Đề tài Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4-D lên mẫu cây lá Kim Ngân ( Lonicera japonica Thunb )

Đặt vấn đề Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân (Caprifolianceae) là cây dược liệu chứa tanin và một saponin. Hoa chứa một flavonoid là scolymosid lonicerin và một số carotenoid (e. caroten, cryptoxanthin, auroxanthin). Quả mọng giàu carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin. Lá chứa một glucosid gọi là loganin và khoảng 8% tanin. Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh nhiệt giải độc. Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh cây thuốc Kim Ngân Hoa có tác dụng: kháng khuẩn, chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làm tăng tác dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh cường độ bằng 1/6 của cà phê, làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dịch vị và mật. Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch tán và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dịch hạch, thương hàn, cận thương hàn, liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả. Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩn bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng. Nước sắc lá Kim Ngân với nồng độ 201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thương hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam). Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trị ung thư trong Đông và Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp trạng, trực tràng,.. Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho cảnh đẹp, hoa thơm, mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thu nhiệt của ánh nắng mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành tre, mành nhựa và mái tôn chống nóng. Ngoài ra, nó còn hút thán khí (CO2), nhả dưỡng khí (O2) làm sạch môi trường, tạo bầu không khí trong lành.  Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng với số lượng trên 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật và là thị trường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn không chỉ là thuốc mà xu thế mỹ phẩm dùng nguyên liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đã chiếm 90% tổng số mỹ phẩm được sản xuất. Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu thông, phân phối dược liệu, nguồn dược liệu chưa tương xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bất cập. Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu, chủ yếu sản xuất những loại thuốc thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thế mạnh của Việt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT), dược liệu lưu hành trên thị trường cũng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore. Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành phẩm và nguyên liệu dược liệu của cả nước, 90% mặt hàng đông dược lưu hành trên thị trường là hàng nhập lậu. Một điều đáng lưu tâm nữa là chất lượng dược liệu hiện nay vẫn chưa được kiểm soát (trên 50% mẫu kiểm tra không đạt tiêu chuẩn chất lượng) và tỷ lệ này với các loại thuốc từ dược liệu là 10%. Ngoài ra, việc trồng dược liệu hiện nay vẫn thiếu sự quy hoạch tập trung, thiếu sự hỗ trợ căn cơ từ nhà nước khiến thị trường dược liệu không ổn định, cây dược liệu vì thế cũng không phát triển. Vẫn chưa có một cơ quan chuyên môn nào đảm trách khâu kỹ thuật sản xuất dẫn đến tình trạng các cây dược liệu không đảm bảo được năng suất – chất lượng – giá cả ổn định để cạnh tranh được với dược liệu nhập khẩu. Như vậy với giá trị to lớn của cây Kim Ngân, là cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam trong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nói riêng thì việc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy mô công nghiệp để có thể nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gian ngắn nhất đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ cho thị trường Việt Nam và trên thế giới là điều hết sức cần thiết. Mục đích và nội dung nghiên cứu Mục đích Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro. Đồng thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trị dược lý trong cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp dược. Nội dung nghiên cứu Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấy lá của cây Kim Ngân. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002). Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Về mặt lý luận sinh học cơ bản Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính của cơ thể với hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luật về mối tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra những thay đổi định hướng ở mức độ tế bào (trước khi cho ra cây hoàn chỉnh). Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đầy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến hành nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ. Từ đó, người ta tìm ra được những cơ chế miễn dịch thực vật. Khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ chế này thì các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy việc chống bệnh sẽ trở nên đỡ tốn kém hơn rất nhiều. Về mặt thực tiễn sản xuất Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy mô còn có những đóng góp hết sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống. Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt như sau: Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh. Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất. Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch. Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối. Sự đồng loạt này sẽ giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch. Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện cho khâu tiêu thụ và chế biến. Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt. Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro (Pierik, 1975, Anonymous, 1980; van Assche, 1983; Gebhard và cộng sự, 1983; Kunneman-Kooij, 1984): Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo. Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo và sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được cây sạch bệnh vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vào nuôi cấy, đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất. Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng. Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm. Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống kế tiếp. Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy. Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen. Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma. Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến… có thể được duy trì và nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vitro. Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp nhân giống in vitro có những bất lợi sau: Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy. Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện. Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số cây. Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấn công bởi một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy, cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận. Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyển mô sẹo và huyền phù tế bào được lặp lại nhiều lần. Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện. Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành của cây tăng lên. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như: Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôi cấy tế bào trần). Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp. Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn). Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn). Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại. Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp. Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử. Nuôi cấy quang tự dưỡng. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô Nguồn gốc mẫu cấy Kích thước Mẫu được tách Đỉnh sinh trưởng 0,5 – 1 mm Tế bào đỉnh sinh trưởng Chồi đỉnh 0,5 – 1 cm Chốp đỉnh có chứa một phần thân Chồi bên 0,5 – 1 cm Chồi bên có chứa một phần thân, lá và chồi nách Mẫu lá 0,2 – 0,3 cm Mẫu lá được cắt nhỏ, phân nửa được cấy chìm vào môi trường Phiến lá 0,2 – 1 cm Phiến lá non được đặt trên môi trường, mặt dưới đặt trên mặt thạch Rễ 0,5 – 1 cm Mẫu rễ được đặt trên mặt thạch Dạng củ hành 1 – 2 cm Mẫu được đặt trên mặt hay được cấy chìm phân nữa vào môi trường Hạt nảy mầm 2 – 3 mm Chồi non Hạt phấn 0,1 – 0,5 mm Hạt phấn trong túi phấn Các bước nhân giống in vitro Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau: Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng. Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy. + Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy. + Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. + Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp. + Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng. + Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bị hóa nâu hơn mô trưởng thành hay mô già. Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nó được tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu. Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hóa nâu là dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường dùng 0,5 – 5 g/l. Ngoài ra còn có một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol. Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt động mạnh ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp. Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiện tượng hóa nâu. Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượng hóa nâu của mẫu cấy nên: Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ nhất. Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môi trường. Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánh sáng trong 1 – 2 tuần đầu. Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao. Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu nuôi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hòa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm… Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao,… cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá