b-glucosidase. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym EG có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose vô định hình và đặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tính như CMC, HEC. Vì vậy, để xác định hoạt tính enzym này người ta thường sử dụng cơ chất là CMC. Còn các enzym CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô định hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính. Trong hệ thống enzym CBH thì enzym CBH I tấn công từ đầu khử, trong khi CBH II tấn công vào đầu không khử của chuỗi cellulose. Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzym trên. Đầu tiên enzym EG tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của chuỗi. Tiếp sau đó các enzym CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose. Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzym thứ ba b-glucosidase. Vì vậy tuy rằng enzym b-glucosidase không có tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng nó vẫn được xếp vào hệ thống enzym cellulase. Bảng 2.1 –Sự phân loại enzym phân cắt 1,4-b-glucans Tên hệ thống Tên thường gọi EC No. Cơ chất Liên kết thủy phân Sản phẩm chính Endo 1,4-b-D-glucan-4-glucanohydrolase Cellulase, endoglucanase (EG) 3.2.1.4 Cellulose, 1,3-1,4-b-glucans 1,4-b 1,4-b-dextrins, 1,3-1,4-b-dextrins 1,3-1,4-b-D-glucan-4-glucanohydrolase Lichenase, b-glucanase 3.2.1.73 Lichenin, 1,3-1,4-b-glucans Kế 1,4-b sau 1,3-b- Hỗn hợp 1,3-1,4-b-dextrins 1,3-b-D-glucan-3/4-glucanohydrolase Laminarinase 3.2.1.6 Laminarin, 1,3-1,4-b-glucan Kế liên kết 1,4-b- hoặc 1,3-b- và sau 1,3-b- Hỗn hợp 1,3-1,4-b-dextrins 1,3-b-D-glucan-3-glucanohydrolase Laminarinase 3.2.1.39 Laminarin, pachyman (1,3-1,4-b-glucans) 1,3-b 1,3-b-dextrins (1,4-b-dextrins) Exo 1,4-b-D-glucan-cellobiohydrolase Cellobiohydrolase (CBH) 3.2.1.91 Cellulose, 1,3-1,4-b-glucans 1,4-b Cellobiose ,4-b-D-glucan-glucohydrolase Exoglucanase 3.2.1.74 1,4-b-glucans 1,4-b glucose b-glucosidase Cellobiase 3.2.1.21 b-D-glucosides 1,4-b 1,3-b 1,6-b glucose Tuy nhiên sự phân loại này chưa thật sự thỏa đáng khi một vài enzym CBH cũng có hoạt tính như enzym EG. Sự phân loại enzym cellulase trở nên phức tạp hơn khi chúng có hoạt tính trên polysaccharide như xylan. Do đó khóa phân loại mới cho những enzym này cũng như các enzym thủy phân liên kết glucoside là dựa trên sự tương đồng về cấu trúc của chúng. Điều này cần những thông tin về trật tự sắp xếp các aminoacid của chúng. Hiện nay người ta phân loại các enzym thủy phân liên kết glycoside thành 111 nhóm, trong đó enzym cellulase có trong 11 nhóm (từ nhóm 5 đến nhóm 10, 12, 26, 44, 45, và 48). [23]. Trong bài này, tên enzym được sử dụng theo cách phân loại cũ. Mối quan hệ cấu trúc-chức năng trong enzym cellulase [4] Enzym có cấu trúc 2 phần gồm phần xúc tác và phần liên kết với cơ chất là đặc trưng cho enzym phân cắt cellulose được thu nhận từ cả nấm mốc và vi khuẩn. Sự tồn tại của phần liên kết với cơ chất cũng phổ biến trên những enzym khác tham gia phân cắt cơ chất rắn. Trong enzym của nấm mốc, phần liên kết với cellulose (CBD) được liên kết với phần xúc tác bởi những liên kết tách biệt hoàn toàn giữa 2 phần này. CBD có thể là đầu C hoặc đầu N của enzym. Trong một vài trường hợp như trong enzym E4 của vi khuẩn Thermomonospora fusca, CBD là một phần cấu trúc bên trong của enzym. Một vài vi khuẩn được nghiên cứu sản xuất enzym có cấu trúc 2 phần như trên. Nhưng có điểm khác biệt là các phần được liên kết đồng hoá trị và phần xúc tác tham gia thủy phân cellulose và hemicellulose cũng như vùng liên kết với cơ chất. Hình 2.7– Cấu trúc 2 phần của enzym CBH từ Trichoderma reesei. Phần xúc tác lớn được liên kết với phần liên kết với cellulose nhỏ hơn. Nhiều VSV hiếu khí sản xuất số lượng lớn phức chất cellulosome – gồm nhiều bó sợi protein liên kết không đồng hóa trị. Cellulosome có thể bao gồm vài enzym EG, CBH, và những glycanase khác nhưng những protein cũng tham gia trong liên kết giữa cellulosome với cơ chất. Mỗi một enzym riêng biệt trong phức hệ enzym thông thường không có hoạt tính trên cellulose kết tinh, nhưng cellulosome thì có thể. Mỗi một thành phần enzym được gắn với protein không phải enzym được gọi là scaffoldin. Polypeptide của scaffoldin gồm những phần CBD lặp lại bên trong cấu trúc phân tử, phần này tương tác với enzym. Trọng lượng phân tử của cellulosome có thể đến 2000kDa. Mặc dù hiện nay đã có 13 loại CBD đã được xác định dựa vào sự tương đồng của chúng nhưng chỉ một trong chúng tồn tại trong enzym từ nấm mốc. CBD nấm mốc được phân biệt do kích thước nhỏ của chúng (<40 aminoacid). Giống như phần lớn protein liên kết với carbonhydrate, sự liên kết với cellulose chiếm ưu thế do tương tác từ các amino acid còn lại. CBD là thành phần quan trọng tạo chức năng của cellulase trên cơ chất rắn. Nếu chúng