Đề tài Các phương pháp định lượng các cấu tử hương của dịch nước nho sau lên men

LỜI CÁM ƠN Trong học kì II năm học này, việc làm Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm đã giúp cho chúng em ngày một trưởng thành hơn trong kĩ năng làm việc độc lập và làm việc nhóm. Để hoàn thành đồ án này, em đã được sự giúp đỡ và hướng dẫn của nhiều thầy cô trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm và bạn bè. Em xin chân thành cám ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho em trong thời gian làm Đồ án môn học này. Do thời gian và khả năng có hạn nên đồ án này còn nhiều sai sót, mong quý thầy cô và bạn bè chỉ bảo và góp ý thêm để em có thể ngày càng hoàn thiện được những mảng kiến thức về Công nghệ Thực phẩm. LỜI MỞ ĐẦU Rượu vang là một trong những sản phẩm lên men có lịch sử lâu đời nhất. Nó được ưa thích tại nhiều nơi trên thế giới bởi hương vị hết sức đặc trưng, đem lại cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho người sử dụng. Hương vị được xem là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định đến đặc điểm và chất lượng rượu vang. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học thì hương vị của rượu vang là sự tổng hợp của hơn 800 hợp chất dễ bay hơi thuộc các nhóm như: rượu, esterr, acid hữu cơ, phenol, thiol, monoterpen và nor-isoprenoid. Chúng được tạo thành từ quá trình trao đổi chất của nấm men và phản ứng giữa các hợp chất hóa học trong quá trình tàng trữ rượu vang. Các cấu tử hương trong dịch nước nho sau lên men sẽ góp phần quyết định đến hương vị rượu vang thành phẩm. Tùy loại rượu vang sản xuất mà thành phần của các cấu tử hương của dịch nước nho lên men sẽ khác nhau. Vì vậy, việc định lượng các cấu tử hương là vô cùng quan trọng để xác định chất lượng và điều chỉnh thành phần cấu tử hương theo mong muốn, và những phương pháp định lượng cũng góp phần không nhỏ vào việc nghiên cứu của các đề tài liên quan đến nước nho sau này. Nhiệm vụ chính của đồ án “Các phương pháp định lượng các cấu tử hương của dịch nước nho sau lên men” là tìm hiểu về các phương pháp tách chiết cũng như định lượng các cấu tử hương có hàm lượng khác nhau trong dịch nho sau lên men. TỔNG QUAN VỀ DỊCH NHO LÊN MEN VÀ CÁC CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO SAU LÊN MEN TỔNG QUAN VỀ DỊCH NHO SAU LÊN MEN Nho Lên men nước nho là một phần trong quy trình sản xuất rượu vang. Trong số các loại quả, nho là nguyên liệu lý tưởng nhất để sản xuất rượu vang. Nho ưa đất ít chua và khí hậu khô, nhiều nắng. Vùng đất Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận là những vùng nho mới và đang phát triển. [3] Với rượu vang, nho là nguyên liệu thích hợp nhất vì [3]: Từ nho cho rượu vang chất lượng tốt nhất, hương vị êm dịu, hài hòa Thàng phần dịch quả nho rất thích hợp cho lên men và thành phần rượu thành phẩm nhiều chất dinh dưỡng. Bảng 1.1: Thành phần của dịch nho thông thường [71] Hợp chất % trong dịch nho Nước 75,0 Đường (fructose, glucose và một ít saccharose) 22,0 Alcohols (ethanol và hàm lượng vết của terpenes, glycerols và rượu bậc cao) 0,1 Acid hữu cơ (tartaric, malic và một ít lactic, succinic, oxalic,…) 0,9 Khoáng (potassium, calcium và một ít sodium, magnesium, iron,…) 0,5 Phenols (các flavonoid như là các chất màu cùng với các nonflavonoid như là cinnamic acid và vanillin) 0,3 Các hợp chất chứa nitơ (protein, amino acid, humin, amide, ammonia,…) 0,2 Các hợp chất hương (các esterr như là ethyl caproate, ethyl butyrate,…) Vết TỔNG 100,0 Phân loại Nho thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Vitales, họ Vitaceae, chi Vitis. Trong đó, theo nghiên cứu và thực tế sản xuất, loài Vitis vnifera được cho là thích hợp nhất để sản xuất rượu vang vì: nó chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao cho sự phát triển của nấm men, chứa hàm lượng acid đủ cao để ức chế các vi sinh vật dại, hàm lượng đường thích hợp cho lên men, và cuối cùng là có thể tạo hương vị phù hợp [75,76] Nho có hai loại: nho đỏ để sản xuất rượu vang đỏ và nho xanh để sản xuất rượu vang trắng.