Đánh giá hiệu quả hấp phụ Aflatoxin B1 của chế phẩm T5X ở điều kiện in vitro

1063 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HẤP PHỤ AFLATOXIN B1 CỦA CHẾ PHẨM T5X Ở ĐIỀU KIỆN IN VITRO Nguyễn Thị Lan Anh, Nguyễn Văn Khanh Viện Khoa học Ứng dụng, trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH) TÓM TẮT Các loại thức ăn hỗn hợp tự trộn (dạng bột) sử dụng heo thịt bị nhiễm aflatoxin (AF) là 92% với nồng độ 60,93±116,66 ppb cao hơn thức ăn công nghiệp (dạng viên). Kết quả đánh giá hiệu quả hấp phụ aflatoxin B1 (AFB1) của chế phẩm T5X ở điều kiện in vitro cho thấy sử dụng T5X với lượng khuyến cáo của nhà sản xuất (20 mg/10g thức ăn) cho hiệu quả hấp phụ aflatoxin B1 là 88,01%. Ở các mức độc tố 100 ppb, 200 ppb, và 500 ppb của AFB1 hiệu quả hấp phụ của T5X có xu hướng giảm dần. Ở mức pH = 7 hiệu quả hấp phụ AFB1 của T5X tốt hơn ở pH = 3. Ở mức độc tố 500ppb, hiệu quả hấp phụ AFB1 của T5X là khá thấp, 80,51%. Sử dụng T5X với lượng 40mg/10g thức ăn hấp phụ được 98,7% lượng AFB1 ở hàm lượng 500 ppb với điều kiện môi trường pH = 7. Từ khóa: Chế phẩm hấp phụ, aflatoxin, T5X. EVALUATE THE EFFECTIVE ADSORPTION OF AFLATOXIN B1 BY T5X IN VITRO Nguyen Thi Lan Anh, Nguyen Van Khanh Institute for Applied Sciences, Ho Chi Minh city University of Technology SUMMARY The title of evaluate the effective adsorption of aflatoxin B1 by T5X was designed with 6 treatments, six replications. The complete feed (powder) that was used for meat pig being contaminated by AF was 92% with 60.93±116.66ppb, which was higher than industrial feed (pellet). The experimental results showed that using T5X at level recommended by the manufacturer (20 mg/10 g feeds) gave the effective adsorption of AFB1 was 88.01%. The effectiveness of adsorption of AFB1 at the pH = 7 was better than pH = 3. At the level 500 ppb, T5X gave the effective adsorption of AFB1 was not good, 80.51%. T5X at level 40 mg/10g feeds adsorbed 98.7% AFB1 of 500 ppb levels at the pH = 7. Keywords: Adsorption, aflatoxin, T5X. 1064 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuận lợi cho các loài nấm mốc phát sinh và sản sinh độc tố. Các loại độc tố như aflatoxin, ochratoxin A, fumonisin, zearalenone, trichothecene, v.v. được tìm thấy phổ biến trong các loại thức ăn chăn nuôi và thực phẩm tự nhiên, được sản sinh chủ yếu bởi nấm Aspergillus, Fusarium và Penicillium (Griessler và cs., 2010). Aflatoxin là chất chuyển hóa thứ cấp được sản sinh bởi các loài Aspergillus, trong đó loài A. flavus và A. parasiticus được biết đến nhiều nhất. Độc tố nấm mốc là độc tố sinh ra từ nấm mốc, những độc tố này không phải là hợp chất sẵn có trong nguyên liệu thức ăn, mà do sự tổng hợp của các loài nấm mốc có trong nguyên liệu trong quá trình thu hoạch, bảo quản và chế biến (Griessler và cs., 2010). Hiện nay, 5 loại độc tố gồm aflatoxin, deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin và fumonisin được cho là nguy hiểm nhất, trong đó aflatoxin được quan tâm hơn cả (Osweiler và Ensley, 2012). Aflatoxin