Đặc điểm hình thái và đặc tính xâm nhiễm của vi khuẩn kháng đa kháng sinh phân lập từ cá rô đồng (Anabas testudineus)

1056 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐẶC TÍNH XÂM NHIỄM CỦA VI KHUẨN KHÁNG ĐA KHÁNG SINH PH N LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (ANABAS TESTUDINEUS) Nguyễn Thành Luân*, Đặng Lê Thị Hồng Liên, Tiêu Yến Hoa, Trần Thị Ánh Linh 1 Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh * Email: nt.luan@hutech.edu.vn TÓM TẮT Một số vi khuẩn gây bệnh đã được phân lập từ cá rô đồng (Anabas testudineus), tuy nhiên hiện nay có rất ít nghiên cứu về đặc tính kháng kháng sinh của chủng độc lực. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các đặc điểm của các chủng vi khuẩn Vibrio và non-Vibrio phân lập từ cá rô đồng bằng cách kiểm tra độ nhạy với các loại kháng sinh và kiểm tra độc lực gây chết cá. Tổng số 30 chủng vi khuẩn Vibrio (10 chủng) và non-Vibrio (20 chủng) có biểu hiện kháng với Amoxicillin, Ampicillin, Cefalexin, Cloramphenicol, Clindamycin, Doxycycline, Erythromycin, Tetveryline. 11/12 chủng kháng với Clindamycin, 10/12 chủng kháng Ampicillin, 9/12 chủng kháng Tetveryline, 8/12 chủng kháng Cloramphenicol, 10/12 kháng Cefalexin, và 4/12 chủng kháng Doxycycline. Tất cả các chủng khảo sát đều nhạy cảm với Ciprofloxacin nhưng việc sử dụng các kháng sinh này hiện nay đã bị cấm tại Việt Nam. 11/12 chủng có khả năng kháng với ít nhất năm loại kháng sinh. Những chủng kháng đa kháng kháng sinh này có thể gây chết cá rô đồng giống (40-90%) trong thí nghiệm cảm nhiễm bằng cách tiêm trong màng bụng ở 105CFU/con. Nghiên cứu này đặc biệt cho thấy rằng việc sử dụng thuốc kháng sinh dự phòng và điều trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản Việt Nam cần phải được kiểm soát nghiêm ngặt. Để đánh giá nguy cơ phát tán các đặc tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này, các cơ chế phân tử (gene kháng kháng sinh, plasmid) của việc khuếch tán các hoạt tính kháng kháng sinh cần phải được nghiên cứu cụ thể hơn nữa trong các nghiên cứu tiếp theo. Từ khóa: Antimicrobial susceptibility, Vibrio, Vietnamese Koi, virulence. 1. TỔNG QUAN Cá rô đồng, Vietnamese Koi (Anabas testudineus) là loại cá sống tự nhiên và được nuôi phổ biến ở một số tỉnh Đông Nam Bộ và ở vùng ĐBSCL. Tuy nhiên, với sự phát triển nhanh của các vùng nuôi cũng như mật độ nuôi cao, một số dịch bệnh thường xuyên xảy ra như "đóng nhớt, đen thân, mủ gan” và gây thiệt hại kinh tế lớn. Tỷ lệ cá chết sau các đợt dịch bệnh khá cao trong cả giai đoạn ương giống và nuôi thương phẩm, đặc biệt đối với bệnh đen thân. Cá trong ao có thể hao hụt lên đến 20% sau mỗi đợt cá bị bệnh này. Hiện nay, giải pháp kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản Việt Nam tuy nhiên liều lượng sử dụng không chính xác (Van 2005). Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân lập và đánh giá khả năng kháng các loại kháng sinh thông thường của các chủng Vibrio spp. và non-vibrio thu được từ cá thương mại nghi nhiễm bệnh. Ngoài ra, các chủng thể hiện khả năng đa kháng sẽ được kiểm tra độc lực gây chết cá. Chúng tôi đề xuất giải pháp phù hợp để hạn chế sự bùng phát bệnh và sử dụng kháng sinh hợp lý. 1057 2. VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP 2.1 Cá thí nghiệm Mười ba mẫu cá rô đồng thương phẩm và cá giống có dấu hiệu lạ được thu mua từ chợ Thủ Đức (~200g/con, 4 con), chợ Lê Văn Sĩ, (~45g/con, 6 con), và trại cá ML (~4g/con, 3 con) ở Tp.HCM. Các mẫu lách, thận, mang và gan của mẫu cá còn sống được thu nhận