Đánh giá khả năng phân loại của 3 chỉ thị phân tử RBCL, ITS2 và TRNH-PSBA trên các loài thuộc chi Mahonia và Berberis (Berberidaceae)

ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CỦA 3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ RBCL, ITS2 VÀ TRNH-PSBA TRÊN CÁC LOÀI THUỘC CHI MAHONIA VÀ BERBERIS (BERBERIDACEAE) Nguyễn Thị Phương Trang1, 2*, Nguyễn Thị Hồng Mai1, Bùi Văn Thanh1, 2 1Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam *Email: nptrang@gmail.com Tóm tắt Họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) được xác định có 17 chi và gần 650 loài, trong đó chi Berberis và chi Mahonia là 2 chi có quan hệ rất gần gũi với nhau với rất nhiều đặc điểm hình thái giống nhau. Chính vì vậy trước đây, 2 chi này được nhập chung là chi Berberis. Hiện nay tất cả các loài trong họ Hoàng liên gai đều là các loài quý hiếm, được ưu tiên bảo tồn, đặc biệt các loài thuộc chi Mahonia và Berberis bị khai thác và buôn bán nhiều. Việc định loại hình thái các bộ phận buôn bán (thân, rễ, đôi khi có cả lá) là không khả thi khi không có cơ quan sinh sản (hoa và quả). Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật. Nghiên cứu dựa trên các chỉ thị DNA có độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi mà những quan sát hình thái chưa đủ cơ sở để phân biệt. Phân tích DNA cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn và đặc biệt không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khách quan như môi trường hay con người. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đánh giá khả năng phân loại của 3 vùng marker DNA thường được dùng phổ biển hiện nay cho công tác phân loại là rbcL, trnH-psbA và ITS2 trên 12 mẫu họ Berberidaceae, trong đó có 7 mẫu thuộc chi Mahonia, 4 mẫu thuộc chi Berberis và 1 mẫu thuộc chi Epimedium được sử dụng làm mẫu đối chứng. Kết quả của nghiên cứu giúp lựa chọn marker DNA phù hợp cho công tác phân loại và giám định các mẫu họ Hoàng liên gai về sau. Kết quả chỉ ra vùng gen rbcLcho thấy khả năng phân biệt 12 loài Berberidaceae là rõ ràng nhất. Trình tự gen ITS2 loài Berberis julianeae của Việt Nam đã được đăng ký lên GB với mã số truy cập là MT073031. Từ khoá: Berberidaceae, Hoàng liên gai, ITS2, rbcL, trnH-psbA, lựa chọn chỉ thị phân tử. ĐẶT VẤN ĐỀ Người đầu tiên đề cập đến các taxon của họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) là Linnaeus năm 1753. Đến nay, trên thế giới đã xác định được họ Berberidaceae có 17 chi với khoảng 650 loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới phía Bắc và ở các vùng núi cao ở cận nhiệt đới. Theo Nguyễn Tiến Bân (2003) thì ở Việt Nam họ Hoàng liên gai có 4 chi và 9 DOI: 10.15625/vap.2020.00137 167 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC 45 NĂM VIỆN HÀN LÂM KHCNVN loài, phân bố chủ yếu ở vùng cao thuộc các tỉnh miền núi phía Bắc và Lâm Đồng. Tất cả các loài này đều nằm trong Sách Đỏ Việt Nam năm 2007 ở mức nguy cấp (EN). Mã vạch DNA (DNA barcoding) là kỹ thuật hiện đại, sử dụng đoạn DNA ngắn để chuẩn hóa phân biệt giữa các loài (Lahaye, 2008; Kress, 2005). Chúng đã trở thành công cụ mới phục vụ có hiệu quả cho công tác giám định, phân loại, đánh giá quan hệ di truyền, quản lý chất lượng, nguồn gốc, xuất xứ của sản phẩm từ sinh vật (Chen, 2010). Ở thực vật bậc cao, một số