Công nghệ vi sinh

PHẦN II CÔNG NGHỆ VI SINH Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 199 XÁC ĐỊNH NHANH Lactobacillus BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction) Trần Hoàng Ngọc Ái, Trần Ánh Nguyệt, Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệ t đới MỞ ĐẦU Lactobacillus có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của lactobacillus đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng lactobacillus thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên hiện nay trên thị trường có nhiều thực phẩm, dược phẩm có bổ sung các chủng probiotic c òn sống. Lactobacillus bao gồm trên 25 loài và mức độ đầu tiên để phân biệt chúng là dựa trên thành phần của sản phẩm cuối; một số lactobacillus l ên men đồng hình trong khi một số khác thì lên men dị hình. Ngoài phương pháp phân biệt dựa trên các đặc tính phát triển ở những nhiệt độ, pH và nồng độ muối khác nhau của lactobacillus, c òn có phương pháp khác để phân biệt chúng là dạng lên men carbohydrat, thủy giải arginine, thủy giải peptidoglycan và dạng tương đồng DNA-DNA. Tuy nhiên, do giống với nhiều vi khuẩn lactic khác về các y êu cầu phát triển và dinh dưỡng nên thường khó khi sử dụng phương pháp vi sinh vật truyền thống để xác định chúng ngay cả ở mức giống. V ì vậy, nghiên cứu này tập trung vào ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phân tích dữ liệu trình tự gen rDNA16S để xác định nhanh lactobacillus. Việc sử dụng mồi đặc hiệu cho gen m ã hoá rRNA 16S bằng PCR đã được thực hiện như là một phương pháp để xác định. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy Chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn Lactobacillus đ ược dùng trong nghiên cứu này là được thu nhận từ ARS Culture Collection (NRRL) bao gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobaci llus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei. Ngoài ra còn có chủng Streptococcus faecium, Bacillus subtilis. Các điều kiện nuôi cấy  Môi trường: Vi khuẩn Lactobacillus v à Streptococcus được nuôi cấy trong môi Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007200 trường MRS (de Man-Rogosa-Sharpe); còn B.subtilis được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria-Bertani )  Nhiệt độ: Các chủng vi khuẩn này được nuôi ủ ở 37oC Tách chiết DNA (Theo Sambrook J. et al, 1989)  Tế bào vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng, còn B. subtilis được nuôi cấy trong môi trường LB ở 37oC qua đêm  Thu sinh khối của 5ml dịch vi khuẩn trong eppendorf bằng cách ly tâm ở 10 000 vòng/ phút trong 2 phút  Thêm 500 l dịch huyền phù phân giải tế bào, vortex mạnh để dịch tế bào đồng nhất  Cho vào mỗi eppendorf 10mg cát trắng, vortex mạnh, để trong đá 30 giây  Thêm 150 l dung dịch Potassium acetat 3M, pH 4.8  Vortex đều, ly tâm ở 10 000 vòng/ phút trong 10 phút, lấy dịch nổi cho vào eppendorf mới  Thêm vào 600 l isopropanol lạnh, đảo ngược eppendorf 1-2 lần để tủa DNA, ly tâm ở 13 000 vòng/ phút trong 10 phút, đổ bỏ dịch nổi một cách nhẹ nhàng  Thêm vào 500 l ethanol 70% để rửa tủa, ly tâm ở 13 000 v òng/ phút trong 10 phút, đổ bỏ dịch nổi một cách nhẹ nh àng, làm khô trên giấy thấm, để khô tự nhiên trong không khí khoảng 20 phút  Thêm vào 50 l dung dịch TE, lắc nhẹ  Thêm vào 2 l RNAase 1mg/ml và ủ ở 37oC trong 3 giờ  Bảo quản DNA ở 4oC hoặc - 20oC  Sau đó xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA bằng cách đo OD ở bước sóng 260nm, 280nm và chạy điện di trên gel agarose 0,8%. Khuếch đại gen bằng PCR Sử dụng hai cặp mồi để khuếch đại gen rDNA 16S (đ ược tổng hợp từ hãng Proligo) với trình tự như sau: - Cặp mồi 1: Mồi xuôi: 5’- GGA AAC AGA TGC TAA TAC CG -3’ Mồi ngược: 5’- CAC CGC TAC ACA TGG AG -3’ - Cặp mồi 2: Mồi xuôi: 5’- AGC AGT AGG GAA TCT TCC A -3’ Mồi ngược: 5’- ATT CCA CCG CTA CAC ATG -3’ Thành phần phản ứng Khuôn DNA 200ng Taq DNA polymerase 1.25 U Nồng độ mồi 1 M dNTP 200 M Tris-HCl, pH 8.3 20mM KCl 100mM MgCl2 3mM Điều kiện phản ứng 95oC, 5 phút; 30 chu kỳ (95oC, 1 phút; 55oC, 1 phút; 72oC, 2 phút); 72oC, 7 phút. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 201 Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di tr ên gel agarose 1.5% và thu được kích thước gen rDNA 16S (khi được khuếch đại với cặp mồi 1) là 700 bp và kích thước gen rDNA 16S (khi được khuếch đại với cặp mồi 2) l à 340 bp. Khuếch đại gen bằng PCR khuẩn lạc Sử dụng Kit microLYSIS TM theo chỉ dẫn của nhà sản xuất Microzone Limited với các bước như sau:  Tế bào vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng, còn B. subtilis được nuôi cấy trong môi trường LB ở 37oC qua đêm  Trộn 3 l dịch vi khuẩn trên với 17 l dung dịch microLYSIS  Đặt vào máy chu kỳ nhiệt với chế độ: 65oC, 5 phút; 96oC, 2 phút; 65oC, 4 phút; 96oC, 1 phút; 65oC, 1 phút; 96oC, 30 giây; giữ ở 20oC Sau khi chạy với chu kỳ nhiệt trên, tất cả hỗn hợp microLYSIS/DNA có thể đ ược dùng trực tiếp trong PCR hoặc có thể đ ược cất giữ ở - 20oC. Với PCR khuẩn lạc, chỉ sử dụng cặp mồi 2 với tr ình tự như trên để khuếch đại gen rDNA 16S và cho kích thước là 340 bp. Còn điều kiện phản ứng vẫn không thay đổi. Thành phần phản ứng: Hỗn hợp microLYSIS/DNA 5 L Hỗn hợp DNA polymerase 1.2 U Nồng độ mồi 1 M dNTP 200 M Tris-HCl, pH 8.3 10 mM KCl 50 mM MgCl2 1.5 mM Trong đó, hỗn hợp DNA polymerase, Taq DNA polymerase, dNTP v à thang DNA Marker VI được mua từ hãng Roche. KẾT QUẢ Khuếch đại gen bằng PCR Hình 1. Sản phẩm khuếch đại gen rDNA 16S của phản ứng PCR tr ên gel agarose 1,5%. M: thang DNA Marker VI (có 11 vạch với kích thước từ trên xuống: 2.20, 1.80, 1.20, 1.0, 0.65, 0.52, 0.45, 0.39, 0.30, 0.23, 0.22 kb); 1, 4, 6: Lactobacillus acidophilus được khuếch đại với cặp mồi 1; 2, 5, 7: Lactobacillus acidophilus được khuếch đại với cặp mồi 2; 3: B. subtilis được khuếch đại với cặp mồi 1; 8: B. subtilis được khuếch đại với cặp mồi 2 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007202 Từ kết quả trên cho thấy: Khi khuếch đại gen rDNA 16S với cặp mồi 1 v à 2 của L. acidophilus thì đều cho vạch DNA tương ứng là 0.7 kb và 0.34 kb như dự kiến; trong khi đó B. subtilis cho kết quả âm tính. Khuếch đại gen bằng PCR khuẩn lạc Hình 2. Sản phẩm khuếch đại gen rDNA 16S của phản ứng PCR khuẩn lạc tr ên gel agarose 1,5%. M: thang DNA Marker VI; 1: Lactobacillus acidophilus; 2: Lactobacillus johnsonii; 3: Lactobacillus sakei; 4: Lactobacillus bulgaricus; 5: Lactobacillus reuteri; 6: Streptococcus faecium Qua kết quả trên có thể kết luận: Mặc dù khác nhau về loài nhưng cùng là giống Lactobacillus nên khi khuếch đại gen rDNA 16S với cặp mồi 2 th ì sản phẩm PCR đều cho vạch DNA là 0.34 kb; còn Streptococcus faecium thì cho kết quả âm tính. Như vậy, cả hai mồi 1 và 2 đều đặc hiệu cho giống Lactobacillus v à giúp ta có thể phát hiện chúng trong sản phẩm có nhiều giống khác nhau của cùng một nhóm hoặc ngoài nhóm vi khuẩn lactic. KẾT LUẬN Với cặp mồi đặc hiệu cho gen rDNA 16S, chúng tôi đ ã xác định được Lactobacillus ở mức độ giống khi sử dụng ph ương pháp PCR (với khuôn là DNA được tách chiết) và phương pháp PCR khuẩn lạc. Đặc biệt phương pháp PCR khuẩn lạc đã cho kết quả nhanh hơn. Đây là kỹ thuật sinh học phân tử được dùng để xác định, phân loại các vi khuẩn thực (Eubacteria) và dùng để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm, nước, mỹ phẩm,… Do đó, đề tài góp phần cho việc phát hiện và định danh đến mức độ loài của các vi khuẩn lactic nói riêng và vi khuẩn thực nói chung. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Batt CA. (1999). Latobacillus. Introduction. Encyclopedia of Food Microbiology. Academic Press. 2. Dubernet S, Desmasures N, Gueuguen M. (2002). A PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level. FEMS Microbiology Letters 214: 271-275. 3. Heilig H, Zoetendal EG, Vaughan E, Marteau P, Akkermans A, and deVos. (2002). Molecular diversity of Lactobacillus spp. and other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. Appl Environ Microbiol68:114-123. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 203 4. Reid G. (1999). The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus. Appl Environ Microbiol 65: 3763-3766. 5. Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T . (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY. 6. Tannock GW, Munro K, Harmsen HJM, Welling GM, Smart J, and Gobal PK. (2000). Analyses of the fecal microflora of human subjects consuming a probiotic product containing Lactobacillus rhamnosus DR20. Appl Environ Microbiol 66: 2578-2588. 7. Walter J, Hertel C, Tannock GW, Lis CM, Munro K, and Hammes WP . (2001). Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella Species in Human Feces by Using Group-Specific PCR Primers and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Appl Environ Microbiol 67: 2578-2585. SUMMARY The PCR- based rapid identifying method for Lactobacillus Tran Hoang Ngoc Ai, Tran Anh Nguyet, Le Thi Hong Tuyet, Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology The sequencing and analysis of the 16S and 23S rDNA genes are considered as one of the cornerstones of modern microbial taxonomy. These sequences are used to define genus-specific PCR primers for a rapid detection of lactic acid bacteria (LA B). Moreover, in recent years, several rapid methods for the detection and identification of lactobacilli have been developed. Traditional microbiological assays for the identification of lactobacillus species are very often time - consuming and can yield rather variable results. LAB strains including Lactobacillus acidophilus , L. johnsonii, L. reuteri, L. bulgaricus, L. sakei were collected from freeze-dried samples of ARS Culture Collection (NRRL). They were activated and incubated in MRS broth medium at 37oC to get biomass; then they were extracted DNA as a template of standard PCR or used directly in colony PCR. Both of this two PCR methods were used to amplify 16S rDNA gene with lactobacillus genus -specific primer. In this work, we used two primers for amplifying 16S rDNA gene and generated PCR product size as 0.7 kb (for primer 1) and 0.34 kb (for primer 2) for five lactobacillus species. Electrophoresis did not reveal any discrete bands when Bacillus subtilis, Streptococcus faecium DNA were used as template. Identification of lactobacillus in colony PCR have a result faster and more high yield than standard PCR because there was a DNA polymerase mixture including Taq DNA polymerase and Tgo DNA polymerase in Expand High Fidelity System designed from Roche Ltd. Thus, we showed that the genus -specific primers could be a useful tool for identification of the members of lactobacilli. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007204 BIẾN NẠP DI TRUYỀN GIÁN TIẾP NHỜ Agrobacterium tumefaciens VÀO NẤM BỆNH CÂY Phytophthora palmivora Trần Hoàng Ngọc Ái và Hoàng Quốc Khánh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Biến nạp di truyền dựa trên khả năng tự nhiên của Agrobacterium tumefaciens là chuyển đoạn DNA từ Ti plasmid của nó, T -DNA, vào tế bào thực vật và nấm và hòa nhập ngẫu nhiên vào nhiễm sắc thể trong nhân. Tiến tr ình chuyển T-DNA phụ thuộc vào biểu hiện của gen vir (gen gây độc) của A.tumefaciens. Sự biểu hiện của gen gây độc này được cảm ứng bởi sự tiết ra của một số chất từ vết th ương thực vật như acetosyringone (AS). Sự có mặt của biên (border) trái và biên phải ở T-DNA là cần thiết trong tiến trình này. Trong tự nhiên có rất nhiều bệnh ở thực vật do nấm gây ra, dẫn đến tình trạng năng suất mùa màng thấp ở nhiều nơi trên thế giới. Vì vậy nấm gây bệnh ở thực vật l à đối tượng cần được nghiên cứu không chỉ về đặc tính nuôi cấy, sinh hóa, bệnh lý m à còn ở mức độ di truyền phân tử để có thể biến đổi di truyền cũng nh ư kiểm soát bệnh gây ra. Trong báo cáo này trình bày các k ết quả thu được về biến nạp di truyền nấm Phytophthora palmivora, nấm gây bệnh chính trên cây cao su và cây ăn trái như s ầu riêng, ca cao, bưởi. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật  Các chủng Escherichia coli DH5 và Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 đã mô tả trong bài báo (3).  Phytophtora palmivora thu nhận từ Trung tâm Kiểm dịch thực vật V ùng II.  Plasmid pPK2 là vector thứ cấp được thiết kế cho biến nạp vi nấm (2). Môi trường  Môi trường LB dùng để nuôi cấy E. coli và A. tumefaciens.  Môi trường V-8 dùng để nuôi cấy nấm P. palmivora.  Môi trường nuôi cấy chung vi khuẩn v à nấm theo (3).  Môi trường chọn lọc thể biến nạp P. palmivora theo (3).  Môi trường nuôi cấy để tách chiết DNA của P. palmivora là môi trường lỏng malt- cao nấm men (MY). Các vật liệu khác Các vật liệu dùng trong thí nghiệm tương tự trong (3). Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 205 Phương pháp Biến nạp plasmid pPK2 vào E.coli bằng phương pháp CaCl2 lạnh theo Sambrook và cs (6). Tách chiết plasmid pPK2 từ E. coli theo bộ kit UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep (hãng MO BIO) Biến nạp plasmid pPK2 bằng xung đi ện vào A. tumefaciens theo (4). Tách chiết plasmid pPK2 từ A. tumefaciens theo Sambrook và cs (6). Biến nạp Phytophthora palmivora gián tiếp qua A. tumefaciens bằng phương pháp nuôi cấy chung (3). Tách chiết DNA genome của nấm P. palmivora:  Cấy nấm vào 30 ml môi trường MY, ủ trong tối trong trạng thái tĩnh 3 ng ày.  Ly tâm thu sinh khối của 5 ml dịch nấm trong eppendorf ở 6000 v/p trong 5 phút.  Cho vào 500 l dung dịch phân giải tế bào và thêm 10mg cát trắng. Vortex mạnh trong 1 phút, đặt trong đá 1 phút, lặp lại 2 lần.  Thêm vào 150 l potassium acetate 3M. Ly tâm 10.000 v/p trong 10 phút, thu d ịch nổi vào ống eppendorf mới.  Cho vào 600 l isopropanol lạnh, đảo ngược để trộn, đặt trong đá 10 phút, ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút, rút nh ẹ nhàng dịch nổi, thu tủa.  Rửa tủa với 500 l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút, rút dịch nổi, thu tủa, phơi khô tự nhiên trong không khí.  Hòa tan tủa với 20 l đệm TE. Thêm vào 1 l RNAse 1mg/ml, ủ 370C khoảng 3 giờ. Giữ ở 40C. Nồng độ và độ sạch của ADN kiểm tra bằng quang phổ ở b ước sóng 260 và 280 nm. Ngoài ra DNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kiểm tra sự hiện diện của gen hph (gen khánh hygromycin B) tr ong DNA genome của P.palmivora bằng phản ứng PCR: Phản ứng PCR thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen hph l à hph-F và hph-R trong điều kiện: 940C, 5 phút; 30 chu kỳ (940C, 1 phút, 600C, 1 phút, 720C, 2 phút); 720C, 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % và cho kích thư ớc gen hph dự kiến 1 kb. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biến nạp Agrobacterium tumefaciens : Sau khi tách chiết plasmid pPK2 mang gen kháng kanamycin từ E. coli và biến nạp vào A.tumefaciens bằng phương pháp xung điện kết quả cho thấy những khuẩn lạc biến nạp mọc được trên môi trường LB có bổ sung 50 g/ml kanamycin, trong khi chủng hoang dại thì không (Hình 1). Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007206 Hình 1. Biến nạp pPK2 vào tế bào A.tumefaciens. Chủng A.tumefaciens LBA 4404 biến nạp với plasmid pPK2 mọc tr ên môi trường LB có kanamycin (phải), chủng không biến nạp (trái) Quan sát sự gắn kết A. tumefaciens lên tơ nấm P. palmivora A. tumefaciens và P. palmivora được nuôi trên môi trường nuôi cấy chung. Quan sát trên kính hiển vi cho thấy trong giai đoạn đầu của quá tr ình nuôi cấy chung diễn ra sự tiếp xúc của tế bào A. tumefaciens lên bề mặt của tơ nấm (Hình 2). Điều này có ý nghĩa quan trọng trong quá tr ình chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào nấm. Các thí nghiệm tiếp theo sẽ tiếp tục làm sáng tỏ quá trình này. Hình 2. Gắn kết của A.tumefaciens lên tơ nấm P.palmivora (40 X) Biến nạp Phytophthora palmivora Chọn nồng độ hygromycin B thích hợp để chọn lọc P.palmivora biến nạp. Cấy P.palmivora hoang dại vào môi trường V8-agar có bổ sung nồng độ hygromycin B là 0, 50, 100, 150, 200, 250 g/ml. Kết quả cho thấy ở nồng độ 250 g/ml nấm không mọc được (số liệu không công bố), v ì vậy nồng độ 250 g/ml hygromycin B được dùng để chọn lọc thể nấm biến nạp. Các khuẩn lạc nấm biến nạp xuất hiện tr ên môi trường chọn lọc sau 6 ngày nuôi cấy, sau đó cấy sang môi trường V8-agar có bổ sung 250 g/ml hygromycin B. Các kết quả chọn lọc thể hiện trên Hình 3. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 207 Hình 3. Biến nạp P.palmivora nhờ A.tumefaciens mang plasmid pPK2. Các th ể biến nạp P.palmivora mọc trên môi trường có 250 g/ml hygromycin (B) , thể hoang dại (A) Kiểm tra sự hiện diện của gen hph trong genome của P.palmivora bằng PCR. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu v à DNA mạch khuôn là DNA genome nấm. Sản phẩm PCR điện di tr ên gel agarose cho band có kích thư ớc tương đương với kích thước đoạn gen hph có trong đoạn T -DNA của plasmid pPK2. Điều đó chứng tỏ T-DNA của pPK2 đã hòa nhập vào trong DNA genome của nấm P.palmivora. 21 3 4 5 6 1.0 kb Hình 4. Kiểm chứng dòng P.palmivora biến nạp có mang gen hph bằng PCR. 1, Thang DNA marker VI (Roche ); 2, Sản phẩm PCR từ khuôn plasmid pPK2; 3, sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng hoang dại; 4, 5, 6, sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng biến nạp Đây là những kết quả đầu tiên về biến nạp di truyền nấm gây bệnh thực vật P.palmivora gián tiến nhờ A. tumefaciens. Nói chung biến nạp di truyền vào vi nấm gặp nhiều khó khăn cho nên sự phát triển của biến nạp di truyền nhờ Agrobacterium giúp ích rất nhiều cho việc đưa vào các gen mong muốn, hoặc tạo ra các đột biến có định hướng giúp cho việc nghiên cứu cơ chế gây bệnh trên thực vật (2, 5). Đồng thời, qua các thí nghiệm biến nạp nhờ Agrobacterium cho thấy kỹ thuật n ày tương đối đơn giản và tốn ít công sức so với các kỹ thuật biến nạp khác. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007208 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cassago A., et al. (2002). Cellophane based mini -prep method for DNA extraction from the filamentous fungus Trichoderma reesei. BMC Microbiology (xem: -2180/2/14). 2. Covert S. F., et al. (2001). Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Fusarium circinatum. Mycological Re search 105: 259-264. 3. Hoàng Quốc Khánh, Trần Hoàng Ngọc Ái (2003). Chuyển gen kháng hygromycin B vào vi nấm Trichoderma harzianum bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens. Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc lần thứ 2. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống: 930-934, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 4. McCormac A. C., et al., (1998). A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology 9:155-159. 5. Mullins E. D. and Kang S., (2001). Transformation: A tool for studying fungal pathogens of plants. Cell Mol. Life Sci. 58: 2043-2052. 6. Sambrook J., et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press. SUMMARY Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of the phytopathogen Phytophthora palmivora Tran Hoang Ngoc Ai and Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation has been successfully applied to the phytopathogen Phytophthora palmivora. The T -DNA was integrated into the genome and was stable through cell division. The presence of hph gene in P.palmivora genomic DNA was checked by PCR. These findings should facilitate future analysis of P.palmivora pathogenicity and stimulate wider use of this valuable transformation method in fungal research. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 209 BIẾN NẠP DI TRUYỀN NẤM R ƠM Volvariella volvacea BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GIÁN TIẾP NHỜ Agrobacterium tumefaciens Trần Hoàng Ngọc Ái, Hoàng Quốc Khánh Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Nấm rơm Volvariella vo