vô trùng và cấy lên đĩa môi trường Trypton Soy agar (TSA, Himedia, India), và TCBS (TMMedia, India). Đĩa cấy được ủ 24 giờ ở 28°C. Các khuẩn lạc đã làm thuần được bảo quản trong môi trường TSA + 15% glycerol. Các vi khuẩn được tăng sinh trên TSA 24 giờ trước khi sử dụng cho thử nghiệm tiếp theo. 2.2 Phƣơng pháp thử độ nhạy với kháng sinh Thử nghiệm độ nhạy với kháng sinh được thực hiện trên môi trường thạch Muller-Hinton Agar (HiMedia, India) theo phương pháp đĩa khuếch tán kháng sinh của Kirby-Bauer. Theo đó, dung dịch kháng sinh được bổ sung vào giếng (d = 6 mm) đã chuẩn bị sẵn trên đĩa thạch trải đều vi khuẩn (108CFU/ml) để đạt nồng độ cuối cùng tương ứng với từng loại là Amoxicillin (25µg), Ampicillin (10µg), Cefalexin (30µg), Chloramphenicol (30µg), Ciprofloxacin (5µg), Clindamycin (10µg), Doxycycline (30µg), Erythromycin (15µg), Tetracyline (30µg) mua từ công ty Mekophar, Việt Nam. Sau đó, các đĩa thạch được ủ 24 giờ ở 28°C và ghi nhận kháng theo phương pháp được đề xuất bởi CLSI (2008). 2.3 Thử nghiệm độc lực các chủng đa kháng Cá thí nghiệm (~4g/con), màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt được nuôi thích nghi 1 tuần trong hệ thống bể 300L, sục khí 24/24 giờ. Thí nghiệm được bố trí trên hệ thống bể 15L, sục khí 24/24 giờ, 10 con/bể, gồm 2 nghiệm thức: (1) nghiệm thức đối chứng, tiêm dung dịch nước muối sinh lý 0,85% NaCl (0.1 ml/cá); (2) nghiệm thức cảm nhiễm tiêm (0.1 ml/cá) dung dịch chủng vi khuẩn (Bảng 1). Theo đó sinh khối vi khuẩn sau khi tăng sinh trên TSA 24 giờ ở 28°C được huyền phù và điều chỉnh mật độ ~106 CFU/ml bằng nước muối sinh lý 0,85% NaCl. Mật độ gây cảm nhiễm là 105 CFU/cá bằng phương pháp tiêm xoang bụng. Mật độ vi khuẩn xác định bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên TSA. Các biểu hiện của cá sau tiêm được theo dõi trong 7 ngày. Đối với cá chết trong thí nghiệm sẽ thu nhận gan và thận để tái phân lập lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách kiểm tra sự đồng nhất kiểu hình với của chủng gây bệnh. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Dấu hiệu bệnh lý Cá thí nghiệm có biểu hiện bên ngoài như cơ thể cá có màu đen bất thường, nhiều trường hợp cá xuất huyết ở đầu (Hình 1A, B), và bơi bất thường trên mặt nước. Các biểu hiện bên trong gan có đốm trắng lạ (Hình 1C). Các vi khuẩn phân lập được có sự đồng nhất cao (Hình 1D). Hình 1. Cá rô đồng biểu hiện thân đen sậm (A), hình dạng các khuẩn lạc trên môi trường TCBS TSA (B), gan có dấu hiệu lạ (C) và khuẩn lạc mọc đồng nhất trên môi trường TSA 1058 3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng Tổng cộng 12/30 chủng vi khuẩn phân lập từ gan, thận, lách, và mang của các mẫu cá nghi nhiễm bệnh trên môi trường TSA (20 chủng) và TCBS (10 chủng) (Bảng 1) được chọn để kiểm tra các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa. Hầu hết đều xuất hiện khuẩn thuần sau 24 - 36 h ủ ở nhiệt độ 28°C (Hình 1D). Đa số vi khuẩn phân lập được chứa cả hai loại tế bào vi khuẩn Gram âm, gram dương, dương tính với Catalase và Oxidase (Bảng 1). Kết quả nghiên cứu này tìm thấy vi khuẩn trong các mẫu phân lập thuộc nhóm Vibrio (3/12 cá bị nhiễm) khuẩn lạc vàng (Hình 1). Vi khuẩn phát triển trên môi trường TSA sau 24 h ở 28°C, đường kính khuẩn lạc khoảng 1 – 3 mm bao gồm cả khuẩn lạc màu trắng đục và trong suốt, bề mặt trơn láng và lồi (Bảng 1). Các vi khuẩn phân lập được có khả năng phát triển đa dạng trong môi trường TSB có bổ sung NaCl (1- 6%) (Bảng 1). Bảng 1. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng STT Code Địa điểm Trọng lƣợng (g) Dấu bệnh Hình thái# Gram/ Catalase/ Oxidase Conc. Of NaCl (%) 0 1 2 3 4 5 6 1 V2L Chợ, Q3 45 ND Tròn, trắng đục, lồi –/+/+ + + + + + – – 2 V2T Chợ, Q3 45 ND Tròn, trắng đục, lồi –/+/+ + + + + + – – 3 V7G Chợ, Q3 200 Thân đen Tròn, trắng đục +/+/+ + + + + + + – 4 V7L Chợ, Q3 200 Thân đen Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + – 5 V3G Chợ, Q3 45 ND Trong suốt –/+/+ + + + + + + – 6 V3T Chợ, Q3 45 ND Tròn, trong suôt –/+/+ + + + + + – – 7 NV5G Chợ, Q3 200 Gan mủ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + – 8 NV5M Chợ, Q3 200 Gan mủ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + – – 9 Đ1 ML, Q9 4 Bơi lờ đờ Tròn, trong suốt +/+/+ + + + + + + + 10 Đ2T ML, Q9 4 Bơi lờ đờ Tròn, trắng đục +/+/+ + + + + + + + 11 Đ2V ML, Q9 4 Bơi lờ đờ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + + 12 Đ3 ML, Q9 4 Bơi lờ đờ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + + #, khuẩn lạc mọc trên môi trường TSA; dương tính, kháng: +; âm tính, không kháng: –; ND, không xác định; nt: như trên 3.3 Kết quả kiểm tra độ nhạy kháng sinh Kết quả kiểm tra độ nhạy của 12 chủng Vibrio và non-Vibrio với 9 loại kháng sinh đã cho kết quả kháng hầu hết các loại kháng sinh (Bảng 1), cụ thể Clindamycin (11/12 chủng), Ampicillin (10/12), Tetracyline (9/12 chủng), Chloramphenicol (8/12 chủng), Cefalexin (10/12 chủng), và Doxycycline (4/12 chủng). Mặc dù các chủng phân lập được trong nghiên cứu này đều nhạy cảm với Ciprofloxacin (0/12), loại kháng sinh này đã bị cấm sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản (Thông tư số 10/2016/TT- BNNPTNT ngày 01/6/2016 của Bộ Nông nghiệp và PTNT) (Bảng 3). Trong khi đó, hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng đều nhạy cảm với kháng sinh Erythomycin (10/12 chủng) ngoại trừ chủng V3T và NV5G, và nhạy cảm với Amoxicillin (9/12) ngoại trừ chủng Đ1, Đ2T, và Đ3, cả hai kháng sinh trên đều thuộc danh hạn chế sử dụng. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi, chủng V2L, V2T, 1059 V7G, V7L, V3G, NV5G, và NV5M kháng hoàn toàn với kháng sinh Amoxicillin (đường kính vòng kháng = 0), tương tự 4 chủng Đ1, Đ2T, Đ2V, và Đ3 phân lập từ cá rô đồng giống (Bảng 2) kháng hoàn toàn với kháng sinh Erythomycin. Điều này cho thấy rằng, cần nâng mức độ cảnh báo hoặc đề xuất cấm sử dụng cả hai loại kháng sinh Amoxicillin và Erythomycin trong nuôi trồng thủy sản. Đặc biệt, các chủng vi khuẩn phân lập từ cá thương mại trong nghiên cứu này đều nhạy cảm với kháng sinh Doxycycline (hiện không thuộc danh mục cấm hay hạn chế sử dụng), tuy nhiên 4 chủng Đ1, Đ2T, Đ2V và Đ3 phân lập từ cá rô đồng giống (Bảng 2) đều có khả năng kháng loại kháng sinh này, cho thấy rằng Doxycycline có thể đang được sử dụng trong điều trị bệnh trên cá rô đồng và bắt đầu xuất hiện các chủng kháng Doxycycline. Do đó, chúng tôi đề nghị cần thực hiện thêm các đánh giá nhiều hơn về các chủng vi khuẩn phân lập từ các loài thủy hai sản có khà năng kháng Doxycycline. Bảng 2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng Thí nghiệm Nồn g độ Tình trạng# Các chủng phân lập từ cá rô đồng V 2 L V 2 T V 7 G V 7 L V 3 G V 3 T N V 5 G N V 5 M Đ 1 Đ 2 T Đ 2 V Đ 3 Kháng NaCl 4% + + + + + + + + + + + + 5% – – + + + – + – + + + + 6% – – – – – – – – + + + + Kháng sinh Clindamycin 10µ g - R R R R R R S R R R R R Ampicillin 10µ g Cấm R R R R R R R R S S R R Amoxicillin 25µ g Hạn chế R R R R R R R R S S R I Chloramphen icol 30µ g Cấm R R I R S R S R R S R R Ciprofloxacin 5µg Cấm S S S S S S S S S S S