vùng gen lục lạp (như matK, rbcL, psbA-trnH, atpF-atpH) và vùng gen nhân (như ITS-rDNA, 18S) đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại (phylogeny), phân loại (taxonomy) và nhận dạng (identity) loài (Liu, 2012; CBOL, 2009). Tuy nhiên, đối với mỗi nhóm đối tượng khác nhau thì khả năng phân loại của những vùng gen này là khác nhau. Nghiên cứu của Song Xue và cs. (2019) đăng trên Tạp chí Horticulture cho thấy 3 vùng gen trnC-psbD, ndhD và atpA-atpH là 3 vùng gen hữu hiệu nhất để phân biệt các loài trong chi Mận-mơ (Prunus). Muellner và cs. (2011) đã chứng minh vùng gen ITS là hữu hiệu nhất để giám định các loài họ Meliaceae. Trang và cs. (2015) đã chứng minh sự kết hợp của ba vùng gen rbcL, matK và trnH-psbA là hữu hiệu trong việc phân biệt các loài chi Hopea. Stoeckle và cs. (2011) đã sử dụng kết hợp hai vùng gen rbcL và matK để xác định xác loài cây thuốc quý hiếm đang bị buôn bán nhiều ở Bắc Phi, tuy nhiên một trở ngại của họ là thiếu dữ liệu so sánh. Như vậy rõ ràng mặc dù nhiều nghiên cứu trước đây đã chứng minh các vùng gen lục lạp là hữu hiệu trong việc phân loại các loài thực vật bậc cao, điển hình như nghiên cứu của hiệp hội nghiên cứu mã vạch sự sống (The Consortium for the Barcode of Life- CBOL) đăng trên Tạp chí PNAS năm 2009 đã chỉ rõ 7 vùng gen lục lạp gồm matK, rbcL, rpoB, rpoC1, atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI là những chỉ thị phân tử hữu hiệu cho các nghiên cứu về phân loại ở thực vật ở cạn, tuy vậy việc ứng dụng từng vùng gen vào các nhóm loài khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm khả năng phân loại của 3 chỉ thị barcoding là rbcL, trnH-psbA và ITS2 cho 12 loài họ Hoàng liên gai để kiểm tra khả năng phân loại của chúng. Nghiên cứu này cũng đồng thời bổ sung cơ sở dữ liệu về DNA cho ngân hàng gen quốc tế, góp phần làm đầy đủ hơn cơ sở dữ liệu cho ngân hàng gen về các loài Hoàng liên gai có phân bố ở Việt Nam. I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu: 12 mẫu lá gồm 7 mẫu là các loài chi Mahonia, 4 mẫu là các loài chi Berberis và 1 mẫu Epimedium được nhóm nghiên cứu của Phòng Dân tộc học thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thu trong các lần đi thực địa. Thông tin cụ thể của các mẫu nghiên cứu được thể hiện ở bảng 1. 168 ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Bảng 1. Thông tin mẫu thu và ký hiệu mẫu nghiên cứu STT Ký hiệu mẫu Tên khoa học Địa điểm thu mẫu 1 BHG 07 Mahonia sp.4 Hà Giang 2 BHG 04 Mahonia sp.5 Hà Giang 3 DL 01 Mahonia klossii Đà Lạt 4 DL 02 Mahonia klossii Đà Lạt 5 BHG 09 Mahonia sp.3 Hà Giang 6 BCB 05 Mahonia sp.1 Cao Bằng 7 BBK 03 Mahonia sp.2 Bắc Kạn 8 SB 01 Berberis julianea Sa Pa - Lào Cai 9 SB 02 Berberis julianea Sa Pa - Lào Cai 10 SB 03 Berberis julianea Sa Pa - Lào Cai 11 SB 04 Berberis julianea Sa Pa - Lào Cai 12 DDH Epimedium sp. Mẫu thu mua từ Trung Quốc Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số: DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp Doyle & Doyle (1991) có hiệu chỉnh theo điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR: Vùng gen ITS2 dài 300 bp, vùng gen trnH- psbA dài 400 bp và vùng tren rbcL dài 600 bp của cả 12 mẫu nghiên cứu được nhân bản bằng PCR với cặp mồi ITS1/ITS2 (Tao Cheng, 2015), rbcLF/R và trnH-psbA (Kress, 2005). Mỗi phản ứng PCR có thể tích 30 µl với các thành phần: 12 µl H2O deion; 15 µl PCR Master mix (2X); 1 µl mồi xuôi (10 pmol/µl); 1 µl mồi ngược (10 pmol/µl); 1 µl DNA template (10-20 ng). Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94 oC trong 3 phút; tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 94 oC trong 45 giây, 55 oC trong 30 giây (đối với gen ITS), 52 oC trong 30 giây (đối với gen rbcL) và 54 oC trong 30 giây (đối với gen trnH-psbA), 72 oC trong 30 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72 oC trong 8 phút, giữ sản phẩm ở 4 °C. Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự: Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %. Quá trình xác định trình tự nucleotide được thực hiện tại Công ty Firstbase (Malaysia). Trình tự DNA sau khi giải trình tự được hiệu chỉnh và loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu với sự trợ giúp của phần mềm Chromas-Pro2.1.6 (Technelysium Pty Ltd., Helensvale, Queensland, Australia). Các trình tự sau đó được so sánh với các trình tự đã có trên Genbank (GB), (sử dụng công cụ BLAST trong NCBI- http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Các vùng nucleotide bị nhiễu hoặc không có khả năng sắp xếp bị loại bỏ trước khi phân tích. Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên phương pháp xác suất tối đa ML (Maximum Likelihood) trên phần mềm Mega 7.0 (Kumar S., 2016). 169 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC 45 NĂM VIỆN HÀN LÂM KHCNVN II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số của 12 mẫu nghiên cứu đã được tách chiết thành công, có chất lượng DNA cao với kết quả đo OD cho chỉ số OD260/OD280 của các mẫu đều từ 1,81-1,83 chứng tỏ hàm lượng DNA thu được có độ tinh khiết cao, ít đứt gãy. Nhân bản gen bằng PCR: Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các mẫu đều lên vạch có kích thước 300 bp, 400 bp và 600 bp tương ứng với các gen ITS2, trnH-psbA và rbcL đúng như dự kiến (hình 1). Hình 1. Hình ảnh sản phẩm PCR của 6 mẫu đại diện cho 3 vùng gen khuếch đại được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 % Lane 1-2: Sản phẩm PCR gen ITS2, lane M: DNA ladder 100 bp, lane 3-4: Sản phẩm PCR gen trnH-psbA, lane 5-6: sản phẩm PCR gen rbcL. Kết quả phân tích trình tự nucleotide: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được thực hiện giải trình tự tại Công ty Firstbase. Kết quả giải trình tự các vùng gen sau đó được kiểm tra tính tương đồng (similarity) với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gen (GB) bằng công cụ BLAST. Thông thường, kết quả BLAST không cho kết luận chính xác về loài, nhưng với những trường hợp BLAST có độ bao phủ và tương đồng cao (trên 98 %) thì có thể đưa ra gợi ý về những loài gần gũi với mẫu nghiên cứu. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, trình tự 3 vùng gen ITS2, rbcL, trnH-psbA của cả 12 mẫu nghiên cứu đều cho chỉ số tương đồng cao (trên 95 %) tương ứng với các vùng gen ITS2, rbcL, trnH-psbA của các loài Mahonia và Berberis trên GB, chứng tỏ việc bước đầu phân loại hình thái của các mẫu là chính xác và cũng chứng tỏ các vùng gen nhân bản của chúng tôi là thành công. Kiểm tra khả năng phân loại của 3 chỉ thị ITS2, rbcL, trnH-psbA trên 12 mẫu nghiên cứu: Kết quả trình tự 3 vùng gen ITS2, rbcL, trnH-psbA của 12 mẫu nghiên cứu lần lượt được đưa vào phần mềm Mega 7.0, căn chỉnh (align) và so sánh đánh giá khả năng phân loại bằng việc xây dựng cây phả hệ của 12 mẫu (hình 2. (A), (B), (C)). 