Chiết xuất diterpen lacton toàn phần từ lá xuyên tâm liên

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 CHIẾT XUẤT DITERPEN LACTON TOÀN PHẦN TỪ LÁ XUYÊN TÂM LIÊN [6], [12], [28], [35], [54], [55], [61], [63] Dựa vào bảng 1.1 thể hiện phần trăm tổng các diterpen lacton trong Xuyên tâm liên khi thu hoạch ở các thời điểm tăng trưởng khác nhau. Ở cả 2 mẫu thì tại thời điểm nở hoa có tổng % diterpen lacton cao nhất và hàm lượng diterpen lacton trong lá có sự chênh lệch cao so với thân vì vậy lá được chọn làm nguyên liệu chiết xuất. Từ 10 kg Xuyên tâm liên dạng khô, loại bỏ thân, rễ thu lấy lá, xay nhỏ thu được 3,8kg, Làm ẩm bột lá (3,4kg), rồi cho vào bình ngấm kiệt dung tích 10 lít, ngâm qua đêm với MeOH. Rút dịch chiết với tốc độ 10 ml/phút, theo dõi khi dung môi xuống xấp mặt bột lá, bổ sung dung môi để đạt tỉ lệ dược liệu: dung môi là 1:6. Loại chlorophyl bằng than hoạt tính với tỉ lệ than là 15%. Thu được khoảng 20 lít dịch chiết, sau khi cô thu hồi bằng máy cô quay thu được 500 g cao loại màu tương đương với 14,7% (khối lượng cao/ khối lượng bột lá) cao hơn so với Subhash C. Mandal và cs tỷ lệ chiết bằng MeOH là 9,37%, chứng tỏ sử dụng phương pháp ngấm kiệt với dung môi là MeOH tỷ lệ 1:6 chiết kiệt hơn so với kết quả đã công bố của Subhash C. Mandal bằng phương pháp Soxhlet. Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất diterpen lacton toàn phần từ lá XTL [6, 55, 63] Nguyên liệu Thu 500 g cao loại màu Chiết bằng pp ngấm kiệt (MeOH) Tỷ lệ 1:6 Xay bột (3,4kg) Cô chân không Dịch chiết loại tạp bằng than hoạt KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 Hình 3.1 Cao chiết loại màu Hình 3.2 SKLM so sánh cao toàn phần (CTP) với diterpen lacton đối chiếu (C) Vậy cao toàn phần có 3 chất là andrographolid, neoandrographolid, dehydroandrographolid. 3.2 PHÂN LẬP 3 DITERPEN LACTON CHÍNH TỪ CAO CHIẾT XTL 3.2.1 Phân lập A1[63] Dựa vào khả năng kết tinh dễ dàng của A1 trong dung môi MeOH bằng phương pháp kết tinh lạnh, tiến hành hòa tan 500g cao chiết loại màu với lượng MeOH nóng vừa đủ. Làm lạnh và để qua đêm, thu được 6,9 g kết tinh màu vàng. Lượng kết tinh này được rửa và tái kết tinh nhiều lần với MeOH lạnh, thu được 5,9 g tinh thể A1 có hình phiến, màu trắng. Dịch MeOH còn lại được cô thành cao. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 47 Sơ đồ 3.2. Quy trình phân lập A1 [55], [63] Hình 3.3 Tinh thể A1 qua các lần kết tinh: lần 1 (a), lần 2 (b), lần 3 (c), lần 4 (d) Cao đã loại màu 6,887g tinh thể Kết tinh lạnh Dịch MeOH còn lại Tái kết tinh nhiều lần (thu 5,9 g A1) Cô lại thành cao A2-3 a b c d KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 3.2.2 Phân lập A2 và A3 Thăm dò điều kiện sắc ký cột [3], [12], [63] Sắc ký cột cổ điển: Chuẩn bị cột sắc ký với lượng silicagel gấp 25 lần lượng mẫu. Cột được ổn định và khai triển bắt đầu với CHCl3, tăng dần đến hệ CHCl3-MeOH (99:1) (63), mỗi bước tăng 0,5% MeOH ứng với 5 phân đoạn 100 ml. Kết quả thu được phân đoạn 6 - 10 có A2. Tiếp tục tăng dần đến hệ CHCl3-MeOH (99:5) phân đoạn 31-38 có A3. Các phân đoạn A2 được gom lại và cô đuổi hết dung môi. Hòa cắn lại với CHCl3 vừa đủ, tiếp tục cho qua cột nhỏ để loại tạp với hệ CHCl3 - MeOH, tăng dần hệ CHCl3-MeOH mỗi bước tăng 0,2% để thu được phân đoạn A2 sạch nhất, thu phân đoạn này, cô đến