Chiết tách và xác định cấu trúc hóa học của limonin và obAcunon từ hạt cam sành Việt Nam

25 T¹p chÝ Hãa häc, T. 38, sè 4, Tr. 25 - 30, 2000 chiÕt t¸ch vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña limonin vµ obAcunon tõ h¹t cam sµnh ViÖt Nam §Õn Tßa so¹n 18-02-2000 Bïi Kim Anh, D¬ng Anh TuÊn ViÖn Hãa häc, Trung t©m Khoa häc Tù nhiªn v* C«ng nghÖ Quèc gia Summary From seeds of Citrus nobilis two limonoids of limonin and obacunon have been isolated. Their structures were determined by spectroscopic methods, especially by 1D- and 2D-NMR spectroscopy as well as by physical constants. Më ®Çu C¸c hîp chÊt limonoit thuéc líp tetranortritecpen. Trong giíi thùc vËt chóng tån t¹i chñ yÕu ë hä cam quýt (Rutaceae), hä xoan (Meliaceae) v- hä Cneoraceae. C¸c limonoit cã nhiÒu ho¹t tÝnh sinh häc: t¸c dông h¹ sèt, ch÷a sèt rÐt, chèng c¸c khèi u [1, 7, 8, 9] v- ®Æc biÖt chóng cã t¸c dông g©y ng¸n ¨n ë c«n trïng. Mét sè hîp chÊt limonoit cã t¸c dông tG¬ng tù nhG hoocm«n lét x¸c ®èi víi c¸c Êu trïng cña c«n trïng [1, 6]. Nh»m th¨m dß kh¶ n¨ng dïng c¸c hîp chÊt limonoit tõ h¹t cam, chanh cña ViÖt Nam l-m chÊt b¶o vÖ thùc vËt, trGíc ®©y chóng t«i ®P th«ng b¸o kÕt qu¶ x¸c ®Þnh h-m lGîng v- ho¹t tÝnh g©y ng¸n ¨n cho c«n trïng cña limonin tõ h¹t chanh cña ViÖt Nam [2,10,11]. Trong b-i n-y chóng t«i th«ng b¸o viÖc ph©n lËp v- x¸c ®Þnh cÊu tróc hãa häc cña limonin (1) v- obacunon (2), t¸ch tõ h¹t cam s-nh ViÖt Nam. KÕt qu¶ v th¶o luËn H¹t cam s-nh (Citrus nobilis Lour.) sau khi ®P ®Gîc röa s¹ch, xay nhá v- lo¹i chÊt bÐo b»ng n-hexan, ®Gîc chiÕt b»ng axeton. DÞch chiÕt axeton sau khi cÊt lo¹i dung m«i, ®Gîc lo¹i t¹p chÊt b»ng ete dÇu háa. Sau ®ã chiÕt tiÕp víi cån 95% ®P thu ®Gîc hçn hîp limonoit l- chÊt r¾n, m-u v-ng r¬m. PhÇn n-y chøa chñ yÕu limonin (1). Limonin ®Gîc tinh chÕ b»ng c¸ch kÕt tinh trong hçn hîp diclometan/isopropanol. NGíc c¸i sau khi läc tña ®Gîc c« ®Æc dGíi ¸p suÊt gi¶m. CÆn ®Gîc ®Ga lªn cét silicagel. Gi¶i hÊp b»ng CHCl3 víi lGîng MeOH t¨ng dÇn sÏ thu ®Gîc obacunon (2). ChÊt 1 ®Gîc x¸c ®Þnh l- limonin dùa trªn c¸c d÷ liÖu phæ nhG sau: phæ hång ngo¹i (FTIR) cho ®Ønh t¹i
* (KBr) 1756,7 & 1720 cm-1 (lacton v- xeton cacbonyl). Phæ khèi va ch¹m electron (EIMS) kh«ng cho pic ph©n tö m- chØ cho m¶nh ë m/z = 347(100). Song, phæ khèi ion hãa hãa häc (CIMS) cho pic m/z = 471 [M+H]+ (100). Khèi phæ ion hãa hãa häc ph©n gi¶i cao cho pic[M+H]+ t¹i m/z = 471,20204 (100) phï hîp víi c«ng thøc ph©n tö C26H30O8. KÕt qu¶ n-y còng ®Gîc kh¼ng ®Þnh qua phæ 13C-NMR víi tÝn hiÖu cña 26 cacbon