Chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng Vitamin D (D2 và D3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Viện Dinh D−ỡng Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP ***************** Báo cáo kết quả nghiên cứu Chuẩn hóa ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng vitamin D (D2 và D3) trong thực phẩm bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Chủ nhiệm đề tài : Ks. Đoàn Thị H−ờng 6544 20/9/2007 Hà nội, 2007 Viện Dinh D−ỡng Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP ***************** Báo cáo kết quả nghiên cứu Chuẩn hóa ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng vitamin D (D2 và D3) trong thực phẩm bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Chủ nhiệm đề tài: Ks. Đoàn Thị H−ờng Các cán bộ tham gia: C n. Nguyễn Thu Hằng Cơ quan chủ trì: Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP Cơ quan chủ quản: Viện dinh d−ỡng Kinh phí: 20 triệu đồng (Nguồn NNS) Hà nôi, 2007 Mục lục TT Nội dung Trang 1 Danh mục các chữ viết tắt 2 Danh mục các bảng 3 Danh mục các hình 4 Phần 1: Mở đầu 1 5 Phần 2: Tổng quan 3 6 Phần 3: Mục tiêu, đối t−ợng và ph−ơng pháp nghiên cứu 8 1. Mục tiêu 8 2. Đối t−ợng 8 3. Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu 8 4. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao áp 9 5. Các ph−ơng pháp định l−ợng bằng HPLC 11 6. Quy trình phân tích thử nghiệm 13 7 Phần 4: Kết quả nghiên cứu 17 1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 17 2. Xác định LOD 28 3. Xác định LOQ 28 4. Xác định khoảng tuyến tính 29 5. Xác định độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên 32 6. Xác định độ thu hồi 35 7. Một số sắc đồ chạy sắc ký của mẫu phân tích 37 8 Phần 5: Nhận xét và bàn luận kết quả 39 9 Phần 6: Quy trình phân tích xác định hàm l−ợng vitamin D trong thực phẩm bằng ph−ơng pháp HPLC 41 10 Phần 7: Tài liệu tham khảo 45 11 Phần phụ lục: Các sắc đồ của dung dịch chuẩn vitamin D2 và D3 xây dựng khoảng tuyến tính các chữ viết tắt TT Các chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt 1 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao 2 DAD Detector mảng diôt 3 UV-VIS Quang phổ tử ngoại - khả kiến 4 RDA Nhu cầu ăn khuyến cáo 5 TCVN Tiêu chuẩn Việt nam 6 AOAC Hiệp hội phân tích hoá học 7 LOD Giới hạn phát hiện 8 LOQ Giới hạn định l−ợng 9 SD Độ lệch chuẩn 10 Cv Hệ số biến thiên 11 MeOH Methanol 12 THF Tetra hydrofuran 13 ACN Acetonitril 14 SPE Cột chiết pha rắn 15 TBHQ Tert butyl hydroquinol Danh mục các bảng TT Nội dung bảng Bảng 1 Thời gian l−u của vitamin D2 và D3 đối với điều kiện chạy cột Waters RP- 18, detector DAD, b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98: 2, tốc độ dòng 1ml/phút Bảng 2 Thời gian l−u của vitamin D2 chạy cột Inertsil ODS 3 và cột Waters RP18, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN : MeOH =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút. Bảng 3 Nhận xét các sắc đồ của hai chất chuẩn đối với cột Inertsil ODS 3 detector DAD b−ớc sóng 265nm, Pha động ACN : H2O =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút Bảng 4 Nhận xét kết quả chạy sắc ký hai chuẩn trên cột Inertsil ODS 3 pha động ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD b−ớc sóng 265nm, tốc độ dòng 1ml/phút. Bảng 5 Thời gian l−u của hai chất chuẩn t−ơng ứng với pha động khác nhau tốc độ 1ml/ phút, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm Bảng 6 Thời gian l−u của hai chất ứng với tốc độ dòng khác nhau trên hệ pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm, cột Inertsil ODS 3 Bảng 7 Tổng kết điều kiện chạy HPLC phân tích vitamin D Bảng 8 T−ơng quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn của vitamin D2 Bảng 9 T−ơng quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn vitamin D3 Bảng 10 Xác định hàm l−ợng vitamin D2 mẫu sữa bột XO Bảng 11 Xác định hàm l−ợng vitamin D3 trong sữa Sunny grow baby Bảng 12 Xác định hàm l−ợng vitamin D trong sữa chua