cắn, sau đó hòa tan trở lại với một lượng MeOH nóng vừa đủ, để trong điều kiện lạnh, thu kết tinh, tái kết tinh lần thứ hai thu được 0,8g kết tinh A2. Tương tự với A3 cũng cho qua cột nhỏ hơn và cung tăng dần hệ CHCl3-MeOH mỗi bước tăng 0,2% để loại tạp, sau đó tiến hành kết tinh lạnh và tái kết tinh nhiều lần thu được 0,23g tinh thể A3. Sơ đồ 3.3 Quy trình phân lập (A2), (A3) Cao A2-3 Phân đoạn 31-38 Qua cột sắc ký cổ điển Phân đoạn 6-10 Gom các phân đoạn có A3, cô lại Gom các phân đoạn có A2, cô lại Kết tinh và tái kết tinh (thu được A3) Kết tinh và tái kết tinh (thu được A2) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 49 Hình 3.4 Tinh thể A2 qua các lần kết tinh: lần 1 (a), lần 2 (b), lần 3(c) Hình 3.5 Tinh thể A3 qua các lần kết tinh: lần 1 (a), lần 2 (b), lần 3 (c), lần 4(d), lần 5(e) 3.3 XÁC ĐỊNH LÝ HÓA TÍNH VÀ CÁC PHỔ NGHIỆM CỦA 3 DITERPEN LACTON PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.3.1 Cảm quan A1 có tinh thể hình phiến, không màu, không mùi, vị rất đắng. A2 có tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị đắng. A3 có tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, không có vị đắng. Cả 3 tan trong MeOH, EtOH, CHCl3, CH2Cl2. Tan kém trong nước. a b c c d e a b c KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 50 ¾ Nhận xét: Tính chất của A1, A2, A3 phù hợp với tài liệu của tác giả C. Patarapanich, G.A. Akowuah. 3.3.2 Phản ứng hóa học Phản ứng tạo màu với thuốc thử Kedde, cho màu hồng tím đặc trưng của vòng lacton 5 cạnh. Cho vào ống nghiệm khoảng 1 mg tinh thể, thêm 1 ml MeOH vào hòa tan, nhỏ thêm 250 µl thuốc thử Kedde A và 250 µl thuốc thử Kedde B, lắc đều. Bảng 3.1 Kết quả phản ứng màu của A1, A2, A3 A1 A2 A3 Diterpen lacton đối chiếu (C) Hồng tím Hồng tím Hồng tím Hồng tím C: diterpen lacton đối chiếu Hình 3.6 Kết quả phản ứng màu của A1, A2, A3 ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 có phản ứng của vòng lacton 5 cạnh. 3.3.3 Điểm nóng chảy Điểm nóng chảy đo theo phương pháp mao quản trên máy Stuart SMP3. Bảng 3.2 Kết quả đo điểm nóng chảy của A1, A2, A3 [17], ]23] A1 Andrographolid Điểm nóng chảy (0C) 229 226-230 A2 Dehydroandrographolid Điểm nóng chảy (0C) 208 203-204 A3 Neoandrographolid Điểm nóng chảy (0C) 170 167-174 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 51 ¾ Nhận xét: điểm nóng chảy của A1, A2, A3 tương đương với điểm nóng chảy của andrographolid, dehydroandrographolid, neoandrographolid. 3.3.4 Sắc ký lớp mỏng Tiến hành sắc ký trên bản mỏng silicagel F254, dung môi CHCl3-MeOH (9:1), nồng độ dịch chấm 1 mg/ml trong MeOH, thể tích chấm 10 µl, khoảng khai triển 8 cm, phát hiện ở UV 254 nm và thuốc thử anisaldehyd sulfuric ở 1100C/5 phút. . UV 254 nm Thuốc thử anisaldehyd C: diterpen lacton đối chiếu, A1, A2, A3: 3 diterpen lacton phân lập Hình 3.7 SKLM so sánh A1, A2, A3 với diterpen lacton đối chiếu Bảng 3.3 Kết quả SKLM so sánh A1, A2, A3 với chuẩn UV 254 Rf Anisaldehyd A1 Tắt quang 0,33 Nâu A2 Tắt quang 0,54 Xám A3 Không tắt quang 0,15 Tím Vết 1 Tắt quang 0,55 Nâu Vết 2 Tắt quang 0,33 Xám Diterpen lacton đối chiếu Vết 3 Không tắt quang 0,14 Tím ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 cho vết có trị số Rf và màu sắc tương ứng với 3 vết của chuẩn diterpen lacton đối chiếu, trong đó vết A1 có Rf và màu sắc tương ứng với andrographolid đối chiếu, A1, A2, A3 chỉ cho một vết cho thấy chúng không lẫn tạp. