Đánh giá sự đa dạng di truyền của tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.) bằng chỉ thị phân tử ISSR

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00021 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA TỎI LÝ SƠN (Allium sativum L.) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR Nguyễn Minh Lý*, Mai Xuân Cường, Đinh Thị Thùy Trinh Tóm tắt: Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền của giống tỏi (Allium sativum L.) tại huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi bằng chỉ thị phân tử ISSR. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỏi Lý Sơn có vỏ tép màu trắng, số tép dao động từ 15-23 tép, đường kính vùng rễ dao động từ 1,1 đến 2,0 cm. Ngoài ra, tỏi Lý Sơn có sự khác nhau về đường kính củ tỏi giữa các hộ nông dân canh tác trên các khu vực có điều kiện địa lý khác nhau. Phân tích đa hình các đoạn DNA nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền tỏi Lý Sơn từ 3 chỉ thị ISSR gồm: UBC808, UBC810, UBC834 cho thấy có sự khác biệt về giống giữa các hộ và giữa các củ tỏi khác nhau về kiểu hình. Điều này chứng tỏ sự đa dạng về di truyền của giống tỏi Lý Sơn. Đây là cơ sở khoa học cho việc chọn lựa giống cây tỏi phù hợp với điều kiện địa lí và nâng cao năng suất cây trồng. Từ khóa: Allium sativum, đa dạng di truyền, chỉ thị phân tử, ISSR, tỏi, Lý Sơn. 1. MỞ ĐẦU Tỏi (Allium sativum L.) là một trong những cây gia vị quan trọng có giá trị dinh dưỡng, giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao. Tỏi được trồng ở nhiều tỉnh thành của Việt Nam như đảo Lý Sơn, huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi và các tỉnh thành khác như Hải Dương, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận... Ngoài việc sử dụng dạng tươi hoặc khô, tỏi còn được chế biến thành các loại thực phẩm bổ dưỡng khác nhau như tỏi đen lên men, nước ép tỏi. Sản phẩm tỏi đen lên men được sử dụng trong việc điều trị các bệnh huyết áp cao và một số loại bệnh về tim mạch, phòng ngừa hỗ trợ tiểu đường, ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư (Kim et al., 2012; Fossen et al., 1996). Trong số các vùng trồng tỏi tại Việt Nam, tỏi Lý Sơn có nhiều đặc điểm khác biệt và được công nhận thương hiệu tỏi quốc gia vào năm 2009. Diện tích trồng tỏi ở Lý Sơn đạt khoảng 250 - 300 ha, đạt năng suất khoảng 70 - 80 tạ/ha. Tỏi là cây trồng chủ lực, đóng góp giá trị kinh tế cao và chiếm khoảng ¾ giá trị nông nghiệp của cả huyện đảo Lý Sơn. Theo khảo sát thực địa vào tháng 10/2018 của nhóm nghiên cứu thì việc lưu giữ giống tỏi Lý Sơn được các hộ nông dân thực hiện theo phương pháp thủ công truyền thống. Tỏi được bảo quản sau khi phơi khô trong nhà kho và tuyển chọn giống ngẫu nhiên từ các củ tỏi ở mùa vụ trước. Điều này dẫn đến sự thoái hóa giống và làm giảm chất lượng tỏi và làm năng suất tỏi Lý Sơn không ổn định qua các năm. Chính vì vậy, việc đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn giống tỏi Lý Sơn sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc đưa ra các biện pháp bảo tồn và nhân giống loại tỏi này một cách hiệu quả. Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng *Email: nmly@ued.udn.vn PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 177 Trong các phương pháp đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn giống tỏi, chỉ thị phân tử được sử dụng tương đối hiệu quả, đặc biệt là chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Jabbes et al. (2011) đã sử dụng thành công các chỉ thị ISSR để đánh giá tính đa dạng di truyền của 31 giống tỏi địa phương phục vụ cho công tác phân loại và đăng ký giống tại Tuy-ni-di. Chen et al. (2014) cũng đã phân loại 39 giống tỏi ở Trung Quốc bằng 8 chỉ thị SSR và 17 chỉ thị ISSR. Đến năm 2018, Sharma và nnk đã khẳng định ISSR có hiệu quả cao trong việc phân loại và đánh giá đa dạng di truyền của 31 giống tỏi ở Ấn Độ. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các củ tỏi giống được thu thập từ 8 hộ nông dân thuộc 2 xã An Hải và An Vĩnh (trước đây) thuộc huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi (Tọa độ: N 15o23’0.0996” E 09o6’38.5596”). Các đặc điểm hình thái củ tỏi được đánh giá bao gồm: số lượng tép, kích thước đường kính củ và đường kính vùng rễ (Hồ Huy Cường, 2009; Wang et al., 2014; Kumar, 2015). 10 đoạn mồi ISSR đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tỏi Lý Sơn (Bảng 1). Bảng 1. Trình tự mồi ISSR Tên đoạn mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA UBC818 CACACACACACACACAG UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG UBC828 TGTGTGTGTGTGTGTGA UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG UBC846 CACACACACACACACART UBC 848 CACACACACACACACARG Tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo phương pháp CTAB có cải tiến từ các mẫu lá tỏi (Doyle and Doyle, 1990). DNA được tách chiết từ các cá thể tỏi riêng lẻ của mỗi hộ nông dân. Sau đó, mẫu DNA đại điện cho mỗi hộ được tạo thành khi trộn 10 µL dịch DNA được tách chiết của các cá thể riêng lẻ thuộc hộ đó theo phương pháp BSA (Bulked segregant analysis) (Michelmore et al., 1991). Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích mỗi phản ứng là 20µL, bao gồm Master mix PCR 1X (Phu Sa Biochem); 200nM mồi ISSR; 0,125 đơn vị Taq polymerase và 40ng DNA tổng số. Quá trình nhân bản được tiến hành trên máy ESCO Aeris - BG096 theo chu trình nhiệt sau: 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ lặp lại với 94°C trong 30 giây, 38°C trong 30 giây và 72°C trong 30 giây; tiếp theo 72°C trong 10 phút; cuối cùng giữ sản phẩm ở 4°C. Sản phẩm PCR được nhuộm bằng RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution và điện di trên1,0% agarose gel trong dung dịch đệm TAE. Số liệu nghiên cứu hình thái củ tỏi được xử lý bằng phần mềm IBM Statistics SPSS22. Tukeytest được sử dụng để so sánh giá trị trung bình với độ tin cậy 95%. Các giá 178 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM trị trung bình được xem là khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p≤0,05 (Hoàng Trọng và Chu Nguyễn Mộng Ngọc, 2008). Phần mềm Popgene ver 1.31 được sử dụng để phân tích các chỉ số của chỉ thị ISSR (Yeh et al., 1999). Cây di truyền được xây dựng bằng phần mềm NTSYS_PC version 2.1 với hệ số là NEI72. Phương pháp clustering SAHN để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu tỏi (Rohlf, 1998). Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính trên phần mềm PIC Calculator theo công thức (Roldan-Ruiz et al., 2000). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái của mẫu tỏi Kết quả phân tích hình thái đặc trưng củ tỏi thu từ 8 hộ nông dân cho thấy, tỏi Lý Sơn có vỏ tép màu trắng; số tép dao động từ 15-23, đường kính rễ từ 1-2 cm (Bảng 2, Hình 1). Trong khi đó, đường kính củ của 8 hộ lại có sự khác biệt và được chia làm 3 nhóm. Nhóm 1 chỉ có hộ T1 với đường kính củ dao động từ 3,0-3,2 cm. Nhóm 2 gồm: hộ T2, T3 và T4 với đường kính củ dao động 2,7-3,1 cm. Nhóm 3 gồm các hộ: T5, T6, T7 và T8 có đường kính củ dao động 2,6-3,0 cm. Sự khác biệt này có thể do điều kiện trồng tỏi khác nhau giữa các hộ. Hình 1. Đặc điểm hình thái của tỏi thu thập từ các hộ ở Lý Sơn. T1. Hộ bà Đại; T2. Hộ bà Thạnh; T3. Hộ ông Quý; T4. Hộ ông Quang; T5. Hộ bà Hạnh; T6. Hộ bà Hòa; T7. Hộ ông Phúc và T8. Hộ bà Hương. PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 179 Bảng 2. Kết quả so sánh hình thái tỏi của các hộ ở Lý Sơn STT Hộ Địa điểm Màu vỏ tép Số tép Đường kính củ Đường kính rễ 1 T1 An Hải Trắng 20,6±3,56a 3,09±0,18a 1,16±0,07a 2 T2 An Vĩnh Trắng 19,4±3,94a 