khi đến ruột non sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch của ruột non do khối lượng phân tử nhỏ. Sau khi được hấp thu qua đường tiêu hóa, độc tố vận chuyển trong hệ tuần hoàn nhờ liên kết với các tế bào máu hoặc protein huyết tương (albumin) và được chuyển vào trong gan, là cơ quan chính xảy ra quá trình chuyển hóa (Gratz, 2007). Ở Việt Nam, giải pháp được nhiều nhà chăn nuôi lựa chọn để ngăn ngừa tác hại của AF là sử dụng chế phẩm hấp phụ độc tố trộn vào thức ăn. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều sản phẩm hấp phụ độc tố nấm mốc như Klinofeed, Clean Tox, Farmavet, Mycofix secure, Mycofix select 3,0,và gần đây sử dụng một số sản phẩm chiết xuất từ thành tế bào nấm men mới như T5X, Captoxin premium, Mycosorb (Eter-Gluco-Manan), 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu: – Thức ăn hỗn hợp tự trộn và thức ăn công nghiệp cho heo được thu thập tại Tp. Hồ Chí Minh. – Chất chuẩn Aflatoxin B1 5mg (Romer Labs, Inc. Union, MO, USA). – Chất hấp phụ T5X (INVIVO NSA của Neovia A & D, France). – Dung dịch đệm pH = 3 gồm NaCl 3,1g; KCl 1,1g; CaCl2 0,15g; NaHCO3 0,6g vào 1 lít nước cất và acid hoá bằng HCl 1M, sau đó chuẩn độ để được pH = 3 bằng máy đo pH (Avantaggiato và cs., 2003). – Dung dịch đệm pH=7 tương đương với pH của ruột gồm KH2PO4 3,4g; Na2HPO4 3,53g vào 1 lít nước cất và kiềm hóa bằng NaOH 0,15 M sau đó chuẩn độ để được pH = 7 bằng máy đo pH (Stippler và cs., 2004). 2.2. Phƣơng pháp tiến hành: – Mẫu khảo sát tỷ lệ và mức độ nhiễm AF trong thức ăn công nghiệp (53 mẫu) và thức ăn hỗn hợp tự trộn (25 mẫu) cho heo thịt (60 ngày tuổi đến xuất chuồng) được lấy theo TCVN số 4325.2007. – Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả hấp phụ aflatoxin B1 của T5X trên thức ăn hỗn hợp tự trộn của heo thịt theo nồng độ khuyến cáo (20 mg/kg thức ăn) được bố trí theo nồng độ aflatoxin B1 có 3 mức: 100 ppb, 200ppb, và 500ppb, 2 mức pH thí nghiệm (3 và 7), 6 nghiệm thức, 6 lần lặp lại. Tổng số mẫu xét nghiệm AFB1 là 36 mẫu. – Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả hấp phụ aflatoxin B1 khi tăng nồng độ của T5X trong thức ăn hỗn hợp tự trộn của heo thịt được tiến hành với nồng độ AFB1 là 500 ppb ở điều kiện pH=7 tương đương 1065 pH ruột heo với nồng độ chất hấp phụ theo khuyến cáo của nhà sản xuất (20 mg/ 10 g thức ăn) và tăng lên gấp 2 (40 mg/ 10 g thức ăn), gấp 3 lần (60 mg/10 g thức ăn), tổng số mẫu xét nghiệm AFB1 là 18 mẫu. – Tạo dung dịch chuẩn mẹ AFB1 nồng độ 1mg/ml: Hoà tan 5mg tinh thể độc tố trong 5ml methanol, hút 800µl dung dịch chuẩn mẹ chứa 800 µg aflatoxin B1 cho vào 99,2 ml dung dịch đệm (pH = 3±0,2 hay pH = 7±0,2) để tạo các lô dung dịch chuẩn 100ml có nồng độ 8µg/ml AFB1 tương đương 8 ppm. Tiếp tục pha dung dịch có nồng độ độc tố AFB1 100 ppb, 200 ppb, 500ppb. Nồng độ AFB1 đã pha sẽ được kiểm tra và điều chỉnh bằng máy HPLC. Cách tiến hành: Cân 10g mẫu thức ăn, 40ml dung dịch chuẩn cho vào ống nghiệm ở điều kiện pH = 3 và pH = 7. Tiếp tục thêm chất hấp phụ theo liều lượng