Công nghệ sinh học vi sinh

Trường Đại học Khoa HọcMôn: Công nghệ sinh học vi sinhLớp: CH Công nghệ sinh học K7GVHD: TS. Vi Thị Đoan ChínhDanh sách nhóm: * Nguyễn Viết Tuyên: nhóm trưởng * Phạm Thùy Dung * Trần Thị Thanh Vân * Đinh Anh Tuấn * Đỗ Cảm VânMột số khái niệmKĩ thuật chuyển gene trên thực vậtCác phương pháp chuyển gene gián tiếpCác phương pháp chuyển gene trực tiếpCây trồng chuyển gen BTNội dung chính1.Một số khái niệm * Chuyển gen: là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau. * Thực vật chuyển gen: là thực vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong  DNA genome của nó. * Gen chuyển: là gen ngoại lai được chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền. 2.Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Kĩ thuật chuyển gen là kĩ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói chung và của sinh vật nói riêng làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen của tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.2.Kỹ thuật chuyển gen ở thực vậtPhương phápchuyểngenePhương phápgiántiếpPhương pháp trựctiếpBằng súng bắn genNhờ kĩ thuật siêu âmBằng xung điệnBằng hóa chất Qua ống phấnBằng vi tiêmChuyển gen nhờ Agrobacterium Chuyển gen nhờ virus 3.Các phương pháp chuyển gene gián tiếp - Gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian, thường là vi khuẩn hoặc virus 3.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất agrobacterium Agrobacterium là nhóm vi khuẩn đất, gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Agrobacterium tumefaciens là chi hay được sử dụng cho việc chuyển gen ( gây bệnh u thân) Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một khối u rất lớn hình thành trên thân cây hoa Hồng, B: một dãy khối u nằm trên nhánh của cây Nho 3.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất agrobacteriumA.tumefaciens xâm nhiễm vào thực vật qua vết thương , do tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút chúng.A. tumefaciens có 1loại plasmid quyết định đặc tính gây khối u được gọi là Ti-plasmid.Vi khuẩn không xâm nhập mà chuyển Ti-plasmid vào tế bào thực vật.3.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất agrobacterium - Con người tạo ra các loại vector để chuyển ADN vào tế bào thực vật nhờ A. tumefaciens (1) Vector liên hợp: Là sự hợp nhất của vài loại plasmid khác nhau(2) Vector nhị thể: gồm 2 plasmid cùng tồn tại trong AgrobacteriumA- Vector liên hợpB- Vector nhị thể3.2. Chuyển gen nhờ virus- Bên cạnh vi khuẩn Agrobacterium, người ta còn dùng virus làm vector chuyển gen, do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật, có thể mang đoạn gen cần chuyển lớn hơn so với khả năng của plamid- Hạn chế: + Axit nucleic của virus không ghép nối với bộ gen của thực vật, chỉ truyền được qua nhân giống vô tính + Sự lây nhiễm của virus thường làm yếu tế bào thực vật4. Các phương pháp chuyển gene trực tiếpTrựctiếpXung điệnSúng bắn genHóa chấtVi tiêmSiêu âmỐng phấn4. Các phương pháp chuyển gene trực tiếp4.1.Chuyển gen bằng phương pháp súng bắn genSúng bắn gen là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào Đạn (vi đạn) được sử dụng là các hạt kim loại nặng được bao bọc ADN. Các viên đạn được bắn vào khối mô thực vật nhờ áp lực cao do khí helium, chúng sẽ xuyên vào tế bào. Khi vào tế bào ADN tách khỏi hạt và cài vào ADN của câyChuyển gene bằng súng bắn gene4.2. Chuyển gen nhờ kĩ thuật xung điện  - Sử dụng để chuyển gen vào protoplast. - Ở điện thế cao trong thời gian ngắn, có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần làm cho ADN bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Đem protoplast nuôi cấy trên môi trường thích hợp để tái sinh thành cây và chọn lọc ra các cây chuyển gen. - Thích hợp với đối tượng 1 lá mầmMáy xung điện4.3. Chuyển gen bằng vi tiêm Chuyển gene bằng vi tiêm là chuyển gene trực tiếp vào tế bào protoplast hoặc TB đơn ( chưa hình thành vỏ cứng) bằng cách sử dụng vi tiêm nhỏ, kính hiển vi và các vi thao tác. Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao. Vi tiêm DNA vào tế bào4.4. Chuyển gen qua ống phấnLà phương pháp chuyển không qua nuôi cấy invitro, các DNA ngoại lai được chuyển trực tiếp bằng đường ống phấn. DNA ngoại lai chuyển vào cây theo đường ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gene là vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc đưa tinh vào thụ tinh.4.5.Chuyển gene bằng kĩ thuật siêu âmDùng sóng siêu âm để chuyển gene vào tế bào trần.Nguyên tắc:- Sau khi tạo protoplast, ta tiến hành trộn protoplast với plasmid chứa gene mong muốn tạo dung dịch huyền phù.