Đánh giá biểu hiện Cyclic adenosine monophosphate trong tế bào leydig chuột dưới kích thích của hLH và rLH

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00077 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CYCLIC ADENOSINE MONOPHOSPHATE TRONG TẾ BÀO LEYDIG CHUỘT DƯỚI KÍCH THÍCH CỦA hLH VÀ rLH Dương Tiến Thạch, Phan Thị Diệu, Phan Phước Minh Hiệp, Nguyễn Thị Mộng Điệp* Tóm tắt: Cyclic adenosine monophosphate (cAMP, AMP vòng) là một chất truyền tin thứ hai quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, là dẫn xuất của adenosine triphosphate (ATP) và được sử dụng để truyền tín hiệu nội bào ở nhiều sinh vật khác nhau, truyền tin theo con đường phụ thuộc vào cAMP. Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của cAMP trong tế bào Leydig chuột (nằm ở mô khối u Leydig), mLTC-1 (mouse Leydig tumor cells, in vitro) được kiểm tra thông qua sự kích hoạt của hai loại hormone, Rat Luteinizing Hormone (rLH) và Human Luteinizing Hormone (hLH). Kết quả cho thấy, cường độ tín hiệu cAMP nội bào dưới kích thích của LH có nguồn gốc từ người là mạnh hơn nhiều so với LH có nguồn gốc từ chuột. Chất ức chế trực tiếp hoạt động của enzyme adenylyl cyclase, ddA, đã làm giảm tín hiệu cAMP nội bào trong tế bào Leydig mLTC-1. Từ khóa: Adenylyl cyclase, cAMP, Leydig, mLTC-1, phosphodiesterase. 1. MỞ ĐẦU Tế bào điều hòa hoạt động của nó thông qua các con đường tín hiệu, có rất nhiều con đường tín hiệu chịu trách nhiệm truyền tin trong tế bào và cAMP là một trong những hệ thống tín hiệu đầu tiên được xác định. Trong đó, cAMP đóng vai trò là chất truyền tin thứ hai và tham gia vào nhiều hệ thống truyền tin khác nhau đáp ứng với các chất kích thích ngoại bào như hormone và chất dẫn truyền thần kinh (Sutherland et al., 1958). Nồng độ cAMP nội bào được điều chỉnh bởi sự cân bằng giữa hoạt động của hai enzyme: adenylyl cyclase (AC) và phosphodiesterase nucleotide (PDE). Các đồng phân khác nhau của các enzyme này được mã hoá bởi một số lượng lớn các gen khác nhau về biểu hiện kiểu hình và cơ chế điều hòa, tạo ra các phản ứng tế bào và kích thích đặc hiệu (McKnight, 1991). Dòng tế bào Leydig mLTC-1 từ chuột đã được thiết lập từ nhiều năm trước từ mô khối u Leydig có kí hiệu là M548OP thuộc Viện Nghiên cứu Ung thư Papanicolaou của Mỹ (Rebois, 1982). Sau nhiều lần cấy ghép liên tiếp ở chuột đực có kí hiệu là C57B1/6J, mô khối u sẽ được tách ra khỏi cơ thể chuột và được đông lạnh trong môi trường 199 (Gibco) chứa 20% huyết thanh và 10% glycerol và được bảo quản trong nitơ lỏng (Rebois, 1982). Đây là dòng tế bào đã được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm nghiên cứu về sự liên kết giữa hCG với các thụ thể LHR (Rebois, 1984; Rebois et al., 1983) và sự sản sinh steroid hormone dưới sự kiểm soát của những hormone điều hòa tuyến sinh dục do thùy Trường Đại học Quy Nhơn *Email: nguyenthimongdiep@qnu.edu.vn 624 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM trước tuyến yên tiết ra (Abdou et al., 2014). Chúng ta biết rằng tế bào tinh hoàn Leydig có một lượng thụ thể khá thấp (Catt et al., 1972; Catt et al., 1971), và một con số cao hơn nhiều chắc chắn sẽ ảnh hưởng đến phương thức kích hoạt con đường cAMP bởi các hormone có hoạt động LH khác nhau và phương phức có thể được điều khiển bởi các con đường khác. Do vậy, chúng tôi đã chọn sử dụng những tế bào này cho nghiên cứu của mình. Mục đích chính nghiên cứu của chúng tôi là kiểm tra hiệu quả kích thích của hormone có nguồn gốc khác nhau, từ người và từ động vật, đến sự hình thành cAMP thông qua hoạt hóa enzyme adenylyl cyclase. Nghiên cứu gần đây nhất, chúng tôi đã thiết lập thành công một mô hình tế bào bằng cách chuyển nạp vector pGlosensor–TM -22F cyclic AMP plasmid đáp ứng luciferase vào dòng tế bào Leydig mLTC-1. Các tế bào mLTC-1 chuyển nạp 24 giờ trước khi sử dụng đã có biểu hiện cAMP đáp ứng luciferase với hệ số biến thiên dưới 10% (Klett et al., 2016). Sau đó, sử dụng phát quang oxiluciferin như điểm kết thúc cho phép đo thời gian thực của việc sản xuất cAMP nội bào. Như vậy, với phương pháp thí nghiệm này có thể thực hiện nghiên cứu về sự tích lũy cAMP nội bào. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Hóa chất Tất cả các hóa chất được mua từ Sigma-Aldrich trừ khi có ghi chú khác. 2.2. Vật liệu Dòng tế bào Leydig chuột, mLTC-1 (in vitro) do Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia (INRAe) Pháp cung cấp. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy tế bào Tế bào Leydig mLTC-1 nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen) có bổ sung huyết thanh bò 48 tiếng trước khi tra vào các giếng trên một đĩa nuôi cấy 96 giếng, khoảng 100.000 tế bào/giếng, sau đó mang ủ ở 37 °C với 5% CO2 trong vòng 24 tiếng. Xác định cAMP nội bào cAMP nội bào tích lũy dưới tác động của hormone trong các tế bào mLTC được đo bằng sự phát quang của oxiluciferin được sản xuất dưới tác dụng của luciferase phụ thuộc cAMP. Tế bào mLTC-1 sau 24 tiếng nuôi cấy được transfected với Glosensor-TM-22F cyclic AMP plasmid, sử dụng chất vận chuyển X-tremeGENETM-HP-DNA. Plasmid này bao gồm trình tự gen mã hóa luciferase của đom đóm dung hợp với vùng liên kết cAMP của gen mã hóa protein kinase A cho phép kiểm soát hoạt động enzyme bằng cAMP. Sau đó dịch môi trường transfection được loại bỏ và thay thế bằng môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh và chứa cơ chất của luciferase là luciferin có bổ sung IBMX. Tế bào sau đó được ủ ở 28 °C trước khi kích thích bằng hLH hoặc rLH bằng cách bổ sung vào trong giếng trước khi quan sát nồng độ cAMP bằng máy đo quang phổ huỳnh quang. PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 625 Sau đó, các hormone ở các nồng độ khác nhau được thêm vào giếng (n = 3 mỗi liều) và đĩa ngay lập tức được đặt vào đầu đọc Polarstar OPTIMA (BMG labtech) phát hiện sự phát quang do các tế bào phát ra theo thời gian. Đánh giá khả năng sống của tế bào mLTC-1 Các tế bào mLTC-1 được gieo vào đĩa 96 giếng với 100.000 tế bào/giếng. Hai ngày sau, môi trường được thay thế bằng môi trường không có huyết thanh và bổ sung 20 µl CellTiter-Blue Reagent (Promega, Madison, WI, USA) đến từng giếng. Sau khi ủ trong 2 giờ ở 37 °C, những thay đổi trong huỳnh quang đã được ghi lại bằng máy đo quang phổ Spectra Gemini (Sunnyvale, CA) ở bước sóng kích thích 560 nm và bước sóng phát xạ là 640 nm. Tín hiệu huỳnh quang từ thuốc thử CellTiter-Blue tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống. Xử lý số liệu Trong mỗi thí nghiệm, 3 lần lặp lại được thực hiện và giá trị trung bình cũng như sai số chuẩn của giá trị trung bình (SD) được xác định. Phân tích ý nghĩa thống kê ANOVA (Duncan test, p < 0,05) bằng phần mềm Graphpad Prism. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nồng độ cAMP nội bào dưới tác động kích thích của hLH và rLH Trong thí nghiệm này chúng tôi thử nghiệm hLH và rLH ở các nồng độ khác nhau: 5 ng, 2,5 ng và 1,25 ng; thời gian đo tín hiệu cAMP nội bào kéo dài 60 phút (đây cũng là thời gian kích thích tế bào của hLH và rLH). Kết quả được trình bày ở Hình 1. Hình 1. Biểu hiện tín hiệu của cAMP dưới tác động kích thích của hLH và rLH ở các nồng độ khác nhau. Lượng hormone hLH và rLH được tra vào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng là giống nhau 10 µl, mỗi nồng độ đều lặp lại 3 lần. Số liều trình bày ở biểu đồ là giá trị trung bình về cường độ tín hiệu biểu hiện của cAMP ở cả 3 lần Kết quả của chúng tôi ở Hình 1 cho thấy có sự khác biệt về biểu hiện của cAMP ở các nồng độ kích thích khác nhau của 2 loại hormone hLH và rLH trong tế bào mLTC-1. Tuy nhiên cường độ tín hiệu cAMP nội bào dưới kích thích của hLH là mạnh hơn nhiều so với 626 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM rLH (P< 0,001), điều này cho thấy mức độ kích hoạt của LH đến