khuyến cáo 20 mg T5X/ 10 g thức ăn (thí nghiệm 1) và gấp 2 (40 mg/10 g thức ăn), 3 lần (60 mg/10 g thức ăn) (thí nghiệm 2), đậy nắp đem lắc trong 1 giờ (400 vòng/phút) và ủ ở 390C trong 4h (Gallo và Masoero, 2010), tiếp tục lắc trong 6 giờ. Sau đó, ly tâm trong 10 phút (4000 vòng/phút), hút 4ml dịch chiết pha loãng với 8ml dung dịch đệm PBS. – Phân tích bằng HPLC: Sử dụng cột sắc ký Zorbax SB C18, 5µm, 250 x 4,6mm. Aflatoxins được phát hiện bởi đầu dò fluorescence của máy HPLC Agilent 1100 tại bước sóng kích thích là 365 nm và bước sóng phát quang là 410 nm. – Khảo sát tỷ lệ và mức độ nhiễm AF: + Tỷ lệ nhiễm AF (%) = (số mẫu chứa AF/ ∑ số mẫu phân tích) × 100 + Tỷ lệ vi phạm AF (%) = (số mẫu chứa AF vượt mức quy định/ ∑ số mẫu phân tích) × 100 + Tỷ lệ nhiễm theo từng dạng thức ăn (%) = (số mẫu chứa AF trong từng dạng/ ∑ số mẫu phân tích từng dạng) × 100 + Mức độ nhiễm AF (ppb) = (∑ hàm lượng AF trong mẫu nhiễm/ ∑ số mẫu nhiễm AF) + Mức độ nhiễm AF vi phạm (ppb) = (∑ hàm lượng AF tổng số trong mẫu nhiễm vi phạm/∑ số mẫu nhiễm AF vi phạm) + Mức độ nhiễm theo từng dạng thức ăn (ppb) = (∑ hàm lượng AF trong mẫu từng dạng/∑ số mẫu nhiễm phân tích từng dạng). – Đánh giá hiệu quả hấp phụ: Chỉ tiêu phần trăm hấp phụ là tỷ lệ giữa lượng độc tố bị hấp phụ với lượng độc tố có trong ống nghiệm ban đầu. Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm Minitab 16.0, Trắc nghiệm Tukey để so sánh các trung bình và trắc nghiệm χ2 để so sánh các tỷ lệ. Số liệu mức nhiễm được chuyển đổi sang dạng log (x). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tỷ lệ và mức nhiễm aflatoxin (AF) trong thức ăn hỗn hợp tự trộn (dạng bột) và thức ăn công nghiệp (dạng viên) của heo thịt Kết quả khảo sát tỷ lệ và mức nhiễm AF trong 78 mẫu thức ăn chăn nuôi cho heo thịt tại Tp. Hồ Chí Minh được ghi nhận ở Bảng 1 cho thấy thức ăn dạng bột có tỷ lệ nhiễm AF tổng số là 92% với mức nhiễm trung bình là 60,93 ± 116,66 ppb cao hơn tỷ lệ nhiễm AF tổng số của thức ăn dạng viên là 77,36% với mức nhiễm trung bình là 14,29 ± 24,08 ppb và mức nhiễm AF khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Như vậy, tỷ lệ và mức nhiễm AF tổng số của thức ăn dạng bột cao hơn dạng viên. Kết quả này tương tự kết quả khảo sát của Trần Huỳnh Bảo Ngọc (2008) tại Bà Rịa - Vũng Tàu đã báo cáo 90% (18/20 mẫu) thức ăn dạng bột nhiễm AF cao hơn thức ăn dạng viên 87,5% (14/16 mẫu). 1066 Trong 2 loại thức ăn sử dụng cho heo thịt khảo sát, thức ăn dạng bột có tỷ lệ nhiễm AF vượt mức quy định (VMQĐ) là 16% ở mức nhiễm AF tổng số VMQĐ là 253,18 ± 195,87 ppb cao hơn so với thức ăn dạng viên (1,89%) ở mức nhiễm AF tổng số VMQĐ là 149,4 ppb và tỷ lệ VMQĐ khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Kết quả của chúng tôi cao hơn so với kết quả của Lâm Thị Kim Loan (2012) lấy mẫu tại Tp. HCM có 13,3% thức ăn dạng bột VMQĐ và 100% thức ăn dạng viên đạt chuẩn. Điều này cho thấy rằng người chăn nuôi heo thịt chưa có điều hiện tốt để tiếp cận nguồn nguyên liệu chất lượng cao làm thức ăn chăn