- Tiến hành cắm đầu máy siêu âm vào dung dịch huyền phù khoảng 3mm và cho máy phát với tần số 20kHz, thời gian 600- 900 ms.- Sóng siêu âm làm cho lớp màng protoplast biến đổi tạo ra các lỗ giúp cho DNA ngoại lai xâm nhập vào tế bào. 4.6.Chuyển gene trực tiếp nhờ hóa chất Là phương pháp chuyển gene vào protoplast (tế bào trần) nhờ các chất hóa học như polyethylene glycol (PEG) hoặc canxi phosphat. Khi có sự tác động của hóa chất thì màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu nhận DNA ngoại lai vào bên trong tế bào. Ở nồng độ cao, PEG làm ADN cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan nữa mà kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của Ca2+ hoặc ở độ pH cao, ADN biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tế bào protoplast.5. Cây trồng chuyển gen BT1911, Ernst Berliner (Đức) đã phân lập được và đặt tên cho loài vi khuẩn này là BT (hay Bacillus thuringenesis ).1915, Ernst Berliner tiếp tục đưa ra báo cáo về một loại độc tố protein, là một thành phần sản sinh ra trong cơ thể BT.Từ 1938 trở đi, BT dùng để giết mối mọt là chính, tuy BT được sản xuất nhiều hơn nhưng vẫn còn nhiều hạn chế.1956, mở ra hướng mới cho các nghiên cứu về tác nhân, cơ chế tác động và di truyền.5. Cây trồng chuyển gen BT1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu sản xuất từ BT bắt đầu được sử dụng rất rộng rãi ở Mỹ, Anh, ĐứcTừ 1980, chế phẩm từ BT ngày càng được sử dụng rộng rãi. Và từ đây, các quốc gia trên thế giới bắt đầu đầu tư mạnh cho các nghiên cứu về BT.Vi khuẩn Bacillus thuringiensisLà một loại trực khuẩn gram dương, dạng hình que, hình thoi hoặc ở dạng chuỗi nhiều phân tử.Hình thành bào tử và tinh thể độc tố.Tính độc hay tính diệt sâu của vi khuẩn BT phụ thuộc vào các độc tố do vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển.Bacillus ThuringenesisTheo Kreig, Langenbrusch (1981) có gần 525 loài thuộc 13 bộ côn trùng đã ghi nhận bị nhiễm vi khuẩn BT.Trong đó, nhiều nhất là bộ cánh vảy (có 318 loài), sau đó là bộ hai cánh (59 loài), bộ cánh màng (57 loài), bộ cánh cứng (34 loài), các bộ khác có từ 1-12 loài bị nhiễm vi khuẩn này.BT sinh ra 4 loại độc tố:Ngoại độc tố α (α-exotoxin)Ngoại độc tố β (β-exotoxin)Ngoại độc tố γ (γ-exotoxin)Nội độc tố δ (δ-endotoxin)Trong 4 loại này nội độc tố δ được chú ý nhất và nó quyết định hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn.- Ngoại độc tố α: loại độc tố này sẽ phát huy tác dụng gây độc hại ở những côn trùng nào có độ pH đường ruột phù hợp với pH hoạt động của enzyme leucitinase-C. Nó cũng gây nên những tổn thương ở đường ruột của côn trùng.- Ngoại độc tố β (ngoại độc tố bền nhiệt): ở 120 ºC sau 15 phút vẫn còn hoạt tính độc, bền ở áp suất khá cao khi khử trùng.Xuất hiện trong giai đoạn vi khuẩn phát triển mạnh, trước khi sinh bào tử. Cơ chế tác động: cản trở sự tổng hợp mARN của cơ thể sâu.- Ngoại độc tố γ (Độc tố tan trong nước): gây ra các triệu chứng tương tự nội độc tố.- Nội độc tố δ (tinh thể độc): tồn tại dưới dạng tinh thể, thường có hình quả trám, bền ở nhiệt độ cao, không tan trong dung môi hữu cơ. Có thể coi như 1 tiền độc tố,nó sẽ được hoạt hóa trong ruột 1 số loại côn trùng ở 1 giá trị pH thích hợp.Gen mã hóa cho tinh thể độc là gen cry. Gen Cry được chia thành 4 lớp chính: Cry I, II, III, IV. Gen này được tách , thiết kế vào các vector chuyển gen và chuyển vào nhiều loại cây trồng khác nhau đặc biệt là bông, ngô, đậu tương, lúa...Những lợi ích của cây trồng Bt 1. Tăng cường quản lý sâu bệnh. 2. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu. 3. Thu được lợi nhuận nhiều hơn. 4. Cải thiện điều kiện cho các sinh vật có ích. 5. Ngô chứa ít độc tố mycotoxin – độc tố có thể gây chết gia súc và ung thư cho người 6. Quản lý tính kháng côn trùng (IRM) Cây Ngô Bt kháng côn trùng biến đổi genThực vật được chuyển gen BT Bông vải Các loại rau Thuốc lá Bắp Cây trồng Bt là công cụ diệt sâu bệnh thực vật mới. Vấn đề khai thác mọi khả năng giảm thiệt hại mùa màng và tăng sản lượng lương thực trở nên cấp bách khi dân số toàn cầu tăng lên nhanh chóng và diện tích đất canh tác lại giảm đáng kể. Cùng với kỹ thuật canh tác nông nghiệp thích hợp, công nghệ kháng côn trùng Bt có thể đem lại rất nhiều lợi ích cho loài ngườiThanks you!