Đa hình đơn nucleotide A17893G của gen XRCC3 trong ung thư buồng trứng

TCNCYH 115 (6) - 2018 53 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 19/4/2018 Ngày được chấp thuận: 15/6/2018 ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE A17893G CỦA GEN XRCC3 TRONG UNG THƯ BUỒNG TRỨNG Nguyễn Hải Phương, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Nguyễn Viết Tiến Trường Đại học Y Hà Nội Gen XRCC3 có chức năng duy trì sự bền vững của nhiễm sắc thể và sửa chữa các tổn thương DNA trong quá trình tái tổ hợp tương đồng, do đó những thay đổi trên gen có liên quan tới sự hình thành và phát triển nhiều loại ung thư. Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu xác định tính đa hình đơn A17893G tại intron 5 của gen XRCC3 ở nhóm bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng so với nhóm đối chứng. 102 bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng và 102 người không mắc ung thư buồng trứng đã được lựa chọn vào nghiên cứu. Sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (RCR - RFLP) để phân tích kiểu gen của XRCC3, sau đó xác định tỉ lệ phân bố và khả năng mắc bệnh của các kiểu gen. Kết quả cho thấy tỉ lệ alen A là 0,61 và alen G là 0,39. Tỉ lệ phân bố của các kiểu gen AA, AG, GG lần lượt ở nhóm bệnh là 39,2%, 43,1%, 17,6% và ở nhóm chứng là 40,2%, 35,3%, 24,5%. Các alen và kiểu gen của SNP A17893G không có sự khác biệt ở nhóm bệnh và nhóm chứng. Từ khóa: Ung thư buồng trứng, đa hình đơn A17893G, gen XRCC3 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư buồng trứng là một trong bảy ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ. Năm 2012 trên toàn thế giới ghi nhận 239.000 ca mắc ung thư buồng trứng, chiếm 4% trong tổng số các ca mắc ung thư mới. Căn bệnh này cũng là một trong tám nguyên nhân gây tử vong do ung thư hàng đầu ở phụ nữ [1]. XRCC3 là một trong những protein trong gia đình protein RAD51. Các tác nhân gây ung thư khi tác động vào phân tử DNA có thể làm đứt gẫy ở cả 2 mạch của phân tử. Lúc này họ gia đình protein RAD51 có vai trò bảo vệ và hàn gắn lại phân tử DNA, đảm bảo sự ổn định của phân tử [2]. Gen quy định tổng hợp nên protein XRCC3 nằm ở vị trí 14q32.3, gen dài 23kbp, gồm 10 exon. Trong đó, SNP A17893G tại vị trí intron 5 đã được nhiều nghiên cứu trên thế giới phân tích về vai trò với bệnh lý ung thư buồng trứng [3 - 5]. Kết quả của những báo cáo này còn tồn tại mâu thuẫn. Một số nghiên cứu cho thấy sự liên quan giữa SNP A17893G với bệnh lý ung thư buồng trứng có ý nghĩa thống kê [3; 6]. Một số nghiên cứu khác lại cho thấy không có mối liên quan nào giữa SNP A17893G và nguy cơ mắc bệnh [4; 7]. Hiện nay tại Việt Nam, đa hình đơn nucleo- tide của gen XRCC3 trên bệnh lý ung thư buồng trứng vẫn còn là vấn đề bỏ ngỏ, do đó nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định tỷ lệ đa hình đơn A17893G của gen XRCC3 trên bệnh nhân ung thư buồng trứng và nhóm người bình thường tại Việt Nam. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng Nhóm bệnh: 102 bệnh nhân mắc ung thư buồng trứng điều trị tại Bệnh viện Phụ sản 54 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trung ương với độ tuổi trung bình là 44,69 ± 16,4. Các bệnh nhân đã được thăm khám lâm sàng, làm các xét nghiệm cận lâm sàng và giải phẫu bệnh để chẩn đoán xác định ung thư buồng trứng. - Nhóm chứng: 102 bệnh nhân nữ không mắc ung thư buồng trứng đến khám tại Bệnh viện Phụ Sản Trung ương với độ tuổi trung bình là 45,74 ± 17,1. Các đối tượng thuộc nhóm bệnh và nhóm chứng được lấy 2ml máu chống đông bằng EDTA. 2. Phương pháp Tách chiết DNA: DNA tổng số được tách chiết từ mẫu máu theo kit PROMEGA. Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR-Restrict Frag- ment Length Polymophism). Vùng gen chứa SNP A17893G của gen XRCC3 được khuếch đại bằng cách sử dụng cặp mồi: Mồi xuôi: 5’-GACACCTCTACAGAGGACG- 3’. Mồi ngược: 3’-CTGTGCCTAACCATCGAGAA -5’. Thành phần phản ứng PCR (thể tích 15 µl) gồm: 4 µl H2O, 7,5 µl Tag polymerase, 1 µl mồi xuôi, 1 µl mồi ngược và 1,5 µl DNA. Chu trình nhiệt của phản ứng: [94ºC/30 giây, 58ºC/30 giây, 72ºC/30 giây] 38 chu kỳ. Bảo quản sản phẩm ở 15ºC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel aga- rose 1,5%, điện thế 120V trong 15 phút. Xác định đa hình A17893G của gen XRCC3 bằng kỹ thuật enzym cắt giới hạn: Thành phần của phản ứng: 0,3 µl enzym Pvu II, 1 µl buffer NE 3.1, 1,7 µl H2O và 7 µl sản phẩm PCR. Phản ứng cắt được ủ ở 37 ºC trong 4 giờ, sau đó điện di trên gel agarose 2% với điện thế 100V trong 20 phút và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging System. Khi enzym cắt đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước 650 bp (kiểu gen GG); 283 bp và 367 bp (kiểu gen AA); 280 bp, 367 bp và 650 bp (kiểu gen AG). Phân tích số liệu Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để phân tích số liệu. Kiểm định χ2 để so sánh tỉ lệ kiểu gen của nhóm bệnh và nhóm chứng. Để ước tính mối liên quan giữa các kiểu gen và khả năng mắc ung thư buồng trứng dùng tỉ suất OR với khoảng tin cậy 95%. Các kiểm định ý nghĩa khi p < 0,05. 3. Đạo đức nghiên cứu Đề tài đã được Hội đồng Đạo đức của Bệnh viện Phụ sản Trung ương chấp thuận theo quyết định số 966/CN-PSTW. Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân được bảo mật. III. KẾT QUẢ 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu Khi so sánh các tiêu chí về tuổi, tuổi trung bình và tình trạng kinh nguyệt cho thấy nhóm bệnh và nhóm chứng tương đồng nhau,với p > 0,05. Ở những bệnh nhân ung thư buồng trứng, nhóm tuổi mắc bệnh nhiều nhất là nhóm tuổi từ 40 đến 59 tuổi chiếm 45,1% và ít nhất là nhóm tuổi ≥ 60 tuổi chiếm 20,6%. Tuổi trung bình mắc bệnh là 44,69 tuổi. Tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh đã mãn kinh chiếm 44,1%, ít hơn so với những bệnh nhân chưa mãn kinh hoặc chưa có kinh (chiếm 55,9%) (bảng 1). TCNCYH 115 (6) - 2018 55 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu Đặc điểm Nhóm bệnh (n = 102) Nhóm chứng (n = 102) p n % n % Tuổi ≤ 39 35 34,3 32 31,4 0,850 40 - 59 46 45,1 50 49,0 ≥ 60 21 20,6 20 19,6 Tuổi trung bình 44,69 ± 16,4 45,74 ± 17,1 0,622 Tình trạng kinh nguyệt Mãn kinh 45 44,1 42 41,2 0,671 Chưa mãn kinh hoặc chưa có kinh 57 55,9 60 58,9 2. Mối liên quan giữa SNP A17893G với một số yếu tố trong bệnh ung thư buồng trứng Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen XRCC3 chứa SNP A17893G ở bệnh nhân ung thư buồng trứng M: marker; (+): chứng dương; (-): chứng âm. BT21-BT29 là các mẫu bệnh nhân Hình 1 cho thấy sản phẩm PCR của đoạn gen XRCC3 chứa SNP A17893G sau điện di ở nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng. Bản gel khi soi dưới tia UV cho hình ảnh