nuôi tự trộn. Mức nhiễm 4 loại AF trong hai dạng thức ăn dạng bột và dạng viên khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Trong 4 loại AF khảo sát, tỷ lệ và mức độ nhiễm AFB1 của thức ăn dạng bột cao hơn có ý nghĩa thống kê so với thức ăn dạng viên (P = 0,001). Kết quả của chúng tôi thấp hơn Trần Thụy Phương Trúc (2008), tác giả đã ghi nhận tỷ lệ nhiễm AFB1 trên các mẫu thức ăn dạng bột là 39,29% với mức nhiễm 97,19 ppb cao hơn 12,5 % với mức nhiễm 78,68 ppb đối với mẫu thức ăn dạng viên tại TP. Hồ Chí Minh 3.2 Hiệu quả hấp phụ AFB1 của T5X trong thức ăn (TĂ) hỗn hợp tự trộn của heo thịt Kết quả thí nghiệm đánh giá hiệu quả hấp phụ AFB1 của T5X được ghi nhận ở Bảng 2 cho thấy hiệu quả hấp phụ AFB1 của T5X trung bình ở 3 mức độc tố là 88,01%. Ở các mức độc tố 100 ppb, 200 ppb, và 500 ppb hiệu quả hấp phụ của T5X có xu hướng giảm dần tương ứng ở mức trung bình là 96,09%, 87,43%, và 80,51% và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Hiệu quả hấp phụ trung bình của 3 mức độc tố ở pH = 7 là 89,36% cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với hiệu quả hấp phụ ở mức pH = 3 là 86,65% Kết quả khảo sát cho thấy hiệu quả hấp phụ AFB1 của T5X là khá cao. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Fruhauf và cs. (2011), chế phẩm Microbond (chiết xuất từ thành tế bào nấm men) cho hiệu quả hấp phụ AFB1 là 100%. 3.3 Hiệu quả hấp phụ AFB1 ở nồng độ 500 ppb và pH = 7 khi tăng nồng độ T5X trong thức ăn hỗn hợp tự trộn của heo thịt Khả năng hấp phụ AFB1 ở nồng độ 500 ppb của T5X ở 3 mức 20 mg, 40 mg và 60 mg trong 10g thức ăn được ghi nhận ở Bảng 3 Qua bảng 3 cho thấy hiệu quả hấp phụ cả AFB1 của T5X ở mức 40 mg là 98,70% tương đương với mức 60 mg và cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với mức 20mg (81,25%). Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy hiệu quả hấp phụ AFB1 trung bình ở 3 mức chất hấp phụ là 92,89%, tuy nhiên, ở mức ≥ 40 mg hiệu quả hấp phụ AFB1 của T5X khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Bảng 1. Tỷ lệ và mức nhiễm AF trên thức ăn hỗn hợp tự trộn (dạng bột) và thức ăn công nghiệp (dạng viên) cho heo thịt tại Tp. Hồ Chí Minh Chỉ tiêu Dạng TĂ n Loại aflatoxin VMQĐ (N+) G1 (N+) B1 (N+) G2 (N+) B2 (N+) AF tổng số Tỷ lệ nhiễm (%) Bột 25 12,00 88,00 12,00 44,00 92,00 16,00 Viên 53 3,77 60,38 5,66 43,40 77,36 1,89 Ptỷ lệ N+ > 0,05 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 Mức nhiễm (ppb) Bột 23 21,64 (3) 28,89 (22) 3,80 (3) 6,60 (11) 60,93 ± 116,66 (1,54-521,13) 253,18± 195,87 (4) Viên 41 0,52 (2) 7,17 (32) 0,48 (3) 6,12 (23) 14,29 ± 24,08 (0,54-149,40) 149,4 (1) Pmức nhiễm > 0,05 0,05 > 0,05 0,05 1067 Ghi chú: Trong ngoặc đơn là khoảng giá trị từ nhỏ nhất đến lớn nhất; mức AFB1, AF tổng số tối đa cho phép trong thức ăn của heo thịt thức tự là 50ppb, 100 ppb (QCVN 01-12, 2009). n là số mẫu khảo sát, N+ là số mẫu có AF. Bảng 2. Phần trăm hấp phụ AFB1 của T5X ở các mức độc tố khác nhau tại pH=3 và pH=7 Nồng độ AFB1 pH 500ppb 200ppb 100ppb Tổng 3 79,76 ± 1,78 85,39 ± 0,79 94,81 ± 0,39 86,65 b 7 81,25 ± 0,78 89,47 ±1,13 97,37 ± 0,27 89,36 a Tổng 80,51c 87,43b 96,09a 88,01 Ghi chú: Có sự khác biệt rất có nghĩa thống kê (P= 0,000) giữa các mức độc tố và giữa các mức pH, nhưng không có tương tác giữa CHP*MĐT (p = 0,655), CHP*Mức pH (p = 0,837), MĐT*Mức pH (p = 0,569), và CHP*MĐT*PH (p=0,884 ) với CHP: chất hấp phụ, MĐT: mức độc tố. Bảng 3. Phần trăm hấp phụ AFB1 ở nồng độ 500 ppb và pH = 7 của các mức T5X Nồng độ Loại AF 20mg 40mg 60mg AFB1 81,25 b ± 1,56 98,70 a ± 0,10 98,72 a ± 0.13 P 0,000 Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cột theo sau bởi cùng ký tự khác biệt không có ý nghĩa thống kê qua trắc nghiệm Tukey ở mức p > 0,05. Như vậy, khi tăng nồng độ chất hấp phụ từ 20mg lên 40mg khả năng hấp phụ AFB1 của T5X tăng, nhưng ở mức 40mg T5X có khả năng hấp phụ được hầu hết cả độc tố AFB1 và đạt hiệu quả hấp phụ tương đương mức 60mg. 4. KẾT LUẬN Sử dụng T5X với lượng khuyến cáo của nhà sản xuất (20mg/ 10g thức ăn) cho hiệu quả hấp phụ AFB1 ở điều kiện pH = 3 thấp hơn ở điều kiện pH = 7. Sử dụng T5X với lượng 40mg/10g thức ăn có khả năng hấp phụ được 98,7% lượng AFB1 ở điều kiện môi trường pH = 7 (tương đương pH ruột). TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Điệp, 2004. Nấm mốc và độc tố aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. NXB Nông nghiệp. [2] Fruhauf S., Schwartz H., Ottner F., Krska R. and Vekiru E., 2011. Yeast cell based feed additives: Studies on aflatoxin B1 and zearalenone. Food Additives and Contaminants: pp 1-30. [3] Gallo A. and Masoero F., 2010. In vitro models to evaluate the capacity of different sequestering agents to adsorb aflatoxins. Italian Journal of Animal Science 9 (1): 20. 1068 [4] Gratz S., 2007. Aflatoxin binding by probiotics: Experimental studies on intestinal aflatoxin transport, metabolism and toxicity. Medical Sciences 404. 85. [5] Griessler K., Rodrigues I., Handl J. and Hofstetter U., 2010. Occurrence of mycotoxins in Southern Europe. World Mycotoxin Journal 3. 301 - 309. [6] Lâm Thị Kim Loan., 2012. Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh họ tetracycline và sự hiện diện của aflatoxin trong thức ăn gia súc tại một số trại chăn nuôi heo trên địa bàn Tp.HCM. LVTN Khoa CNTY trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM. [7] Osweiler G.D. and Ensley S.M., 2012. Mycotoxins in grains and feeds. Diseases of Swine (Eds. Zimmerman J.J., Karriker L.A., Ramirez A., Schwartz K.J. and Stevenson G.W.). Ames, Iowa, USA: 938 – 942. [8] Trần Huỳnh Bảo Ngọc, 2008. Khảo sát tình hình nhiễm AFB1 trong thức ăn hỗn hợp của heo ở thị xã Bà Rịa, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu. LVTN Khoa CNTY trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM. [9] Trần Thụy Phương Trúc, 2008. Tình hình nhiễm độc tố AF và sử dụng β-agonist, diethylstilbestrol trong thức ăn heo thịt tại một số cơ sở chăn nuôi heo trên địa bàn Tp.HCM. LVTN Khoa CNTY trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.