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52 3.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao Cân chính xác khoảng 1 mg tinh thể, hòa tan trong bình định mức 10 ml với MeOH, thêm MeOH đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện như mục 2.5. Phát hiện ở bước sóng hấp thu cực đại của mỗi chất. Hình 3.8 Sắc ký đồ của dung dịch chứa A1 Bảng 3.4. Thời gian lưu và diện tích đỉnh của dung dịch chứa A1 Đỉnh Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh % diện tích đỉnh % chiều cao đỉnh 1 1,6 1019 143 0,02 0,023 2 1,736 1670 329 0,033 0,053 3 1,916 8227 1230 0,164 0,198 4 2,853 1133 290 0,023 0,047 5 4,290 1062 141 0,021 0,023 6 5,358 2047 258 0,041 0,042 7 5,816 5006948 618477 99,698 99,615 Tổng 5022106 620869 100,000 100,000 A1 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 100 200 300 mAU Top / 5.135 min Dow nslope / 5.274 min Upslope / 4.936 min Hình 3.9 Độ tinh khiết của đỉnh A1 ¾ Nhận xét: Sắc ký đồ có một pic có tR = 5,816 phút chiếm hàm lượng 99,698% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ, đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 225 nm, độ tinh khiết của pic đạt. 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min 0 25 50 75 100 125 mAU 250nm,4nm (1.00) 2. 89 4 3. 04 9 9. 25 6 Hình 3.10 Sắc ký đồ của dung dịch chứa A2 Bảng 3.5 Thời gian lưu và diện tích đỉnh của dung dịch chứa A2 Đỉnh Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh % diện tích đỉnh % chiều cao đỉnh 1 2,894 3203 355 0,257 0,554 2 3,049 1447 576 0,116 0,900 3 9,256 1240593 63123 99,627 98,547 Tổng 1245243 64053 100,000 100,000 A2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 54 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 25 50 75 mAU Top / 9.256 min Dow nslope / 9.440 min Upslope / 9.044 min Hình 3.11 Độ tinh khiết của đỉnh A2 ¾ Nhận xét: Sắc ký đồ có một pic có tR = 9,25 phút chiếm hàm lượng 99,63% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ, đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 250 nm, độ tinh khiết của pic đạt. Hình 3.12 Sắc ký đồ của dung dịch chứa A3 Bảng 3.6 Thời gian lưu và diện tích đỉnh của dung dịch chứa A3 Đỉnh Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh % diện tích đỉnh % chiều cao đỉnh 1 2,310 2358 312 0,180 0,551 2 3,845 3092 216 0,236 0,381 3 5,230 6576 315 0,502 0,556 4 8,794 1297946 55788 99,082 98,512 Tổng 1309973 56631 100,000 100,000 A3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 55 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 nm 0 25 50 75 100 125 150 mAU Top / 8.793 min Dow nslope / 8.975 min Upslope / 8.550 min Hình 3.13 Độ tinh khiết của đỉnh A3 ¾ Nhận xét: Sắc ký đồ có một pic có tR = 8,79 phút chiếm hàm lượng 99,08% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ, đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 202 nm, độ tinh khiết của pic đạt. 3.3.6 Phổ tử ngoại Kết quả chụp phổ UV của AP, NP, DP được trình bày ở PL 2.2, số liệu được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7 Đỉnh hấp thu UV của A1, A2, A3 [17, 23] A1 Andrographolid Đỉnh thấp thu (nm) 225 223 A2 Dehydroandrographolid Đỉnh thấp thu (nm) 251 250 A3 Neoandrographolid Đỉnh thấp thu (nm) 201 202 ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 có đỉnh hấp thu UV tương ứng với đỉnh hấp thu UV của andrographolid, dehydroandrographolid, neoandrographolid. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 56 3.3.7 Phổ hồng ngoại Kết quả chụp phổ UV của AP, NP, DP được trình bày ở PL 2.3, số liệu được trình bày trong bảng 4.7. Bảng 3.8 So sánh phổ IR của A1 và andrographolid IR (cm-1) Nhóm chức A1 Andrographolid [65] -OH -CH2- C =O (Vòng lacton) C=C =CH2 3398,3 2868,0 1728,1 1674,1 906,5 3450 2880 1730,0 1674,1 906,5 Bảng 3.9 So sánh phổ IR của A2 và dehydroandrographolid IR (cm-1) Nhóm chức A2 Dehydroandrographolid [28] -OH -CH2- C =O (Vòng lacton) C=C =CH2 3300 2850,6 1755 1637,5 883,3 3422 2880 1741 1640 883 Bảng 3.10 So sánh phổ IR của A3 và neoandrographolid IR (cm-1) Nhóm chức A3 Neoandrographolid [67] -OH -CH2- C =O (Vòng lacton) C=C =CH2 3386,8 2848,7 1747,4 1649,0 910,3 3300 2880 1748 1640 909 ¾ Nhận xét: A1, A2, A3 có các đỉnh hấp thu IR tương ứng với đỉnh hấp thu IR của andrographolid, dehydroandrographolid, neoandrographolid. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 57 3.3.8 Phổ khối (MS) Bảng 3.11 So sánh khối phổ MS của A1 và Andrographolid A1 Andrographolid [M + H]+ 351 351 A2 Dehydroandrographolid [M + H]+ 333 333 A3 Neoandrographolid [M + H]+ 481 481 Kết quả phổ MS: ESI-MS (pos.) [M+H]+ =351, khối lượng của phân tử A1 là 350, bằng với khối lượng phân tử của andrographolid (C20H30O5, M=350). ESI-MS (pos.) [M+H]+ = 333, khối lượng phân tử A2 là 332 bằng với khối lượng phân tử của dehydroandrographolid (C20H28O4, M=332). ESI-MS (neg.) [M-H+2H2O]- = 515, ESI-MS (pos.) [M+H]+ = 481. Vậy khối lượng phân tử của A3 là 480, bằng với khối lượng phân tử của neoandrographolid (C26H40O8, M=480). 3.3.9 Phổ proton NMR (1H-NMR) (Xem ở PL 5,6,7) Bảng 3.12 Dữ liệu phổ 1H-NMR (δ, 500 MHz) của các hợp chất A1( trong CDCl3 & MeOD), A2 và A3 (trong C6D5N) δH, ppm C A1 AP [66] A2 DP [64] A3 NP [66] 1 1,82 (H, m) 1,26 (H, m) 1,80 (H, m) 1,28 (H, m) 2 1,79 (2H, m) 1,78 (2H, m) 3 3,42 (H, m) 3,38 (H, m) 3,64 brt 0,93 (2H) 0,94 (2H) 5 1,30 (H, m) 1,32 (H, m) 6 1,26 (H, m) 1,85 (H.m) 1,28 (H, m) 1,90 (H, m) 7 2,01 (H, m) 2,42 (H, m) 2,04 (H, m) 2,42 (H, m) KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 58 9 1,98 (H, dd.) 1,91 (H, dd. 9,4; 5,0) 11 2,57 (2H, m) 2,58 (2H, m) 7,14 (dd.10,5;16,0) 7,15(dd,10,3;15,5) 12 6,92 (H, dd.) 6,83 (H, dd. 6,7; 5,4) 6,26 (d,15,5) 6,40 (d,15,5) 2,20 (H,m) 2,50 (H,m) 2,34 (H,m) 2,51 (H,m) 14 4,97 (H, d.) 5,00 (H, d. 6,0) 7,32 m 7,36 m 7,15 (H,t, 1,5) 7,15 (H,t,1,5) 15 4,45 (H, dd.) 4,46 (H, dd.10,2; 6,1) 4,78 s 4,80 s 4,72 (2H) 4,72 (2H) 16 17 4,89 (2H, s) 4,87 (2H) 4,7 (brd. 1,5) 4,86 (d. 1,5) 4,81 brd 4,88 (d, 7,8) 4,70 (Ha,s) 4,91 (Hb,brs) 4,70 (Ha,s) 4,91 (Hb,brs) 18 1,23 (H, s) 1,28 (3H, s) 1,51 s 1.54 s 1,17 (3H,s) 1,18 (3H,s) 19 4,17 (H, d.) 3,31 (H, d.) 4,12 (H, d. 11,5) 3,35 (H, d. 11,5) 4,47 (d. 11,0), 2,38 (1H,d, 10,0; H-19a) 4,12 (d.12,0) 4,50 (d.11,0) 3,52 (Ha,d. 9,5) 4,32 (Hb,d. 9,5) 3,49 (Ha,d. 9,5) 4,32 (Hb,d. 9,5) 20 0,74 (3H, s) 0,74 (3H, s) 0,88 s 0,98 s 0,63 (3H,s) 0,64 (3H,s) 1’ - - - - 4,82 (H,d,J=7) 4,81 (H,d. 8,0) 2’ - - - - 4,03 (H,m) 4,02 (H,m) 3’, 4’ - - - - 4,19-4,24 (2H,m) 4,19-4,23 (2H,m) 5’ - - - - 3,95 (H,m) 3,94 (H,m) 6’ - - - - 4,38 (Ha,dd. 12,0;5,5) 4,54 (Hb,dd. 12,0;3,0) 4,37 (Ha,dd.12,0;5,5) 4,53 (Hb,dd. 11,5) 3.3.10 Phổ carbon 13 NMR (13C-NMR) (Xem ở PL 5,6,7) Nơi thưc hiện: Viện Hóa Học-Trung tâm KHTN và Công Nghệ Quốc Gia, Hà Nội. Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 13C -NMR của các hợp chất A2, A3 (δ, C6D5N, 125 MHz) δC, ppm C DEPT A2 Dehedroandro grapholid [64] DEPT A3 Neoandrogra pholid [66] 1 2 3 4 CH2 CH2 CH q 39,0 28,9 80,2 43,4 38,7 28.9 80,2 43,3 CH2 CH2 CH2 q 39,0 19,4 36,4 39,8 39,2 19,5 36,6 39,9 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 59 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ CH CH2 CH2 q CH q q CH q CH CH2 q CH2 CH3 CH2 CH3 - - - - - - 54,8 23,7 37,0 149,3 61,9 38,8 135,1 122,0 129,0 145,0 70,3 172,8 108,8 23,7 64,2 16,0 - - - - - - 55,6 24,7 37,4 149,3 61,9 39,5 134,2 122,0 129,0 145,3 70,6 174,5 108,0 23,7 64,2 16,0 - - - - - - CH CH2 CH2 q CH q CH2 CH2 CH CH CH2 q CH2 CH3 CH2 CH3 CH CH CH CH CH CH2 56,2 25,0 38,6 148,2 56,7 38,7 22,1 24,7 134,2 145,3 70,6 174,6 106,9 28,1 72,6 15,4 105,4 75,3 78,7 71,8 78,3 62,9 56,3 25,1 38,9 148,3 56,8 38,7 22,2 24,8 134,3 145,3 70,6 174,0 107,0 28,2 72,7 15,5 105,5 75,4 78,8 72,0 78,4 63,0 ™ Nhận xét chung: Qua các kết quả kiểm tra về cảm quan, phản ứng hóa học, nhiệt nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phổ IR, phổ UV và HPLC, MS và NMR có thể khẳng định A2 là dehydroandrographolid, A3 là neoandrographolid, A1 so sánh với andrographolid đối chiếu đã xác định phổ MS và NMR [1] được kết luận là andrographolid. Các chất này có độ tinh khiết trên 98% nên có thể dùng làm chuẩn đối chiếu cho định tính, định lượng và thử hoạt tính sinh học. Hình 3.14 Công thức cấu tạo của andrographolid, neoandrographolid, dehydroandrograhpholid KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60 3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3.4.1 Thăm dò điều kiện tách 3 diterpen lacton trên HPLC Sau khi xác định A1, A2, A3 lần lượt là andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid, các chất này được dùng làm chuẩn đối chiếu cho quá trình định lượng diterpen lacton trong dược liệu Xuyên tâm liên. Ba chất được trộn chung để thăm dò khả năng tách trên HPLC. Thử trên hệ dung môi methanol: Cân chính xác khoảng 1 mg mỗi chất andrographolid (AP), dehydroandrographolid (DP) và neoandrographolid (NP), hòa tan với hệ dung môi MeOH: H2O tỷ lệ 85:15, 75:25, 65:35, 55:45, 50:50 trong bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký với điều kiện: − Cột sắc ký: Supelco RP-C8 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). − Pha động: MeOH-H2O (65:35). − Tốc độ dòng: 1 ml/phút. − Thể tích bơm: 20 µl. − Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. − Bước sóng phát hiện: 223 nm. Thử trên hệ dung môi acetonitril: Cân chính xác khoảng 1 mg mỗi chất andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid, hòa tan với hệ ACN-H2O tỷ lệ 40:60, 50:50, 55:45 trong bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành sắc ký với điều kiện như trên hệ dung môi methanol. ¾ Nhận xét: Sau khi thăm dò, có 2 hệ dung môi cho phép tách tốt 3 diterpen lacton, là hệ MeOH-H2O (50:50) và hệ ACN-H2O (40:60) nhưng hệ MeOH-H2O (50:50) có thời gian tách khá lâu không thích hợp cho quá trình định lượng. Hệ ACN-H2O (40:60) được lựa chọn để tách 3 diterpen lacton trên cột RP-C8. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 61 0 10 20 30 40 50 60 min 0 10 20 30 40 50 60 mAU 223nm,4nm (1.00) 1. 39 4 2. 98 0 7. 27 1 15 .2 69 52 .3 25 57 .5 24 Hình 3.15 Khả năng tách 3 diterpen lacton trên hệ MeOH-H2O (50:50) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 mAU 223nm,4nm (1.00) 5. 80 5 7. 69 5 14 .7 85 Hình 3.16 Khả năng tách 3 diterpen lacton trên hệ ACN-H2O (40:60) 3.4.2 Xây dựng quy trình định lượng ™ Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 5 mg andrographolid cho vào bình định mức 5 ml, hòa tan và điền đến vạch bằng hệ dung môi ACN-H2O (40:60) được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng thành các dung dịch có nồng độ thích hợp. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Pha tương tự cho dehydroandrographolid và neoandrographolid. ™ Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình tam giác 250 ml, chiết 6 lần, mỗi lần với 10 ml MeOH và đánh siêu âm trong 15 phút. Lọc qua giấy lọc, rửa bã dược liệu với 10 ml MeOH. Loại tạp bằng 200 mg than hoạt, lọc qua giấy lọc, rửa than bằng 10 ml MeOH. Cô cách thủy đuổi hết dung môi. Hòa lại với 30 ml hệ dung môi ACN-H2O (40:60), chuyển vào bình định mức 50 ml và điền dung môi đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 62 Sơ đồ 3.4 Chuẩn bị mẫu thử T: dịch chiết trước khi loại tạp bằng than hoạt S: dịch chiết sau khi loại tạp bằng than hoạt Hình 3.17 Dịch chiết trước và sau khi loại tạp bằng than hoạt ™ Điều kiện sắc ký HPLC được lựa chọn là: − Cột sắc ký: Supelco RP-C8 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). − Pha động: ACN-H2O (40:60). − Tốc độ dòng: 1 ml/phút. − Thể tích bơm: 20 µl. − Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. − Bước sóng phát hiện: 223 nm. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 63 3.4.3 Khảo sát tính tương thích hệ thống Chuẩn bị mẫu chuẩn của từng chất và mẫu thử theo mục (3.4.2), trộn 3 mẫu chuẩn thành mẫu chung. Tiêm 6 lần vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn. Bảng 3.14 Khảo sát tính tương thích hệ thống của andrographolid chuẩn n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 5,816 4987933 618145 1,143 11823,369 2,145 2 5,840 5020301 620393 1,142 11926,669 2,234 3 5,837 5042650 624040 1,147 11876,489 2,224 4 5,835 4917208 608593 1,149 11881,204 2,168 5 5,856 5006183 611190 1,151 11718,563 2,188 6 5,844 5095314 624368 1,156 11672,388 2,203 TB 5,838 5011598 617788 1,148 11816,447 2,194 SD 0,011 59241 6594 0,012 100,333 0,033 RSD (%) 0,22 1,18 1,07 0,45 0,85 1,54 Bảng 3.15 Khảo sát tính tương thích hệ thống của andrographolid thử n Thời gian lưu Diện tích đỉnh Chiều cao đỉnh Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Độ phân giải 1 5,839 10713176 1385450 1,115 12929,962 2,156 2 5,843 10835348 1407275 1,117 13010,173 2,229 3 5,848 10672879 1369729 1,109 12774,642 2,185 4 5,836 10675571 1390385 1,119 12976,462 2,186 5 5,832 10417589 1370029 1,095 13078,538 2,244 6 5,825 10743935 1395167 1,124 12917,189 2,218 TB 5,839 10676416 1386339 1,112 12947,828 2,203 SD 0,014 140124 14665 0,012 103,003 0,034 RSD (%) 0,14 1,31 1,06 0,91 0,80 1,49 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 Bảng 3.16 Khảo sát tính tương thích hệ thống của dehydroand