S Erythromycin 15µ g Hạn chế R R R R R S S R R R R R Doxycycline* 30µ g - S S S S S S S S R R R R Cefalexin 30µ g - R I R R R R S R R R R R Ratio (R/9) 7 6 5 7 6 5 2 7 6 5 8 7 *, following Biorad disc test with strain E. coli ATCC 25922; +, kháng; –, không kháng S = Susceptible, I = Intermediate, R = Resistant; # Thông tư số 10/2016/TT-BNNPTNT ngày 01/6/2016 của Bộ Nông nghiệp và PTNT 1060 3.4 Kết quả thí nghiệm độc lực Kết quả cảm nhiễm nhân tạo 12 chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng cho thấy 10/12 chủng có thể gây chết cá với tỉ lệ chết từ 40-90% (Hình 2A). Theo kết quả trình bày ở hình 2, các chủng Đ2V, Đ3, V7G, và V3G cá bắt đầu chết ngày thứ 2 sau tiêm. Sau 5 ngày tiêm, tỉ lệ cá chết 50% được ghi nhận ở nhóm cá gây nhiễm Đ3, 60% ở nhóm tiêm V3G và V7L. Sau 8 ngày cảm nhiễm, tỉ lệ cá chết cao nhất được ghi nhận ở các nhóm gây nhiễm với chủng Đ2T (80%); V3G (80%); NV5M (90%); và V7L (90%) ở mật độ 106 CFU/ml. Trong khi đó, lô đối chứng và V2L, V2T cá vẫn hoạt động bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm. Vi khuẩn tái phân lập từ các mẫu cá chết có tính đồng nhất và bước đầu được xác định với các đặc điểm hình thái giống như các chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm ban đầu (Hình 2B, C). Mặc dù hai chủng Vibrio spp. V2L và V2T không gây chết cá trong thí nghiệm này, nhưng chúng đều thể hiện khả năng kháng tương ứng 6/9 và 7/9 loại kháng sinh khảo sát. Điều này cho thấy rằng khả năng chúng có thể mang các plasmid có nhiều loại gene kháng kháng sinh khác nhau và có thể chuyển sang các loài vi khuẩn khác sau đó làm tăng cường độc lực của các loài gây bệnh (Aoki 1988, Cabello và cộng sự, 2013). Ví dụ, plasmid chứa gene kháng với chloramphenicol, trimethoprim, sulphonamide và tetracycline đã được xác định trong mầm bệnh cá (McPhearson et al. 1991). Các plasmid chuyển gene kháng với 5 loại kháng sinh đã được xác định từ vi khuẩn gây bệnh ở cả hai nhóm cá biển và cá nước ngọt như Vibrio anguillarum, V. salmonicida, Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Edwarsiella tarda và Yersinia ruckeri (Aoki et al. 1987; Crumlish et al. 2002; Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2008). Hình 2. Kết quả gây cảm nhiễm với vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng. A, Tỉ lệ chết của cá tiêm với 12 chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh. B, Hình thái chủng NV5G thuần. C, Hình thái vi khuẩn tái phân lập từ cá chết ở nhóm cảm nhiễm với chủng NV5G Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra những vấn đề trong nuôi trồng thủy sản như nuôi trồng với mật độ cao, xuất hiện nhiều các trang trại tự phát và thiếu các biện pháp vệ sinh trại đã tạo điều kiện cho sự lây lan nhanh chóng của các tác nhân gây bệnh dẫn đến việc sử dụng kháng sinh dự phòng (Cabello 2006; Sørum 2006; Van 2005). Quá trình này đã dẫn tới một số bất lợi như sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi trường nuôi trồng thủy sản và sự xuất hiện của chủng kháng kháng sinh gây bệnh cá. Điều này 1061 có thể dẫn đến việc chuyển các gene kháng thuốc từ thủy sản sang các nhóm vi khuẩn trên động vật trên cạn và gây bệnh ở người, và còn làm thay đổi hệ vi sinh vật trong trầm tích và trong cột nước (Cabello 2004; Huys et al. 2001; Holmström et al. 2003; Lê và cộng sự 2005). 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng 30 chủng phân lập từ cá rô đồng có thể là chủng Vibrio (10/30 chủng) hoặc non-Vibrio (20 chủng). 