nestlé có đ−ờng Bảng 13 Xác định hàm l−ợng vitamin D3 trong sữa Kappi hộp 100ml Bảng 14 Xác định hàm l−ợng vitamin D3 trong sữa bột giầu năng l−ợng Bảng 15 Xác định hàm l−ợng vitamin D trong sữa đặc có đ−ờng Bảng 16 Kết quả hàm l−ợng vitamin D trong một số mẫu khác Bảng 17 Độ thu hồi của vitamin D3 Bảng 18 Độ thu hồi của vitamin D2 Bảng 19 Kết quả phân tích mẫu sữa bột mẫu DDP4 vật liệu chuẩn Bảng 20 Tổng hợp các thông số thẩm định Danh mục các hình TT Nội dung các hình Phần tổng quan Hình 1 Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D2 và D3 Hình 2 Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể Phần mục tiêu, đối t−ợng và ph−ơng pháp Hình 3 Mô tả quá trình chạy sắc ký Hình 4 Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC Hình 5 Đồ thị phụ thuộc diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ Phần kết quả nghiên cứu * Khảo sát điều kiện chạy Hình 6 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ phút Hình 7 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D2 Hình 8 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,08ppm, cột Waters, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ phút Hình 9 Dạng phổ hấp thụ của vitamin D3 Hình 10 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ dòng 1ml/ phút Hình 11 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút Hình 12 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút Hình 13 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút Hình 14 Sắc đồ chuẩn vitamin D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút Hình 15 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút Hình 16 Sắc đồ hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 50:50, tốc độ 1ml/ phút Hình 17 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10, tốc độ 1ml/ phút Hình 18 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10 tốc độ dòng 1,2 ml/ phút Hình 19 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động ACN: MeOH = 90:10 tốc độ dòng 1,5 ml/ phút Hình 20 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc độ dòng 1 ml/ phút Hình 21 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc độ dòng 1,2 ml/ phút Hình 22 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 và D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc độ dòng 1,5 ml/ phút. Hình 23 Sắc đồ vitamin D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút Hình 24 Sắc đồ vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−ớc sóng 265nm, pha động MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút * Xác định khoảng tuyến tính Hình 25 Đ−ờng chuẩn vitamin D2 Hình 26 Đ−ờng chuẩn vitamin D3 * Sắc đồ chạy mẫu Hình 27 Sắc đồ xác định hàm l−ợng vitamin D trong sữa tuơi Kapi Hình 28 Sắc đồ chạy mẫu sữa t−ơi xác định hàm l−ợng vitamin D2 Hình 29 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 Hình 30 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 Phần phụ lục: Các sắc đồ dung dịch chuẩn xây dựng khoảng tuyến tính Hình 31 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,0022ppm Hình 32 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,02ppm Hình 33 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,041ppm Hình 34 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,082ppm Hình 35 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,165ppm Hình 36 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,33ppm Hình 37 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,0068ppm Hình 38 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,068ppm Hình 39 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,137ppm Hình 40 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,274ppm Hình 41 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,392ppm Hình 42 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,5ppm Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 1/46 Phần 1: Mở đầu Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần đ−ợc cung cấp đủ các