bị loại bỏ bằng các kỹ thuật protein thì cả hoạt tính và liên kết giữa cellulase và cơ chất rắn đều bị giảm nghiêm trọng. Trong nhiều nghiên cứu cho thấy rằng liên kết giữa cellulase và cellulose là không thuận nghịch, và đôi khi người ta cho rằng nguyên nhân là do CBD. Sự tương tác rất phức tạp, tuy nhiên được xem như là sự tác động lẫn nhau giữa phần xúc tác và phần liên kết, và tạo ra kết quả trong việc liên kết với cellulose. Trong enzym của nấm mốc không có bằng chứng cho rằng sự hiện diện của CBD có vai trò tác động trong việc thủy phân cellulose kết tinh. Cấu trúc không gian của protein thể hiện chi tiết tính chất hóa sinh của enzym. Vì vậy nhiều mô hình cấu trúc của cellulase đã được đề ra. Ví dụ EG I và CBH II của T.reesei có cấu trúc giống nhau 45%. So sánh cấu trúc của chúng ta thấy rằng trung tâm hoạt động của CBH I được đặt bên trong ống (tunnel) được tạo thành bởi các vòng xoắn ở bề mặt. Trong khi đó ở EG I thì các vòng xoắn này ít hơn, chính vì thế enzym này có trung tâm hoạt động có diện tích tiếp xúc rộng hơn. Hình dáng ống của trung tâm hoạt động trong CBH I cũng như trong các CBH khác, giải thích về mặt cấu trúc cho sự hoạt động của enzym. Những tunnel này càng dài giữ enzym liên kết với chuỗi cellulose càng lâu và vì vậy sự tương tác nhiều hơn khi nó di chuyển dọc theo chuỗi để thủy phân đơn vị cellobiose. Trung tâm hoạt động mở của EG cho phép chúng thủy phân ở giữa mạch cellulose. Hình 2.8- Cấu trúc của EG và CBH của Trichoderma reesei Cấu trúc này cho thấy nhóm xúc tác của CBH I được bao quanh rất chặt chẽ còn trong EG thì lỏng lẻo hơn. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzym [1] Nồng độ enzym Trong điều kiện thừa cơ chất thì tốc độ phản ứng enzym tỉ lệ tuyến tính với nồng độ enzym. Nhưng khi nồng độ enzym quá lớn tốc độ phản ứng enzym cũng tăng chậm. V= k [E] Với v: vận tốc phản ứng [E] nồng độ enzym. Hình 2.9– Aûnh hưởng nồng độ enzym đến tốc độ phản ứng Nồng độ cơ chất Mở đầu phản ứng phải tạo thành phức enzym-cơ chất, sau đó phức ES chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng enzym tự do, enzym lại kết hợp với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới. Nồng độ cơ chất càng cao tốc độ phản ứng càng tăng nhưng nồng độ cơ chất tăng đến mức độ nào đó thì dù nồng độ cơ chất có tăng nhưng tốc độ phản ứng vẫn không đổi. Hình 2.10-Aûnh hưởng nồng độ cơ chất đối với tốc độ xúc tác ban đầu Vmax Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Các chất kìm hãm hoạt động của enzym thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzym, làm giảm hoạt tính enzym nhưng lại không bị enzym làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzym bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng enzym và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng. Trong trường hợp chất kìm hãm không thuận nghịch, các chất kìm hãm kết hợp với enzym bằng liên kết đồng hóa trị. Ngoài ra các chất kìm hãm kết hợp với enzym còn theo một cơ chế khác mà hiện nay các nhà khoa học vẫn chưa giải thích trọn vẹn. Theo đó các chất kìm hãm gắn rất chặt với enzym tạo thành phức hợp EI. Phức hợp này bị phân rã rất chậm. Chất kìm hãm cạnh tranh là các chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzym. Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Do đó cơ chất không còn cơ hội tiếp xúc với trung tâm này. Và hoạt động của enzym sẽ bị giảm. Chất kìm hãm không cạnh tranh: nếu như trong cơ chế kìm hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của enzym thì trong cơ chế kìm hãm không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzym mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzym. Kết quả sự kết hợp này chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzym theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế, các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzym. Các chất hoạt hóa Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym gọi là các chất hoạt hóa enzym. Các chất hoạt hóa enzym có bản chất hóa học rất khác nhau. Chúng có thể là những anion, các kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzym. Ơû nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzym hoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzym. Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzym. Tốc độ phản ứng enzym không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzym sẽ giảm và dần đến mức triệt tiêu. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzym sẽ giảm. Khi đó enzym không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của enzym phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ. Trong quá trình phản ứng, người ta thường cho enzym phản ứng ở nhiệt độ dưới nhiệt độ tối ưu vì nếu ta để ở nhiệt độ tối ưu thì chỉ cần sự thay đổi nhỏ cũng làm cho enzym