11/12 chủng có khả năng kháng ít nhất với NaCl 4%, và kháng ít nhất năm loại kháng sinh (trong tổng số 9 loại kháng sinh thử nghiệm). Những chủng vi khuẩn này có khả năng gây chết cá trong thí nghiệm cảm nhiễm với cá rô đồng. Do đó, khi các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh này gây bệnh sẽ có thể đặc biệt khó kiểm soát. Hiện tượng này thậm chí có thể trở nên nghiêm trọng hơn khi thực tế chỉ ra rằng nhiều gene kháng thuốc được truyền bởi plasmid và gây ảnh hưởng hiệu quả điều trị bệnh thủy sản (Aoki 1988). Quá trình này đã dẫn tới một số bất lợi như sự xuất hiện của vi khuẩn kháng đa kháng sinh trong môi trường nuôi trồng thủy sản và sự xuất hiện của chủng kháng kháng sinh gây bệnh cá như trong nghiên cứu của chúng tôi. Để hiểu rõ nguy cơ phát tán các đặc tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này, các nghiên cứu tiếp theo cần làm sáng tỏ các cơ chế làm xuất hiện hiện tượng siêu kháng, phân tích các đặc điểm phân tử của các gene kháng thuốc. Ngoài ra, có một nhu cầu nghiêm ngặt để kiểm soát cả việc sử dụng thuốc dự phòng và chữa bệnh của các chất chống vi trùng trong nuôi trồng thủy sản Việt Nam. Cùng quan điểm với Lim và cs (2016), chúng tôi kết luận rằng một yêu cầu nghiêm ngặt để kiểm soát cả việc sử dụng kháng sinh dự phòng và điều trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản Việt Nam là rất cần thiết hạn chế sự bùng phát dịch bệnh cộng đồng và tổn thất kinh tế gây ra bởi các chủng có độc lực cao và kháng đa loại kháng sinh. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Al Faruk; Amir Hossain; et al. 2018. Asian Australas J Biosci Biotechnol. 3(2): 93-105. [2] Nguyễn Hữu Thịnh, Bùi Thị Kim Cương, Đỗ Viết Phương, 2011. Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM [3] Nguyễn Duy Khương, 2011. Luận văn tốt nghiệp đại học. Đại học Cần Thơ. [4] Phạm Thị Thùy Mỹ, 2011. Luận văn tốt nghiệp đại học. Đại học Cần Thơ [5] Từ, T.D., Huỳnh, T.N.T và Nguyễn, K.D. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 26 (2013): 96-103 [6] Đặng, T.H.O, Trương, Q.N., Nguyễn, Đ.H. Tạp chí Khoa học 2012:22c 194-202 [7] Hossain, M.S., et al. 2017. International Journal of Fisheries and Aquatic Studies 5(3): 520-524 [8] Dung T.T, Haesebrouck, F., Tuấn N.A., Sorgeloos P., Baele M., Decostere A. 2010. Tạp chí Khoa học ĐH Cần Thơ:15a 162-171. [9] Cabello F.C, Godfrey H.P, Tomova A., Ivanova L., Dölz H., Millanao A., Buschmann A.H. 2013. Environ. Microbiol. 15:1917–1942. [10] Aoki T. 1988. Microbiol. Sci. 5: 219-223. [11] Mc Phearson, R.M., et al. Aquaculture. 99, Issues 3–4, December 1991, Pages 203-211 [12] Aoki T. and Takahashi A. 1987. Antimicrob. Agents and Chemother. 31: 1278-1280 1062 [13] Crumlish M., Dung T.T., et al. 2002. J. Fish Dis. 25: 733- 736. [14] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, USA. [15] Cabello F.C. 2006. Environ. Microbiol. 8: 1137-1144. [16] Sørum H. 2006. American Society for Microbiology Press, Washington, DC, USA, pp. 213-238. [17] Van P.T. 2005. Chiang May, Thaïland. ISBN 88-901344-3-7. [18] Holmström K., Graslund S., Wahlstrom A., Poungshompoo S., Bengtsson B. and Kautsky N. 2003. In. J. Food Sci. Tech. 38: 255-266 [19] Huys, G., Gevers D., Temmerman R., Cnockaert M., Denys R., Rhodes G., Pichup R., McGann P., Hiney M., Smith P. and Swings J. 2001. Syst. Appl. Microbiol. 24: 122-130 [20] Le, T.X., Munekage Y., Kato S.I. 2005. Total Environ. 349: 95-105. [21] Cabello, F.C. 2004. Fundacion Terram. Analisis de Politicas Publicas. 17: 11-16. [22] Lim, Y.J., Kim, D.H., et al. 2016. Aquacult. Int. 24, 1153-1161.