enzyme adenylyl cyclase dẫn đến phản ứng AMP vòng từ các loài khác nhau là khác nhau và hiệu ứng của LH có nguồn gốc từ người là mạnh hơn nhiều so với LH có nguồn gốc từ chuột. Nồng độ cao nhất của rLH 5 ng cho cường độ tín hiệu cAMP nội bào bằng cường độ thấp của hLH 1,25 ng. Kết quả này gợi nhớ đến quan sát trước đây của chúng tôi rằng LH có nguồn gốc từ người biểu hiện sự bắt giữ adenylate cyclase chậm hơn nhiều khi loại bỏ chúng khỏi môi trường nuôi cấy so với tất cả các LH có nguồn gốc không phải từ người (Klett et al., 2016). Do đó, rất hấp dẫn khi đề xuất rằng các hormone của con người đạt đến trạng thái phân tán chậm trong phức hợp của chúng với LHR, thúc đẩy hoạt động của adenylyl cyclase. 3.2. Ảnh hưởng của chất ức chế hoạt động của enzyme adenylyl cyclase, 2’3’- Dideoxyadenosine, đến cường độ biểu hiện của cAMP dưới kích thích của hLH và rLH Như chúng ta đã biết adenylate cyclase là một enzym đóng vai trò quan trọng trong chuỗi truyền tín hiệu từ bên ngoài tế bào vào trong tế bào chất bằng protein G. Khi nhận được tín hiệu truyền từ protein G (protein G nhận tín hiệu từ thụ thể), adenylyl cyclase sẽ thực hiện chức năng của mình là xúc tác quá trình chuyển hóa adenosine triphosphate (ATP) thành adenosine monophosphate vòng (cAMP). Sản phẩm của adenylyl cyclase - cAMP - là một mắt xích quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào, nó được xem là chất truyền tín hiệu thứ hai trong tế bào vì bản thân nó sẽ hoạt hóa các enzyme PKA có tác dụng thay đổi hoạt tính một số loại protein trong tế bào (McKnight, 1991). Adenylyl cyclase có thể được kích hoạt và ức chế bởi nhiều tác nhân, ảnh hưởng đến nồng độ cAMP nội bào. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng chất ức chế trực tiếp đến hoạt động của enzyme adenylyl cyclase trên màng tế bào là 2’5’-Dideoxyadenosine để theo dõi hiệu ứng kích thích của hLH và rLH đến nồng độ cAMP nội bào trong tế bào mLTC-1. Kết quả được thể hiện ở Hình 2. Hình 2. Biểu hiện của cAMP dưới tác động kích thích của hormone hLH (1,25 ng) và rLH (1,25 ng) với sự có mặt hoặc vắng mặt chất ức chế trực tiếp hoạt động enzyme adenylyl cyclase, 2’3’-Dideoxyadenosine (ddA, 200 µM) PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 627 Kết quả của chúng tôi cho thấy, hormone hLH và rLH đã tác động enzyme adenylyl cyclase thúc đẩy phản ứng chuyển đổi ATP thành cAMP, tuy nhiên tại các giếng tế bào có bổ sung ddA, hoạt động của adenylyl cyclase bị ức chế làm giảm tín hiệu cAMP nội bào so với khi không bổ sung ddA (P< 0,001). Đồng thời chúng tôi cũng cho thấy cường độ tín hiệu cAMP nội bào tại các giếng tế bào được kích thích bởi hLH là lớn hơn khi được kích thích bởi rLH (P< 0,001). Như vậy, kết quả này một lần nữa khẳng định kết luận của chúng tôi tại Mục 3.2 là cường độ tín hiệu cAMP nội bào dưới tác động kích thích của hormone có nguồn gốc từ người, hLH trong tế bào mLTC-1 là mạnh hơn so với hormone có nguồn gốc từ động vật, rLH. Dựa trên quan sát của chúng tôi trước đây (Combarnous et al., 1986), LH có nguồn gốc người đã thúc đẩy việc thiết lập trạng thái không thể đảo ngược của phức hợp với LHR dẫn đến tỷ lệ S/B cao hơn (S: phản ứng steroid; B: liên kết với LHR) hơn với các LH có nguồn gốc động vật (lợn, cừu). 3.3. Đánh giá tỷ lệ sống của tế bào trong mỗi giếng sau khi kích hoạt với hormone hLH và rLH Sau khi kích hoạt tế bào bằng hormone hLH và rLH, để đảm bảo độ tin cậy cho kết quả của những thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào mLTC-1 trong các giếng trên đĩa 96 giếng, vì cường độ tín hiệu cAMP nội bào đo được sau 60 phút kích thích bởi hLH và rLH là phụ thuộc rất nhiều vào tỷ lệ sống của tế bào. Trong tất cả các thí nghiệm của chúng tôi, tại mỗi giếng đều được tra một tỷ lệ tế bào là như nhau, 100.000 tế bào/giếng. Kết quả kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào mLTC-1 được thể hiện tại Hình 3. Hình 3. Tỷ lệ sống của tế bào trong mỗi giếng sau khi kích hoạt với hormone hLH và rLH 628 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Kết quả thí nghiệm cho thấy việc kích thích tế bào bằng hormone hLH và rLH không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tế bào (P > 0,05). Như vậy kết quả đo cường độ tín hiệu cAMP nội bào trong các thí nghiệm trên là có độ chính xác cao. 4. KẾT LUẬN Cường độ tín hiệu cAMP nội bào dưới kích thích của LH có nguồn gốc từ người là mạnh hơn nhiều so với LH có nguồn gốc từ chuột. Chất ức chế trực tiếp hoạt động của enzyme adenylyl cyclase, ddA, làm giảm tín hiệu cAMP nội bào trong tế bào. Kích hoạt tế bào bằng hLH và rLH trong thời gian 60 phút không làm thay đổi tỷ lệ sống của tế bào. TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdou H. S., Bergeron F., Tremblay J. J., 2014. A cell-autonomous molecular cascade initiated by AMP-activated protein kinase represses steroidogenesis. Molecular and Cellular Biology., 34(23): 4257-4271. Catt K. J., Dufau M. L., Tsuruhara T., 1971. Studies on a radioligand-receptor assay system for luteinizing hormone and chorionic gonadotropin. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 32(6): 860-863. Catt K. J., Dufau M. L., Tsuruhara T., 1972. Radioligand-receptor assay of luteinizing hormone and chorionic gonadotropin. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism., 34(1): 123-132. Combarnous Y., Guillou F., Martinat N., 1986. Functional states of the luteinizing hormone/choriogonadotropin-receptor complex in rat Leydig cells. J. Biol. Chem., 261(15): 6868-6871. Klett D., Meslin P., Relav L., Nguyen T. M., Mariot J., Jegot G., Cahoreau C., Combarnous Y., 2016. Low reversibility of intracellular cAMP accumulation in mouse Leydig tumor cells (mLTC-1) stimulated by human Luteinizing Hormone (hLH) and Chorionic Gonadotropin (hCG). Molecular and Cellular Endocrinology., 434: 144-153. McKnight G.S., 1991. Cyclic AMP second messenger systems. Current Opinion in Cell Biology., 3(2): 213-217. Rebois R. V., 1982. Establishment of gonadotropin-responsive murine leydig tumor cell line. The Journal of Cell Biology., 94(1): 70-76. Rebois R. V., 1984. Fishman PH. Down-regulation of gonadotropin receptors in a murine Leydig tumor cell line. Journal of Biological Chemistry., 259(5): 3096-3101. Rebois R. V., Fishman P. H., 1983. Deglycosylated human chorionic gonadotropin. An antagonist to desensitization and down-regulation of the gonadotropin receptor-adenylate cyclase system. Journal of Biological Chemistry., 258(21): 12775-12778. Sutherland E. W., Rall T. W., 1958. Fractionation and characterization of a cyclic adenine ribonucleotide formed by tissue particles. Journal of Biological Chemistry., 232(2): 1077– 1091. PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 629 EVALUATION OF CYCLIC ADENOSINE MONOPHOSPHATE EXPRESSION IN MOUSE LEYDIG CELLS UNDER THE STIMULATION OF hLH AND rLH Duong Tien Thach, Phan Thi Dieu, Phan Phuoc Minh Hiep, Nguyen Thi Mong Diep* Abstract: Cyclic adenosine monophosphate (cAMP, cyclic AMP) is an important second messenger in many biological processes. It is a derivative of adenosine triphosphate (ATP) and is used to transmit intracellular signals in many different organisms, which depends on cAMP signaling pathways. In this study, the expression of cAMP in mouse Leydig cells (in testicular tissue), and mLTC-1 (mouse Leydig tumor cells, in vitro) was tested through the activation of two hormones, Rat Luteinizing Hormone (rLH) and Human Luteinizing Hormone (hLH). Results showed that the signal of intracellular cAMP by human LH was stronger than rat LH. A direct inhibitor of the adenylyl cyclase enzyme, ddA, reduced intracellular cAMP signal in mLTC-1 cells. Keywords: Adenylyl cyclase, cAMP, Leydig, mLTC-1, phosphodiesterase. Quy Nhon University *Email: nguyenthimongdiep@qnu.edu.vn