2,92±0,22ab 1,14±0,07a 3 T3 An Vĩnh Trắng 20,5±4,76a 2,88±0,25ab 1,14±0,09a 4 T4 An Hải Trắng 21,0±3,09a 2,91±0,19ab 1,08±0,1a 5 T5 An Hải Trắng 19,5±3,06a 2,81±0,18b 1,09±0,07a 6 T6 An Hải Trắng 18,5±3,10a 2,81±0,16b 1,08±0,06a 7 T7 An Vĩnh Trắng 19,6±3,77a 2,72±0,16b 1,1±0,07a 8 T8 An Vĩnh Trắng 19,9±4,20a 2,8±0,21b 1,13±0,04a 3.2. Đa dạng alen của các chỉ thị ISSR 10 đoạn mồi ISSR đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tỏi Lý Sơn. Trong đó, 3 mồi tạo ra các vạch đa hình rõ ràng và ổn định phù hợp cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền giống tỏi (Hình 2). Tổng cộng 15 locus đa hình trong tổng số 20 locus được phát hiện trong số 8 quần thể tỏi và tỉ lệ đa hình là 75% (Bảng 3). Giá trị lớn nhất số lượng locus đa hình được khuếch đại bởi mồi UBC 808 và UBC 834 (6 băng đa hình); số lượng locus đa hình tối thiểu được khuếch đại bởi mồi UBC 810 (3 băng đa hình). Số lượng alen hiệu quả (Ne) trung bình là 1,4398, sự đa dạng di truyền trung bình của Nei là 0,2799 và chỉ số Shannon trung bình là 0,3950. Những chỉ số này cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao của tỏi Lý Sơn. Giá trị PIC trung bình cho 20 locus ISSR là 0,2971 và giá trị PIC nằm trong khoảng từ 0,2852 đến 0,2969. Các chỉ thị ISSR cho thấy khả năng đây là công cụ hiệu quả trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền trong tỏi tương tự như các đánh giá trước đây (Jabbeset al., 2011; Chen et al., 2014). Hình 2. Kết quả phân tích 8 mẫu tỏi đại diện cho các hộ với chỉ thị ISSR: UBC 808; UBC 810; UBC 834 180 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Bảng 3. Đa hình các phân đoạn DNA của 3 chỉ thị ISSR Tên Primer NPL PPL PIC Ne H I UBC808 6 75 0,2930 1,3073 0,2057 0,3288 UBC810 3 75 0,2969 1,6132 0,3365 0,4805 UBC834 6 75 0,2852 1,3989 0,2462 0,3757 Trung bình 15 75 0,2917 1,4398 0,2799 0,3950 H: Sự đa dạng di truyền của Nei; I: Chỉ số Shannon; Ne: Số lượng alen hiệu quả; NPL: số lượng locus đa hình; PIC: Chỉ số đa hình di truyền; PPL: tỉ lệ locus đa hình. 3.3. Đa dạng di truyền giống tỏi Lý Sơn Từ kết quả phân tích hình ảnh điện di sản phẩm ISSR và xử lí số liệu bằng phần mềm NTSYS_PC version 2.1, mối quan hệ di truyền giữa các mẫu tỏi được nghiên cứu theo 2 hướng: mối quan hệ giữa các giống tỏi thuộc 8 hộ nông dân; sự đồng nhất về giống của các hộ nông dân. Mối quan hệ về giống tỏi của 8 hộ. Kết quả cho thấy, nguồn giống tỏi của 8 hộ nông dân được chia làm hai nhóm chính với sự tương đồng về di truyền là 0,55 (Hình 2). Nhóm 1 gồm các hộ: T1, T4, T5 và T6; cả 4 hộ đều thuộc xã An Hải (trước đây). Trong đó, các cặp hộ T1, T6 và T4, T5 có sự đồng nhất về mặt di truyền các giống tỏi (HSDT=1). Nhóm 2 gồm các hộ: T2, T3, T7, T8; cả 4 hộ thuộc xã An Vĩnh (trước đây). Hai hộ T2 và T8 có hệ số tương đồng di truyền là 0,85 ; tiếp đến là hộ T3 với hệ số di truyền với 2 hộ trên là 0,68. Cuối cùng là hộ T7 với hệ số di truyền 0,63 so với 3 hộ còn lại của nhóm 2. Điều này cho thấy, nguồn giống tỏi Lý Sơn có sự đa dạng di truyền tương đồng với sự phân chia địa lí khu vực sinh sống của hộ dân. Các hộ thuộc xã An Hải (trước đây) có sự tương đồng về giống cao, trong khi đó, các hộ thuộc xã An Vĩnh (trước đây) có nguồn giống tỏi với mức độ đồng nhất thấp. Hình 3. Cây quan hệ di truyền tỏi thu từ 8 hộ nông dân ở Lý Sơn dựa trên hệ số tương đồng di truyền PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 181 4. KẾT LUẬN Nguồn giống tỏi tại huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi có các đặc điểm hình thái đặc trưng: vỏ tép màu trắng, số tép dao động từ 15-23, đường kính rễ dao động từ 1,1 đến 2,0 cm. Ba chỉ thị ISSR (UBC808, UBC810, UBC834) cho phép đánh giá hiệu quả sự không đồng nhất về mặt di truyền nguồn giống tỏi tại huyện đảo Lý Sơn. Lời cảm ơn: Đề tài được thực hiện với sự tài trợ của Văn phòng hợp tác giữa Hội động vật học Frankfurt và Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chen, S. X., Chen, F. X., Shen, X. Q., Yang, Y. T., Liu, Y. and Meng, H. W., 2014. Analysis of the genetic diversity of garlic (Allium sativum L.) by simple sequence repeat and inter simple sequence repeat analysis and agro-morphological traits. Biochemical Systematics and Ecology. 