rõ ràng, sắc nét, không xuất hiện vạch phụ. M (+) (-) BT21 BT22 BT23 BT24 BT25 BT26 BT27 BT28 BT29 650 bp 56 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC M AA GG BT21 BT22 BT23 BT24 BT25 BT26 BT27 BT28 BT29 650 bp 367 bp 283 bp Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen XRCC3 bằng enzym PvuII mẫu bệnh nhân ung thư buồng trứng * M: Marker 100 bp; AA: mẫu chứng mang kiểu gen AA; GG: mẫu chứng mang kiểu gen GG; kiểu gen AA (BT28); kiểu gen AG (BT21, BT24, BT25, BT27, BT29); kiểu gen GG (BT22, BT23, BT26). Hình 3. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen XRCC3 chứa SNP A17893G của các bệnh nhân mang kiểu gen AA, AG, GG Sản phẩm PCR của các kiểu gen AA, AG, GG được kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự và so sánh trên Genebank. Kết quả giải trình tự thu được là trùng khớp với kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP. Bảng 2. Tỉ lệ kiểu gen và kiểu alen của SNP A17893G trong nhóm bệnh và nhóm chứng Kiểu alen và kiểu gen Nhóm bệnh Nhóm chứng p n % n % Kiểu alen A 124 60,8 118 57,8 0,545 G 80 39,2 86 42,2 Kiểu gen AA 40 39,2 41 40,2 0,377 AG 44 43,1 36 35,3 GG 18 17,6 25 24,5 TCNCYH 115 (6) - 2018 57 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Tỉ lệ alen G ở nhóm chứng được ghi là 0,42 và ở nhóm bệnh là 0,39. Ở nhóm bệnh, tỉ lệ kiểu gen AG là lớn nhất, chiếm 43,1%, tiếp sau là kiểu gen AA chiếm 39,2% và kiểu gen GG là 17,6%. Còn ở nhóm chứng, nhiều nhất là kiểu gen AA với tỉ lệ là 40,2% và ít nhất là kiểu gen GG với tỉ lệ là 24,5%. Tuy nhiên các kiểu alen và kiểu gen này lại không có sự khác biệt giữa 2 nhóm bệnh và chứng. Bảng 3. So sánh khả năng mắc bệnh giữa các kiểu gen của SNP A17893G trong nhóm bệnh và nhóm chứng Các cặp kiểu gen Nhóm bệnh Nhóm chứng OR (95% CI) p n % n % GG với AA GG 18 31,0 25 37,9 0,74 (0,35 - 1,56) 0,424 AA 40 69,0 41 62,1 AG với AA AG 44 52,4 36 46,8 1,25 (0,67 - 2,32) 0,476 AA 40 47,6 41 53,2 GG + AG với AA GG + AG 62 60,8 61 59,8 1,04 (0,60 - 1,82) 0,886 AA 40 39,2 41 40,2 GG với AA + AG GG 18 17,6 25 24,5 0,66 (0,33 - 1,30) 0,230 AA + AG 84 82,4 77 75,5 Khi so sánh khả năng mắc bệnh của các kiểu gen chứa alen hiếm G với các kiểu gen khác theo cặp: kiểu gen đồng hợp GG với AA, kiểu gen dị hợp AG với AA, kiểu gen nhóm GG và AG với AA và kiểu gen GG với nhóm AA và AG đều không thấy có mối liên quan với khả năng mắc bệnh. IV. BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, độ tuổi hay gặp nhất của ung thư buồng trứng là 40 – 59 tuổi. Đứng thứ hai là nhóm tuổi dưới 39 tuổi và ít nhất là nhóm tuổi trên 60 tuổi. Sự phân bố về nhóm tuổi này cũng tương đồng với một số nghiên cứu của các tác giả khác tại Việt Nam. Theo một nghiên cứu trên các bệnh nhân ung thư buồng trứng tại thành phố Hồ Chí Minh nhóm tuổi 40 – 59 chiếm 55,3% tổng số bệnh nhân, nhóm tuổi dưới 39 tuổi chiếm 37,7% và ít gặp nhất là nhóm tuổi sau 60 tuổi chỉ chiếm 7,25% [8]. Tại Thái Nguyên, nhóm tuổi 40 – 59 chiếm 53,9%, nhóm tuổi < 39 chiếm 27,4%, còn lại là nhóm tuổi > 60 chiếm 18,8% [9]. Về tình trạng kinh nguyệt của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu, kết quả thu được cho thấy tỉ lệ gặp bệnh nhân ung thư buồng trứng trong nhóm chưa mãn kinh hoặc chưa có kinh cao hơn nhóm đã mãn kinh. Kết quả này không giống như các nhận định về lứa tuổi thường gặp của ung thư