v- phæ 1H- NMR víi tæng sè 30 proton. Phæ 1H-NMR cho 4 singulet cña 4 nhãm metyl ë 1,12; 1,15; 1,20 v- 1,23 ppm. C¸c proton cña nhãm metylen ë vÞ trÝ 12 (CH2-12) xuÊt hiÖn t¹i 1,48 (m) v- 1,89 (m) v- vÞ trÝ H2-11 ë 1,99 (m), trong khi c¸c metylen proton ë vÞ trÝ 6 (H2-6) xuÊt hiÖn ë 2,41 (dd, J = 3,41; 14,78 Hz; H- 6a) v- 3,19 (t, J = 15,22 Hz; H-6b). Phï hîp víi 26 sè liÖu ®ã l- tÝn hiÖu cña H-5 t¹i 2,55 (dd, J = 3,34; 15,72 Hz). TÝn hiÖu cña nhãm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2122 23 24 2526 O O O O O O O O H H O O O O O O O 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2526 1 2 metylen ë vÞ trÝ 2 (H2-2) xuÊt hiÖn t¹i 2,74 (dd, J = 4,01; 16,45 Hz, H-2a) v- 2,87 (dd, J = 1,41; 16,46 Hz, H-2b) do tG¬ng t¸c víi H-1. TÝn hiÖu cña H-1 xuÊt hiÖn nhG mét dublet réng ë 4,27 (bd, J = 3,85 Hz). TÝn hiÖu cña H- 9 l- mét triplet ë 2,80 (t, J = 5,63 Hz), trong khi tÝn hiÖu cña proton H-15 ë vßng epoxy thuéc vßng D-lacton l- mét singulet ë  4,08. TÝn hiÖu cña nhãm metylen ë vÞ trÝ 19 thuéc vßng A-lacton xuÊt hiÖn dGíi d¹ng 2 doublet ë 4,64 (d, J = 13,15 Hz, H-19a) v- 4,99 (d, J = 13,15 Hz, H-19b). TÝn hiÖu cña H-17  l- mét singulet t¹i 5,53 ppm. Sau cïng l- tÝn hiÖu cña c¸c proton vßng furan ë vïng trGêng thÊp. TÝn hiÖu cña H-21 l- mét dublet víi h»ng sè tG¬ng t¸c vinylic nhá t¹i 7,62 (d, J = 0,85 Hz), trong khi tÝn hiÖu cña H-23 xuÊt hiÖn t¹i 7,56 v- H- 22 t¹i 6,51 (d, J = 1,73 Hz). TrGíc ®©y Dreyer [12] ®P nghiªn cøu phæ 1H-NMR cña nhiÒu hîp chÊt limonoit, trong ®ã cã limonin. Song, chØ nh÷ng tÝn hiÖu cña proton vßng furan, H-17, H- 19, H-1, H-15 v- cña c¸c nhãm metyl l- ®Gîc nghiªn cøu. Phæ 13C-NMR cña 1 còng cho kÕt qu¶ phï hîp víi cÊu tróc cña limonin. TÝn hiÖu cña xeton cacbon (C-7) xuÊt hiÖn t¹i vïng trGêng thÊp 208,25 ppm, tiÕp ®ã l- tÝn hiÖu cña 2 lacton cacbon t¹i 170,10 (C-3) v- 167,68 ppm (C-16). TÝn hiÖu cña c¸c cacbon olefinic cña vßng furan xuÊt hiÖn t¹i 144,14 (C-23), 142,51 (C-21), 121,74 (C-20) v- 111,00 (C-22). Nh÷ng tÝn hiÖu cña cacbon mang nhãm chøa oxi xuÊt hiÖn t¹i 80,62 (C-4), 80,07 (C-1) v- 78,58 (C-17). Hai cacbon cña vßng epoxy cã tÝn hiÖu t¹i 67,32 (C-14) v- 54,92 (C-15). Phæ 13C-NMR cña limonin trong c¸c dung m«i kh¸c dung m«i chóng t«i sö dông (axeton - d6) ®P ®Gîc mét sè t¸c gi¶ c«ng bè trGíc ®©y [13, 14]. ViÖc g¸n phæ 1H- v- 13C-NMR cña limonin ®Gîc thùc hiÖn dùa trªn c¬ së ph©n tÝch phæ 1H- COSY; 1H, 13C-HMBC (b¶ng 1), 1H, 13C-HSQC- DEPT v- 1H-NOESY. KÕt qu¶ ®Gîc ®Ga ra ë b¶ng 3. ChÊt 2 ®Gîc x¸c ®Þnh l- obacunon dùa trªn