170 ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC (A). rbcL (B). trnH-psbA (C). ITS2 Hình 2. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của 12 mẫu nghiên cứu dựa trên phân tích trình tự gen: rbcL (A), trnH-psbA (B), ITS (C) Kết quả xây dựng mối quan hệ di truyền theo sơ đồ hình cây (dựa trên phương pháp xác suất tối đa ML (Maximum Likelihood)) của 12 mẫu nghiên cứu cho thấy: - Khi dựa trên phân tích trình tự vùng gen rbcL-600 bp, 12 mẫu Hoàng liên gai được tách thành 3 nhánh rõ ràng, trong đó 7 mẫu Mahonia tách riêng về 1 nhánh, 4 mẫu Berberis ở nhánh còn lại, loài Dâm dương hoắc (Epimedium sp.) ở nhánh thứ 3 và gần gũi với các loài của chi Berberis hơn so với Mahonia. - Khi phân tích dựa trên trình tự vùng gen trnH-psbA cũng cho kết quả 4 mẫu Berberis tập hợp thành 1 nhánh, 7 mẫu Mahonia ở 1 nhánh nhỏ khác và loài đối chứng Epimedium sp. vẫn luôn ở 1 nhánh độc lập so với 2 nhóm Berberis và Mahonia. Tuy vậy 7 mẫu Mahonia lại chia thành 2 nhóm, theo đó 3 mẫu Mahonia thu tại Hà Giang (BHG 04, BHG 07, BHG 09) lại tập trung vào 1 nhánh nhỏ, trong khi 4 mẫu Mahonia còn lại phân ly thành các nhánh nhỏ khác, cụ thể: mẫu BBK, BCB là 2 mẫu thu tại Cao Bằng và Bắc Kạn nằm ở 2 nhánh khác nhau, 2 mẫu DL 01 và DL 02 là 2 mẫu thu tại Đà Lạt (Lâm Đồng) nằm chung với nhau ở cùng 1 nhánh. Đây có thể xem như là một kết quả khá hấp dẫn vì đứng về mặt phân loại ở cấp độ loài thì trnH-psbA đã cho kết quả đúng khi phân chia chính xác 7 mẫu Mahonia và 4 mẫu Berberis thành 2 nhánh. Thêm vào đó có vẻ như vùng gen trnH-psbA còn có thể phân chia được loài địa lý khi tập hợp được các mẫu thu ở cùng địa điểm hoặc thu ở những địa điểm gần nhau vào cùng nhóm. Tuy vậy, để chứng minh được điều này thì cần có số lượng mẫu nhiều hơn cũng như cần có thêm các mẫu cùng loài nhưng thu ở những địa điểm khác nhau để đối chứng. Trong nghiên cứu này, mục tiêu đưa ra là đánh giá khả năng phân loại ở cấp độ loài thì việc vùng gen trnH-psbA nếu thực sự có khả năng phân biệt được cả phân loài (sub. species) hoặc loài địa lý) thì được xem là không phù hợp do dễ dẫn đến những kết luận sai về mẫu vật cần định danh, Do vậy đứng ở góc độ sử dụng chỉ thị phân tử để phân loại ở cấp độ loài thì vùng gen trnH-psbA sẽ là không phù hợp. Tuy nhiên, để sử dụng trong nghiên cứu thì đây sẽ là vùng gen ẩn chứa nhiều hấp dẫn bởi rất có khả năng vùng gen này sẽ giúp đánh giá được khả năng phân ly của loài địa lý hoặc các đơn vị phân loại dưới loài của các loài họ Berberidaceae. Mahonia sp4 BHG07 Mahonia sp5 BHG04 Mahonia klossii DL02 Mahonia klossii DL01 Mahonia sp3 BHG09 Mahonia sp1 BCB05 Mahonia sp2 BBK03 Epimedium sp DDH Berberis julianae SB01 Berberis julianae SB03 Berberis julianae SB02 Berberis julianae SB04 0.0050 Mahonia sp1 BCB05 Berberis julianae SB01 Berberis julianae SB04 Mahonia sp5 BHG04 Mahonia sp3 BHG09 Mahonia sp4 BHG07 Mahonia klossii DL02 Mahonia klossii DL01 Mahonia sp2 BBK03 Berberis julianae SB03 Berberis julianae SB02 Epimedium sp DDH 0.020 171 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC 45 NĂM VIỆN HÀN LÂM KHCNVN Hình 3. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của 12 loài nghiên cứu, so sánh với các loài khác trên GB MG837425.1 Epimedium sagittatum MG837434.1 Epimedium platypetalum MG837421.1 Epimedium dewuense MG837415.1 Epimedium koreanum MG837411.1 Epimedium baojingense MG837409.1 Epimedium davidii Epimedium sp DDH MG837464.1 Epimedium brevicornu MG837468.1 Epimedium dolichostemon MG837467.1 Epimedium coactum MG837470.1 Epimedium mikinorii MG837469.1 Epimedium ilicifolium MG837473.1 Epimedium zhushanense MG837475.1 Epimedium epsteinii MG837416.1 Epimedium acuminatum MG837429.1 Epimedium jinchengshanense Podophyllum versipelle HG193 KP643722.1 Podophyllum peltatum Podophyllum versipelle CC214 Podophyllum versipelle HG194 Podophyllum versipelle HG192 Podophyllum versipelle HG195 Podophyllum sp B10 Podophyllum difformis BV01 Podophyllum difformis B14 Berberis hypoxantha B09 Berberis hypoxantha B01 Berberis subacuminata B11 KC788488.1 Berberis subacuminata KX162975.1 Berberis japonica KC788464.1 Berberis aristatoserrulata Berberis wallichiana B04 KC788494.1 Berberis wallichiana KC788485.1 Berberis sargentiana MH116082.1 Berberis papillifera KR075659.1 Berberis napaulensis MF349431.1 Berberis bealei MG833461.1 Berberis laurina KC788470.1 Berberis chingii KC788480.1 Berberis kawakamii Berberis julianae SB01 Berberis julianae SB03 Berberis julianae SB02 Berberis julianae SB04 KC788479.1 Berberis julianae Berberis julianae B08 Berberis julianae B02 Mahonia sp1 BCB05 Mahonia sp. Nov MCD Mahonia sp2 BBK03 Mahonia sp3 BHG09 Mahonia sp. SM01 EF173672.1 Mahonia japonica Mahonia bealei SM02 L75871.2 Mahonia bealei Mahonia bealei BLC03 Mahonia subimbricata BCB01 Mahonia subimbricata BCB02 Mahonia jingxiensis P2 Mahonia sp4 BHG07 Mahonia sp5 BHG04 Mahonia jingxiensis C307 Mahonia klossii DL03 Mahonia klossii DL02 Mahonia klossii DL01 Mahonia sp. P01 Mahonia sp.SM01 93 99 98 65 82 97 73 57 50 31 96 48 96 57 55 88 95 81 55 36 20 32 53 93 66 6 66 100 98 94 86 40 57 47 65 25 20 15 55 16 24 17 24 40 65 0.0050 172 ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC - Đối với vùng gen ITS2: Không giống như 2 vùng gen rbcL-600 và trnH-psbA, 12 mẫu nghiên cứu thuộc 3 chi khi phân tích dựa trên trình tự gen ITS2 lại chỉ được chia thành 2 nhánh chính, trong đó mẫu Epimedium sp. thuộc 1 nhánh lớn và 11 mẫu còn lại nằm ở nhánh lớn thứ 2. Các mẫu Mahonia và Berberis nằm xem kẽ nhau trong các nhánh nhỏ chứ không phân chia rõ thành 2 nhánh như kết quả nhân được khi phân tích dựa trên trình tự gen rbcL-600 và trnH-psbA. ITS2 thuộc hệ gen nhân là vùng gen có độ bảo thủ cao hơn so với các gen trong hệ gen lục lạp. Thông thường đối với những mẫu nghiên cứu có khoảng cách di truyền không đủ lớn thì sẽ khó được phân chia nếu sử dụng các vùng gen nhân để kiểm tra. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, việc 11 loài Mahonia và Berberis không được phân chia rõ ràng thành 2 nhóm riêng biệt khi sử dụng vùng gen ITS2-rDNA phân tích chứng tỏ mối quan hệ di truyền của các loài thuộc 2 chi này là rất cao. Như vậy có thể thấy, trong 3 vùng gen sử dụng thì vùng gen rbcL-600 cho kết quả tốt nhất trong việc phân chia các loài Hoàng liên gai. Kết quả định danh và phân tích mối quan hệ di truyền của 12 loài Berberis nghiên cứu - so sánh với các loài Berberis