buồng trứng là ở các bệnh nhân cao tuổi đã mãn kinh. Ở một nghiên cứu của tác giả Việt Nam, tỉ lệ bệnh nhân mãn kinh chiếm 70%, tỉ lệ bệnh nhân 58 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC chưa mãn kinh chỉ chiếm 30% số bệnh nhân bị ung thư buồng trứng [10]. Sau khi xác định được kiểu gen của SNP A17893G bằng phương pháp PCR-RFLP và kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự, các số liệu sẽ được phân tích với phép kiếm định χ2 và đo OR với độ tin cậy 95%. Tỉ lệ alen G theo nghiên cứu này trên nhóm chứng là 0,42 và nhóm bệnh là 0,39. Tỉ lệ SNP A17893G trong một nghiên cứu tổng hợp bệnh - chứng trên chủng tộc người da trắng tại Anh, Hoa Kỳ và Đan Mạch là 0,33 ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng [3]. Ở châu Á, tại Đài Loan tỉ lệ SNP ở nhóm chứng là 0,30 và nhóm bệnh nhân ung thư vú là 0,29 [11]. Như vậy ở các chủng tộc khác nhau, tỉ lệ SNP là không giống nhau. Cùng thuộc khu vực châu Á, tỉ lệ SNP A17893G trên nghiên cứu của chúng tôi là lớn hơn so với nghiên cứu được tiến hành tại Đài Loan. Khi tiến hành kiểm định mối liên quan giữa 3 kiểu gen AA, AG và GG, kết quả thu được là 3 kiểu gen này không có sự khác biệt giữa 2 nhóm bệnh và nhóm chứng. Phân tích sâu hơn các dữ liệu để so sánh khả năng mắc bệnh của các kiểu gen chứa alen G và các kiểu gen còn lại, chúng tôi cũng không ghi nhận được mối liên quan có ý nghĩa thống kê với khoảng 95% CI chứa 1. Trong khi đó, một số nghiên cứu trên thế giới về mối liên quan giữa SNP này và bệnh lý ung thư lại chứng minh được SNP này có liên quan và SNP A17893G có vai trò là yếu tố bảo vệ khỏi nguy cơ mắc bệnh. Cùng trên đối tượng ung thư buồng trứng, năm 2014, nghiên cứu tổng hợp trên chủng tộc người da trắng đã cho thấy mối tương quan có ý nghĩa thống kê với nguy cơ ung thư buồng trứng bằng cách sử dụng so sánh dị hợp tử (T1T2 với T1T1: OR = 0.91, 95%CI = 0,83 - 0,99 , p = 0,04) [6]. Ở nghiên cứu tổng hợp khác trên nhóm bệnh nhân ung thư tuyến giáp đã phát hiện được mối liên quan giữa SNP và nguy cơ mắc ung thư tuyến giáp (kiểu gen GG so với AA và AG có OR =  0,57, 95%CI 0,35 - 0,93, p = 0,02) [12]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên thế giới có kết quả giống với nghiên cứu chúng tôi, chứng minh rằng SNP A17893G không có mối liên quan nào với nguy cơ mắc bệnh [4; 7]. V. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã xác định được đa hình đơn nucleotide A17893G của gen XRCC3 ở 2 nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng và nhóm chứng. Các phân tích dữ liệu cho thấy không có mối liên quan giữa đa hình đơn A17893G và nguy cơ mắc ung thư buồng trứng. Lời cám ơn Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đột biến và đa hình thái đơn nucleotid trên một số gen liên quan đến ung thư vú và ung thư buồng trứng”. Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Bệnh viện Phụ Sản Trung ương; Bộ môn Hóa Sinh, Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R et al (2014). Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major pat- terns in GLOBOCAN 2012. International Jour- nal of Cancer, 136 (5), E359-E386. 2. Liu Y, Tarsounas M, O'regan P et al (2007). Role of RAD51C and XRCC3 in Ge- TCNCYH 115 (6) - 2018 59 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC netic Recombination and DNA Repair. The Journal of Biological Chemistry, 282, 1973 - 1979. 