c¸c d÷ liÖu phæ nhG sau: Phæ hång ngo¹i cho ®Ønh hÊp thô cña nhãm cacbonyl t¹i 1743,3 v- 1703 cm-1. Phæ khèi va ch¹m electron (EIMS) kh«ng cho pic ph©n tö (hoÆc pic ph©n tö qu¸ nhá), m- cho pic c¬ b¶n t¹i m/z 331. Song, phæ khèi ion hãa hãa häc (CIMS) cho pic c¬ b¶n t¹i m/z 455 [M+H]+, nhG vËy chÊt 2 cã träng lGîng ph©n tö l- 454. Phæ khèi ion hãa hãa häc ph©n gi¶i cao cho pic c¬ b¶n t¹i m/z 455,20611 phï hîp víi pic [M+H]+ cña c«ng thøc cÊu t¹o C26H30O7 cña chÊt 2 v- phï hîp víi kÕt qu¶ trªn phæ 1H- v- 13C-NMR víi tÝn hiÖu cña 30 proton v- 26 cacbon. ë phæ 1H-NMR, 5 singulet cña nhãm metyl xuÊt hiÖn t¹i  1,12, 1,30, 1,41, 1,50 v- 1,53 ppm. §¸ng chó ý ë ®©y l- tÝn hiÖu cña 3 nhãm metyl 19, 25 v- 26 bÞ dÞch chuyÓn vÒ trGêng thÊp do ¶nh hGëng kh«ng ®¼ng hGíng cña 27 nhãm cacbonyl v- nèi ®«i. TÝn hiÖu cña proton H-12a xuÊt hiÖn t¹i 1,49 v- bÞ che lÊp bëi tÝn B¶ng 1: Phæ tG¬ng t¸c xa 1H-, 13C-HMBC cña limonin (1) H1 H2 H5 H6 H9 H11 H12 H15 H17 H18 H19 H21 H22 H23 H24 H25 H26 C1 x x x C3 x x C4 x x x C5 x x x x C7 x x C8 x x C9 x x x C10 x C11 x C12 x C13 x x C14 x x x C16 x C17 x x C18 x x C20 x C21 x x x C22 x C23 x x C25 x C26 x B¶ng 2: Phæ tG¬ng t¸c xa 1H, 13C-HMBC cña obacunon (2) H1 H2 H5 H6 H9 H11 H12 H15 H17 H18 H19 H21 H22 H23 H24 H25 H26 C1 x C3 x x C4 x x x C5 x x x x x C6 x C7 x x x C8 x C9 x x 28 C10 x x x x x C11 x x C12 x x x C13 x x C14 x x x C15 x C16 x C17 x x C18 x C19 x C20 x x x x C21 x x x C22 x x C23 x x C25 x x C26 x B¶ng 3: Sè liÖu phæ 1H- v- 13C-NMR cña limonin (1), obacunon (2) Limonin (1) Obacunon (2) VÞ trÝ  13C  1H  13C  1H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 78,29 35,64 169,23 79,72 59,24 36,43 207,46 51,23 47,66 45,95 18,27 30,30 4,27 (bd, J = 3,85) 2,87 (dd, 1,41 v- 16,46) 2,74 (dd, 4,01 v- 16,46) 2,55 (dd, 3,31 v- 15, 72) 2,41 (dd, 3,41 v- 14,78 3,19 (t, 15,22) 2,80 (t, 5,63) 1,99 (m) 1,48 (m); 1,89 (m) 158,54 123,02 167,42 84,26 57,52 40,50 208,68 53,64 49,69 44,00 20,06 33,14 6,80 (d, J = 11,75) 5,86 (d, J = 11,75) 2,79 (dd, J = 5,3; 14,1) 2,28 (trïng); 3,15 (t, J = 14,1) 2,30 (trïng) 1,87 - 2,02 (m) 1,49 (trïng); 1,87 - 2,02 (trïng) 13 38,31 38,21 14 66,37 66,12 15 54,03 4,08 (s) 54,04 3,68 (s) 16 167,10 167,24 29 Limonin (1) Obacunon (2) VÞ trÝ  13C  1H  13C  1H 17 77,85 5,53 (s) 78,67 5,50 (s) 18 19,92 21,29 1,12 (s) 19 65,03 4,64 (d, 13,15); 4,99 (d, 13,15) 16,86 1,53 (s) 20 121,14 121,64 21 141,62 7,62 (d, 0,85) 142,39 7,65 (bs) 22 110,01 6,51 (d, 1,73) 111,01 6,51 (bs) 23 143,40 7,56 (d, 1,73) 144,11 7,57 (bs) 24 16,94 1,15 (s) 17,11 1,30 (s) 25 20,94 1,12 (s) 32,14 1,41 (s) 26 29,41 1,23 (s) 27,18 1,50 (s) *) H»ng sè tG¬ng t¸c tÝnh b»ng Hz ®Ó trong ngoÆc. *) s: singulet; d = dublet; bd = dublet tï; bs = singulet tï; m = multiplet; dd = dublet kÐp *) Dung m«i: axeton - d6 hiÖu cña 2 nhãm metyl, trong khi tÝn hiÖu cña proton H-12b cïng víi 2 proton H2-11 xuÊt hiÖn t¹i vïng tõ 1,87 - 2,02 ppm dGíi d¹ng mét multiplet. TÝn hiÖu cña proton H-6a v- H-9 cïng xuÊt hiÖn nhG mét multiplet ë vïng tõ  2,27 - 2,34, trong khi tÝn hiÖu cña H-6b l- mét triplet t¹i 3,15 ppm (J = 14,1 Hz). TÝn hiÖu cña proton H-5 l- mét dublet kÐp t¹i 2,79 ppm (J = 5,3, 14,1 Hz) do tG¬ng t¸c víi H-6a v- H- 6b. TÝn hiÖu cña proton vßng epoxy H-15 l- mét singulet t¹i 3,68 ppm. So víi limonin (4,08 ppm) th× H-15 cña obacunon ®P dÞch chuyÓn vÒ trGêng cao h¬n ( = 0,40 ppm). Nguyªn nh©n l- ®P cã sù kh¸c nhau vÒ cÊu d¹ng ë vßng A gi÷a 2 chÊt. Proton H-17 còng cho mét singulet t¹i 5,50 ppm. Hai proton olefinic H-1 v- H-2 cho 2 dublet t¹i  6,80 v- 5,86 ppm tG¬ng øng víi h»ng sè tG¬ng t¸c J = 11,75 Hz. Gi¸ trÞ h»ng sè tG¬ng t¸c lín chøng tá H-1 v- H-2 ë vÞ trÝ trans víi nhau. C¸c proton cña vßng furan cho c¸c tÝn hiÖu t¹i 7,65 (H-21), 7,57 (H-23) v- 6,51 (H-22) (b¶ng 3). Phæ 13C-NMR cña 2 còng cho c¸c sè liÖu phï hîp víi phæ 1H-NMR. TÝn hiÖu cña xeton cacbonyl xuÊt hiÖu t¹i 208,68, cña A v- D- lacton cacbonyl t¹i 167,42 v- 167,24. TÝn hiÖu cña hai cacbon olefinic ë vßng A-lacton xuÊt hiÖn t¹i 158,54 v- 123,02 (C-1 v- C-2). Bèn nguyªn tö cacbon olefinic cña vßng furan cho tÝn hiÖu t¹i 144,11 (C-23); 142,39 (C-21); 121,64 (C-20) v- 111,01 (C-22). C¸c nguyªn tö cacbon mang nhãm oxy cña vßng A v- D- lacton cho tÝn hiÖu phï hîp t¹i 84,26 v- 78,67ppm. ViÖc g¸n tÊt c¶ c¸c tÝn hiÖu trong phæ 1H- v- 13C-NMR cña chÊt 2 dùa trªn c¬ së ph©n tÝch c¸c phæ 1H-COSY, 1H-NOESY, 1H, 13C-HSQC- DEPT v- 1H, 13C-HMBC (b¶ng 2). PhÇn thùc nghiÖm ThiÕt bÞ v hãa chÊt H¹t cam s-nh ®Gîc thu t¹i H- B¾c tõ th¸ng 11/1997 ®Õn th¸ng 3/1998. Phæ hång ngo¹i cã biÕn ®æi Fourier (FTIR) ®Gîc ®o trªn m¸y IMPACT 410 cña hPng Carl Zeiss Jena, CHLB §øc. Phæ khèi EI-MS ®o trªn m¸y Micromass (Anh) CI-MS ph©n gi¶i thGêng v- ph©n gi¶i cao ®Gîc ghi trªn m¸y Finigan Mü. Phæ 1H- v- 13C- NMR ®o trªn m¸y Bruker 400 MHz cho 1H- v- 100 MHz cho 13C-NMR. TMS ®Gîc sö dông 30 l-m néi chuÈn cho 1H-NMR v- tÝn hiÖu dung m«i l-m chuÈn cho 13C-NMR. §iÓm nãng ch¶y ®o trªn m¸y Boetius cña §øc v- kh«ng hiÖu chØnh. []D ®Gîc ®o trªn m¸y DIP 1000 Digital Polarimeter Ver. 100-19, §øc. S¾c ký cét dïng silicagel Merck 60G, s¾c ký líp máng ph©n tÝch dïng b¶n SiO2 tr¸ng s½n trªn ®Õ nh«m cña Merck. 