khác trên GB dựa trên phân tích trình tự vùng gen rbcL-600 bp: Vùng gen rbcL-600 bp sau đó được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại cho 12 mẫu nghiên cứu, so sánh với các dữ liệu có trên GB để kiểm tra việc định danh cho các mẫu này (hình 3). Kết quả cho thấy 4 mẫu SB 01, SB 02, SB 03, SB 04 ban đầu được định danh là loài Berberis julianae đã cho kết quả trùng khớp 100 % với loài Berberis julianae mã số KC788479.1 trên GB, điều đó chứng tỏ nhận diện hình thái ban đầu cho 4 loài này là hoàn toàn chính xác. Hai mẫu BHG 07 và BHG 04 chưa được định danh chính xác bằng hình thái, sau khi so sánh thì nó cùng nhánh với loài Mahonia jingxiensis, tuy vậy tỷ lệ trương đồng chỉ đạt 98 %. Tiếp theo 3 loài BHG 09, BCB 05 và BBK 03 cũng là 3 loài Mahonia sp. chưa được định danh loài chính xác nhưng do thiếu dữ liệu trên GB nên không đủ cơ sở để kết luận được tên khoa học chính xác cho 3 loài này, tuy nhiên dựa vào phân tích trình tự gen thì đã cho thấy 3 loài này có mối quan hệ di truyền gần gũi, chúng được xếp ở cùng 1 nhóm trong 1 nhánh của chi Mahonia (hình 3). III. KẾT LUẬN Tất cả các loài Hoàng liên gai ở Việt Nam đều có giá trị làm thuốc và giá trị kinh tế cao nên đều đã bị khai thác cạn kiệt trong tự nhiên. Hiện nay cả 9 loài đều đã bị đưa vào Sách Đỏ và nhóm IA (nhóm nghiêm cấm khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại) trong Nghị định số 06/2019/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp). Đối với các loài họ Hoàng liên gai, do việc định loại bằng hình thái (đặc biệt khi các cây còn trong giai đoạn chưa trưởng thành) là khó khăn, nên việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định loại là cần thiết. Việc lựa chọn ra chỉ thị DNA phù hợp nhất phục vụ cho công tác phân loại/định danh các mẫu Hoàng liên gai ở Việt Nam đã được chúng tôi thực hiện và kết quả cho thấy chỉ thị rbcL là phù hợp cho các nghiên cứu về phân loại và giám định họ Hoàng liên gai ở cấp độ loài. Các phân tích cũng cho thấy hiện vẫn còn thiếu nhiều dữ liệu về trình tự gen của các loài họ Hoàng liên gai trên GB, do vậy việc cập nhật, bổ sung dữ liệu phân tử về các loài này để có đủ cơ sở so sánh, định danh mẫu vật cũng là vấn đề cần được quan tâm và thực hiện. 173 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC 45 NĂM VIỆN HÀN LÂM KHCNVN Trình tự vùng gen ITS2 loài Berberis julianeae của Việt Nam đã được đăng ký lên GB với mã số truy cập là MT073031. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được hỗ trợ thu mẫu bởi nguồn kinh phí từ đề tài Nafosted mã số: 106- NN.03-2016.49 và hỗ trợ nghiên cứu từ nguồn kinh phí của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Đề tài mã số: IEBR ĐT.13-20). TÀI LIT.13-20 KHI 1. Bộ Khoa học và Công nghệ - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2007. Sách Đỏ Việt Nam, phần II, Nxb. Khoa học tự nhiên và Công nghệ. 2. Carl Linnaeus, 1753. Species plantarum, Laurentius Salvius express. 3. CBOL Plant Working Group, 2009. A DNA barcoding for land plants. PNAS 106, No.31, 12794-12797. 4. Chromas Pro2.1.6 (Technelysium Pty Ltd, Helensvale, Queensland, Australia). 5. Doyle J. J, Doyle J. L., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12, p. 13-15. 6. Kress W. John, Kenneth J. Wurdack, Elizabeth A. Zimmer, Lee A. Weigt, and