chất dinh d−ỡng, nguồn cung cấp các chất này có nhiều trong thực phẩm ăn vào hàng ngày. Các chất dinh d−ỡng chính là các nhóm cung cấp năng l−ợng cho cơ thể nh− glucid, lipid, protein, nhóm cung cấp muối khoáng, nhóm cung cấp các loại vitamin và n−ớc. Theo quan điểm của các chuyên gia dinh d−ỡng hiện nay trên thế giới mà chúng ta đang sống tồn tại hai thái cực khác nhau, một bên là vực thẳm của sự thiếu ăn và một bên là vực thẳm của sự thừa ăn. Sự thiếu ăn đã dẫn đến tình trạng suy dinh d−ỡng do thiếu năng l−ợng protein, tuy nhiên với sự phát triển của nền khoa học tiến tiến trên thế giới đời sống của ng−ời dân ở hầu hết các n−ớc đã đ−ợc cải thiện, không ngừng nâng cao. ở Việt nam với sự hỗ trợ của các ch−ơng trình phòng chống suy dinh d−ỡng, ch−ơng trình VAC và cuộc cách mạng xanh trong ngành nông nghiệp đã góp phần to lớn trong việc tăng c−ờng an ninh thực phẩm quốc gia, vấn đề đói ăn không còn là điều bức xúc. Hàng năm tỷ lệ suy dinh d−ỡng đã giảm đi một cách đáng kể..... Tuy nhiên vấn đề dinh d−ỡng mới nảy sinh đó là các bệnh mãn tính liên quan đến dinh d−ỡng đang là mối quan tâm của nhiều ng−ời. Khái niệm thực phẩm chức năng (thực phẩm chữa bệnh) đã trở nên quen thuộc dần với mọi ng−ời dân. Hiện nay để giải quyết vấn đề này trên thế giới cũng nh− trong n−ớc đã xuất hiện nhiều loại thực phẩm chữa bệnh, thực phẩm bổ sung vi chất dinh d−ỡng phục vụ cho bệnh nhân liên quan. Có thể coi thực phẩm chức năng, vai trò của thực phẩm đối với bệnh mãn tính là h−ớng tiếp cận rất mới trong ngành dinh d−ỡng, thức ăn là thuốc, thuốc là thức ăn [16]. ở Nhật bản cho đến nay đã có khoảng hơn 192 sản phẩm đ−ợc gọi là thực phẩm chức năng nhằm góp phần vào duy trì, cải thiện chế độ ăn và sức Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 2/46 khoẻ [16]. Một trong số các vi chất rất quan trọng đã đ−ợc bổ sung vào thực phẩm đó là các loại vitamin. Vitamin là những chất không sinh năng l−ợng nh−ng không thể thiếu đ−ợc đối với sự tồn tại, phát triển của mỗi cơ thể sống. Vitamin có vai trò tạo ra các coenzim cần thiết trong các phản ứng chuyển hoá khác nhau. Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất trong cơ thể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin [14]. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là từ thức ăn. Khi thiếu vitamin cơ thể sẽ mắc phải một số bệnh lý, nh− thiếu vitamin A dễ dẫn tới bệnh mù loà, thiếu vitamin B1 dễ bị bệnh tê phù, thiếu vitamin PP bị bệnh pellagra, thiếu vitamin D bị bệnh về x−ơng [17]. Hiện nay một thực tế khắc nghiệt đã xảy ra ở các n−ớc đang phát triển là phải đ−ơng đầu với gánh nặng kép gi−ã bệnh nhiễm trùng, tử vong trẻ em và thiếu dinh d−ỡng với các bệnh mãn tính không lây liên quan đến dinh d−ỡng [16]. Thực tế đã cho thấy thiếu vi chất dinh d−ỡng đã góp phần không ít trong gánh nặng kép này. Vì vậy vai trò thực phẩm đ−ợc đánh giá vô cùng quan trọng, việc nghiên cứu ứng dụng thực phẩm chức năng đã đang trở thành trào l−u mang tính toàn cầu. Nói đến thực phẩm chức năng chúng ta không thể nói đến thực phẩm bổ sung vitamin D, một loại vitamin khá quan trọng để phòng chống bệnh còi x−ơng ở trẻ em, loãng x−ơng ở ng−ời lớn, hạ calci máu và một số bệnh ngoài da... Hiện nay trên thị tr−ờng có rất nhiều loại sữa, bột dinh d−ỡng, bánh quy... có bổ sung viatmin D. Với lý do trên, đề tài này chúng tôi hy vọng chuẩn hoá ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng vitamin D bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong một số loại thực phẩm nh− sữa chua, sữa bột, sữa n−ớc, bánh quy, bột dinh d−ỡng để đ−a ra quy trình phân tích phù hợp, nhằm đánh giá đúng chất l−ợng, giá trị dinh d−ỡng thực của các sản phẩm thực phẩm. Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 3/46 Phần 2: Tổng quan 1. Nguồn gốc và tính chất của vitamin D VitaminD là chất tinh thể hình kim không màu, không mùi, không tan trong n−ớc, hoà tan trong dầu mỡ, tan trong dung môi hữu cơ nh− ethanol, chlorofoc, methanol. Tên gọi khác của vitamin D là calciferol. Vitamin D là một nhóm gồm từ D2 đến D7 song có hai hoạt tính mạnh nhất là vitamin D2 còn gọi Ergocalciferol và vitamin D3 còn gọi Cholecalciferol. Cholecalciferol - C27H44O Ergocalciferol - C28H44O Vitamin D3 Vitamin D2 Hình 1: Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D2 và D3 Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn nguồn gốc động vật nh− trứng, cá, đặc biệt dịch chiết từ gan cá, bơ, sữa, thịt... Trong cơ thể ng−ời vitamin D3 (Cholecalciferol) đ−ợc tổng hợp từ 7 dehydrocholesterol ở d−ới da nhờ ánh sáng tử ngoại. Vitamin D2(Ergocalciferol) đ−ợc tổng hợp từ ergosterol có trong nấm và men bia. Nói chung, hoạt tính sinh học của hai loại vitamin D2 và vitamin D3 không có sự khác nhau nhiều. Trong cơ thể vitamin D chuyển hoá ở gan và Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 4/46 thận tạo ra chất chuyển hoá có hoạt tính là 1,25- dihydroxycholecalciferol nhờ enzim hydroxylase [14]. Hình 2: Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể ng−ời Trong da Trong gan Trong thận Dạng hoạt động Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 5/46 2. Tác dụng của vitamin D - Vitamin D tham gia vào quá trình tạo x−ơng nhờ tác dụng chuyển hoá các chất vô cơ chủ yếu là calci và phosphat, làm tăng hấp thu calci và phosphat ở ruột, tham gia vào quá trình calci hoá sụn nên nó rất cần cho sự phát triển x−ơng ở trẻ em. - Làm điều hoà calci trong máu, ức chế tế bào sinh ung th−. - Khi thiếu vitamin D ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci máu giảm gây hậu quả trẻ em chậm lớn, còi x−ơng chân vòng kiềng, chậm biết đi, chậm kín thóp, nguời lớn bị loãng x−ơng, xốp x−ơng, x−ơng th−a dễ gẫy, phụ nữ có thai thiếu vitamin D dễ sinh ra trẻ khuyết tật ở x−ơng [14]. - Nguyên nhân của sự thiếu vitamin D là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, do rối loạn chuyển hoá, do nhu cầu cao ở phụ nữ có thai và cho con bú... -Tuy nhiên dùng vitamin D quá liều cũng gây ra chứng tăng calci máu, tăng calci niệu, đau nhức x−ơng khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, có thể gây suy nh−ợc, mệt mỏi, đau đầu, buồn nôn, tiêu chảy, giòn x−ơng... [14]. Theo công trình nghiên cứu khảo sát tác dụng của vitamin D đối với bệnh ung th− ở bang Chicago trong 19 năm các tác giả nhận thấy tỷ lệ ung th− kết tràng ở nam giảm 55% nếu hàng ngày đ−ợc bổ sung vitamin D là 3,75mcg [18]. Theo nghiên cứu của Danson - Hughes và các cộng sự tiến hành trên đối t−ợng phụ nữ đ−ợc bổ sung vitamin D 400 IU/ ngày và nhóm phụ nữ khác không đ−ợc bổ sung, cả hai nhóm đều có l−ợng vitamin D ăn vào hàng ngày là 100 IU. Nhận thấy nhóm đối chứng bị giảm đáng kể mật độ khoáng trong x−ơng so với nhóm đ−ợc bổ sung [18]. Năm 1989 theo khuyến cáo của uỷ ban dinh d−ỡng Hoa kỳ (RDA) vitamin D cần bổ sung là 10mcg/ ngày ở tuổi từ 51- 70 và 15mcg / ngày ở tuổi cao hơn [18]. Theo Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 6/46 nghiên cứu của tr−ờng Y Harvard đ−ợc đăng trên tạp chí của hiệp hội y học Mỹ cho thấy vitamin D có thể giúp giảm nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng. Các nhà nghiên cứu đã so sánh l−ợng vitamin D ở 257 mẫu huyết t−ơng trong số hơn 7 triệu mẫu của nhân viên quân đội Mỹ, họ phát hiện rằng ng−ời da trắng nhóm có hàm l−ợng vitamin D cao nhất có nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng thấp nhất. Bệnh đa xơ cứng là bệnh mãn tính của hệ thần kinh, bắt đầu với các triệu chứng nh− mất trí nhớ, suy nh−ợc, mệt mỏi, đau đớn hoặc liệt, chóng mặt...và sau đó ảnh h−ởng tới tim mạch. 3. Tình hình nghiên cứu trong n−ớc và trên thế giới Cùng với sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, với sự bùng nổ của ngành công nghệ thông tin, hiện nay hàng loạt các hệ thống máy phân tích hoá học đã đ−ợc cải tiến nâng cấp, nhằm xác định nhiều loại chất hoá học và đồng thời nâng cao độ nhạy của phép phân tích cũng nh− độ lặp lại của kết quả kiểm nghiệm. Trên thế giới