500 g h¹t cam s-nh ®Gîc l-m s¹ch khái c¸c t¹p chÊt c¬ häc, sÊy kh« ë 105°C trong 12 giê, xay nhá v- chiÕt Soxhlet víi 1 lÝt n-hexan trong 10 giê ®Ó lo¹i chÊt bÐo. Sau ®ã chiÕt víi 1 lÝt axeton trong 12 giê. DÞch chiÕt axeton ®Gîc cÊt lo¹i dung m«i dGíi ¸p suÊt gi¶m, ®em lo¹i t¹p chÊt b»ng ete dÇu háa, råi chiÕt tiÕp víi cån 95% ®P thu ®Gîc 4 g hçn hîp limonoit l- chÊt r¾n m-u v-ng s¸ng. PhÇn n-y cho chñ yÕu l- limonin (chÊt 1). Limonin ®Gîc tinh chÕ b»ng c¸ch kÕt tinh trong hçn hîp diclometan- isopropanol thu ®Gîc 2,4 g limonin (hiÖu suÊt 0,48 % theo träng lGîng h¹t kh«). Limonin tinh chÕ ®Gîc cã ®iÓm nãng ch¶y 295 - 296°C; []D 20 = -113,5° [TLTK 1: []D 20 = -125°, axeton; mp.: 298°C]. PhÇn nGíc c¸i sau khi c« ®Æc thu ®Gîc 1,4 g. CÆn n-y ®Gîc ®Ga lªn cét silicagel Merck (120 g SiO2) hÖ dung m«i röa gi¶i CHCl3-MeOH 99 : 1. Chóng t«i ®P thu ®Gîc 3 mg obacunon cã ®iÓm nãng ch¶y 222- 225°C; []D 20 =- 49,7° (C = 0,6; cloroform) [TLTK 15: []D 20 = -50° (cloroform); mp.: 229- 230°C]. Lêi c¶m ¬n: Chóng t«i xin ch©n th-nh c¶m ¬n TS. B. Fugmann v- TS. K. Justus (HPng Bayer AG, CHLB §øc) ®P gióp ghi v- biÖn luËn phæ MS v- NMR. Ti liÖu tham kh¶o 1. W. Steglich, B. Fugmann, S. Lang- Fugmann. RÖMPP Lexikon. Naturstoffe, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. New York (1997). 2. Bïi Kim Anh. LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc hãa häc. ViÖn Hãa häc, 1998. 3. M. J. Mendel et al. Physiology and Chemical Ecology, Vol. 22, No. 1, P. 167 - 173 (1993). 4. M. J. Mendel et al. Entomology Exp. Appl. 58, P. 141 - 4 (1991). 5. Yong-Biao Liu et al. J. of Economic Entomology, Vol. 84, No. 4, P. 1154 - 7 (1991). 6. M. J. Mendel et al. J. of Economic Entomology. Vol. 84, No. 4, P. 1158 - 1162 (1991). 7. H. Matsuda et al. Planta Medica, 64, P. 339 - 342 (1998). 8. H. Matsuda et al. Biol. Pharm. Bull. 20(3), P. 243 - 8 (1997). 9. E. G. Miller et al. Nutr. - Cancer. Hilsdale, N. J. Lawrence. Erlbaum. Assiates, Inc., Vol. 17 (1), P. 1 - 7 (1992). 10. DG¬ng Anh TuÊn, Bïi Kim Anh, NguyÔn Duy Trang, Phan §×nh Ch©u. SO3B, p.100, Abstracts from ASOMPS IX. H- Néi, 24- 28 Sept. 1998. 11. DG¬ng Anh TuÊn, Bïi Kim Anh, NguyÔn Duy Trang, Phan §×nh Ch©u. TuyÓn tËp b¸o c¸o héi nghÞ hãa häc to-n quèc lÇn thø 3, tËp 1, Tr. 52 - 55, H- Néi 10/1998. 12. D. L. Dreyer. Tetrahedron (1965), Vol. 21, P. 75-78. 13. Fortschritte in Chemie der Naturstoffe, Vol. 36. 14. Tetrahedron, Vol. 32, P. 2367 (1976).