3. Auranen A, Song H, Waterfall C et al (2005). Polymorphisms in DNA repair genes and epithelial ovarian cancer risk. International Journal of Cancer, 117 (4), 611 - 618. 4. Alaa M Ali., Huda A Kareem., Mohammad A Anazi et al (2015). Polymor- phisms in DNA Repair Gene XRCC3 and Sus- ceptibility to Breast Cancer in Saudi Females. BioMed Research International, (2016), 9. 5. Yong S Song, Hee S Kim, Daisuke A et al (2014). Ovarian Cancer. BioMed Re- search International, (2012), 2. 6. Yuan C, Liu X, Yan S et al (2014). Ana- lyzing Association of the XRCC3 Gene Poly- morphism with Ovarian Cancer Risk. BioMed Research International, 2014, 9. 7. He XF, Wei W, Su J et al (2012). Asso- ciation between the XRCC3 polymorphisms and breast cancer risk: meta-analysis based on case-control studies. Molecular Biology Report, 39 (5), 5125 - 5134. 8. Võ Hoàng Nhân, Nguyễn Thị Ngọc Phượng (2010). Khảo sát các yếu tố liên quan đến khả năng sống sau 05 năm của bệnh nhân ung thư buồng trứng được chẩn đoán - điều trị tại bệnh viện Từ Dũ năm 2002 được theo dõi đến năm 2007. Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 14 (2), 60 - 68. 9. Vũ Hô, Vi Trần Doanh, Lê Thị Lộc và cộng sự (2010). Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng - mô bệnh học và điều trị ung thư buồng trứng tại Trung tâm Ung bướu Thái Nguyên từ 2005 - T8/201. Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 14 (4), 491 - 494. 10. Phạm Thị Diệu Hà, Nguyễn Văn Tuyên (2013). Nhận xét giá trị HE4 và test ROMA trong chẩn đoán ung thư buồng trứng. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 82 (2), 37 - 44. 11. Su CH, Chang WS, Hu PS et al (2015). Contribution of DNA Double-strand Break Repair Gene XRCC3 Genotypes to Tri- ple-negative Breast Cancer Risk. Cancer Ge- nomics and Proteomics, 12 (6), 359 - 367. 12. Yu XL, Liu H, Wang B et al (2014). Significant associations between X-ray repair cross-complementing group 3 genetic poly- morphisms and thyroid cancer risk. Tumor Biology, 35 (3), 2009 - 2015. Summary ASSOCIATION BETWEEN XRCC3 GENE POLYMORPHISM A17893G AND OVARIAN CANCER RISK XRCC3 gene plays a significant role of stabilizing chromosomes and repairing DNA double- strand disruption by homologous recombination. Thus, it is speculated that the polymorphic vari- ants of the XRCC3 gene are associated with the initiation and progression of cancer. This case - control study was carried out to identify the 5 intronic XRCC3 gene polymorphism A17893G in ovarian cancer. 102 patients and 102 controls were selected. Genotyping of XRCC3 A17893G was performed with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP). Then, the distributions of the genotypic or allelic frequencies and the association between the genotype and ovarian cancer risk were investigated. The frequency of allele A is 0.61 and that 60 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC of allele G is 0.61. For the study group, the distribution of genotype AA, AG, GG are 39.2%, 43.1%, 17.6% and for the control group, the distribution of genotype AA, AG, GG are 40.2%, 35.3%, 24.5%, respectively. However, no statistically significant associations were observed be- tween the polymorphism and ovarian cancer risk. Keywords: Ovarian cancer, SNP A17893G, rs1799796, XRCC3 gene