55: 260-267. Euphytica. 198: 243-254. Doyle, J. J. and Doyle, J. L., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12(1): 13-15. F. J. Rohlf. NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0 User Guide. Applied Biostatistics Inc., Setauket, New York. 1998, 37 pp. Fossen T. and Andersen O.M., 1996. Malonated anthocyanins of garlic Allium sativum L. Food chemistry. 58(3): 215-217. Hoàng Trọng và Chu Nguyễn Mộng Ngọc, 2008. Phân tích dữ liệu nghiên cứu với SPSS Tập 2. NXB Hồng Đức. TP. HCM, 295 trang Hồ Huy Cường, 2009. Nghiên cứu phục tráng giống tỏi ở Lý Sơn. Đề tài cấp tỉnh Quảng Ngãi. Mã số 05/2009/HĐ-ĐTKHCN. Jabbes N., Geoffriau E., Le Clerc V., Dridi B., Hannechi C., 2011. Inter simple sequence repeat fingerprints for assess genetic diversity of Tunisian garlic populations.Journal of Agricultural Sciences, Vol. 3(4): 77-85. Kim J. H., Nam S. H., Rico C. W., Kang M. Y., 2012. A comparative study on the antioxidative and anti-allergic activities of fresh and aged black garlic extracts. International Journal of Food Science andTechnology. 47(6):1176–1182. Kumar M., 2015. Morphological characterization of garlic (Allium sativum L.) germplasm. Journal of Plant Development Sciences. 7(5):473-474. Michelmore R. W., Paran I., Kesseli, R. V., 1991. Identification of markers linked to disease- resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the national academy of sciences, 88(21), 9828-9832. Roldan-Ruiz I, Dendauw J, Vanbockstaele E, Depicker A, De Loose M (2000) AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses (Lolium spp.). Mol Breed 6:125–134 Sharma R., Malik S., Kumar M., Sirohi A., 2018. Assessment of genetic diversity in garlic (Allium sativum L.) genotypes based on ISSR markers. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 7(2), 3119-3124 182 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Wang, H., Li, X., Shen, D., Oiu, Y. and Song J., 2014. Diversity evaluation of morphological and allicin garlic (Allium sativum L.) from China. Euphytica. 198: 243-254. Yeh, F. C. (1999). POPGENE (version 1.3. 1). Microsoft Window-Bases Freeware for Population Genetic Analysis. ualberta. ca/~ fyeh/ ASSESSMENT OF GENETIC DIVERSITY OF LY SON GARLIC (Allium sativum L.) BY USING ISSR MARKERS Nguyen Minh Ly*, Mai Xuan Cuong, Dinh Thi Thuy Trinh Abstract. The study was conducted to assess the genetic diversity of garlic variety (Allium sativum L.) in Ly Son district, Quang Ngai province using ISSR markers. Samples of garlic were collected from 8 farming households in An Vinh and An Hai communes. According to the results of research, Ly Son garlic has the white shell bulb, the number of cloves ranges from 15 to 23 cloves; the root diameter ranges from 1.1 to 2.0 cm. Additionally, there is a difference in the diameter of Ly Son garlic bulb cultivated in different geographical conditions. Ten ISSR primers were screened; three primers (UBC808, UBC810, UBC834) detected 15 polymorphic bands. A level of polymorphic loci (p) was found in Ly Son populations (75%). Garlic varieties in Ly Son have high genetic diversity among farming households and between different communes. Keywords: Allium sativum, garlic, genetic diversity, ISSR, Ly Son. University of Science and Education, The University of Danang *Email: nmly@ued.udn.vn