nhiều nhà phân tích hoá học đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm l−ợng vitamin D trong thực phẩm nh− thịt, cá, sữa, trong máu... Đó là nghiên cứu hàm l−ợng vitamin hoà tan trong chất béo của mẫu sữa chua bằng ph−ơng pháp HPLC với detector PDA của M.M Delgado Zamarreno, A. Sanchez Perez của tr−ờng đại học Salamanca Tây ban nha đã đ−a ra các yếu tố ảnh h−ởng đến quá trình phân tích vitamin A, E, D nh− điều kiện thuỷ phân, tách các chất trong khi xử lý mẫu, kết quả của nghiên cứu này đ−a ra độ thu hồi vitamin D3 là 91 ± 5% với hàm l−ợng vitamin D3 trong mẫu là 0,09 mcg/100g ± 5% [11]. Theo nghiên cứu công bố trên Food Chemistry Vol.57, No.1. 95- 99, 1996 ở Anh các nhà nghiên cứu đ−a ra cách xử lý mẫu, điều phân tích xác định hàm l−ợng vitamin D trong thực phẩm, kết quả nghiên cứu này cho thấy hệ số biến thiên sau khi làm lặp lại ba lần đối với vitamin D3 và D2 là <10%, độ thu hồi của ph−ơng pháp là 90 -110% với D2 và D3, giới hạn Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 7/46 phát hiện là 1,5-2 ng [12]. Trong công trình nghiên cứu đăng trên tạp chí Chromatography A của bộ môn thực phẩm, dinh d−ỡng Đại học Georgia Athens Mỹ, bộ môn Dinh d−ỡng trên ng−ời và khoa học thực phẩm tr−ờng Bách khoa Virginia ngày 26 tháng 1 năm 1998 đã đ−a ra điều kiện và yếu tố ảnh h−ởng quá trình phân tích hàm l−ợng vitamin A, E, D trong thức ăn động vật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Nghiên cứu này cho thấy độ thu hồi của ph−ơng pháp là 93-107% [19]. Trong bài báo của tạp chí Food composition and analysis 16 (2003) có công trình nghiên cứu hàm l−ợng vitamin D3 và 25 hydroxyvitamin D3 trong thịt lợn t−ơi và thịt lợn chín, đã đ−a ra kết quả nồng độ vitamin D3 đối với thịt t−ơi là từ 0,05 đến 0,21 mcg/100g với thịt chín là 0,07-0,14 mcg/100g. Sau khi làm 49 thí nghiệm lặp lại họ đã đ−a ra hệ số biến thiên là 7,0%, làm 51 thí nghiệm khác hệ số biến thiên là 7,3% [7]. Ngoài ra còn nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm l−ợng vitamin D trong máu và huyết thanh, trong thực vật ... Một số nghiên cứu đã đ−a ra hàm l−ợng vitamin D trong cá thu là 15mcg/100g, trong gan bò 1mcg/100g, trong trứng gà 2mcg/100g, trong nấm rơm là 2mcg/100g [8]. Hiện nay ở Việt nam chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu vitamin D trong thực phẩm ch−a đ−ợc làm nhiều, trong bảng thành phần thức ăn Việt nam ch−a đề cập đến hàm l−ợng vitamin D. Trong danh mục tiêu chuẩn Việt nam (TCVN) chúng tôi cũng ch−a thấy một quy trình chuẩn nào để xác định hàm l−ợng vitamin D bằng HPLC, vì vậy sau khi tham khảo các tài liệu cùng với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chuẩn hoá ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng vitamin D trong một số loại thực phẩm bằng HPLC. Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Trang 8/46 Phần 3 Mục tiêu, đối t−ợng và ph−ơng pháp nghiên cứu. 1. Mục tiêu Nh− đã đề cập trong phần tổng quan mục tiêu đề tài chúng tôi chọn là “ chuẩn hoá ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng vitamin D (D2và D3) trong thực phẩm bằng ph−ơng pháp HPLC’’ 2. Đối t−ợng Trong khuôn khổ tổng kinh phí của đề tài là 20 triệu đồng, chúng tôi chỉ có khả năng tiến hành trên đối t−ợng thực phẩm là mẫu sữa bột, sữa chua, sữa đặc, bánh quy và siro 3. Nội dung và ph−ơng pháp Để đáp ứng với mục tiêu nói trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau đây: - Khảo sát điều kiện chạy dung dịch chuẩn vitamin D2 và vitamin D3 - Xác định giới hạn phát hiện (LOD) - Xác định giới hạn định l−ợng (LOQ) - Xác định khoảng tuyến tính - Xác định độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (Cv %) - Xác định độ thu hồi (R %) Sau khi tham khảo các tài liệu [1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 13] chúng tôi nhận thấy để phân tích hàm l−ợng vitamin D trong thực phẩm có nhiều ph−ơng pháp khác nhau. Tr−ớc đây th−ờng sử dụng ph−ơng pháp sinh học, ph−ơng pháp hoá học tạo phản ứn