[1,3] Nho trắng: trái nho khi chín vỏ không có màu hoặc màu vàng lục nhạt. Nho đỏ: trái nho khi chín vỏ có màu đỏ – tím ở những mức độ khác nhau a) b) Hình 1.1: Nho xanh (a) và nho đỏ (b) Thành phần hóa học của nho Đường Thông thường dịch nho để sản xuất rượu vang chứa 16 – 26% (w/v) đường. Trong nho khô và trong nho thu hoạch trễ, hàm lượng đường có thể lên tới trên 30% (w/v). Dịch nho cô đặc với hàm lượng đường 35oBx được sử dụng để sản xuất rượu vang có hàm lượng cồn cao. Hàm lượng đường cao có thể ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men [40]. Dịch nho trước khi lên men thường chứa tỷ lệ cân bằng của glucose và fructose. Trong suốt quá trình lên men, tất cả các chủng Saccharomyces cerevisiae đều ưu tiên sử dụng glucose hơn là fructose. Hàm lượng ethanol cao có tác động ức chế mạnh sự sử dụng fructose hơn là glucose. Trong khi đó, bổ sung nitơ vào dịch nho sẽ kích thích sự sử dụng fructose hơn là glucose [9,15,61]. Nitơ Các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm men. Trong số các chất dinh dưỡng mà nấm men có thể sử dụng được trong suốt quá trình lên men dịch nho, về số lượng, nitơ là thành phần quan trọng thứ hai sau các hợp chất carbon. Có nhiều hợp chất chứa nitơ có mặt trong dịch nho, với hàm lượng thay đổi từ 60 – 2400mg/L [27]. Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để phát triển, nhưng không phải tất cả các nguồn nitơ đều hỗ trợ phát triển tốt như nhau. Các nguồn nitơ tốt là ammonium, glutamine và asparagine, trong khi đó proline và urea được xem như là những nguồn nitơ kém chất lượng [27]. Tất cả các hợp chất chứa nitơ tích lũy trong dịch nho bị biến đổi thành một trong hai sản phẩm cuối là ammonium hoặc glutamat. Glutamat cùng với glutamine đóng một vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ của nấm men. Từ 2 amino acid này tất cả các hợp chất chứa nitơ trong tế bào được tạo ra [27]. Acid hữu cơ Trong nho và rượu vang, 6 acid chiếm thành phần chính là acid tartaric, acid malic, acid citric, acid lactic, acid succinic và acid acetic. Trong đó, acid acetic là hợp chất dễ bay hơi còn các acid khác là acid không bay hơi. Độ phân ly của các acid này giảm theo thứ tự sau: acid citric, acid tartaric, acid malic, acid succinic, acid lactic, và acid acetic. Bảng 1.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịch nho đỏ và rượu vang đỏ [62] Acid hữu cơ Dịch nho đỏ Rượu vang đỏ Acid citric Acid tartaric Acid malic Acid succinic Acid lactic Acid acetic 0,25 – 0,35g/L 4,07 – 7,65g/L 1,99 – 2,91g/L Rất ít Rất ít Rất ít 0,17 – 0,40g/L 2,60` – 5,7g/L 0,06 – 3,13g/L 0,48 – 1,22g/L 0,07 – 4,89g/L 0,30 – 1,44g/L SO2 Sulfur dioxide được sử dụng rộng rãi trong rượu vang như là một chất chống oxy hóa, tác nhân kháng khuẩn và đồng thời cũng là tác nhân cho việc chọn lọc các loài hoặc chủng có thể phát triển và đóng góp vào quá trình lên men. Trong rượu vang, SO2 tồn tại ở 2 dạng: tự do và liên kết. Nhưng chỉ SO2 tự do mới có tính khử và diệt khuẩn. Mặc dù vậy, một vài dạng SO2 liên kết có thể chuyển hóa thành SO2 tự do và có thể bù lại cho lượng SO2 bị giảm trong quá trình lên men. Vì thế, SO2 là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến động học quá trình lên men và chất lượng rượu vang [14,24]. Bên cạnh đó, SO2 còn có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men rượu vang: dẫn tới kéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn cao, và ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [6,24]. Tannin Trong các thập kỷ qua, thành phần polyphenolic được quan tâm do nó ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của rượu vang (màu sắc và mùi vị) và các giá trị dinh dưỡng khác (theo quan điểm về y học, tannin được xem là chất chống oxi hóa, chống khối u và bệnh mạch vành). Tannin có ở 2 dạng là tannin ngưng tụ và tannin thủy phân [75]: Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acid ellagic. Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin và gallocatechin) và flavan-3,4-diol. Tannin có ở trong nho và rượu vang chủ yếu là các tannin ngưng tụ [75]. Tannin có thể được thêm vào rượu vang dưới dạng acid tannic để phản ứng và kết tủa với protein và để cải thiện độ trong của rượu vang. Trong suốt quá trình ủ, sự thay đổi hàm lượng tannin ngưng tụ sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và tính chất cảm quan của rượu vang, và khi đó, khối lượng phân tử của tannin có thể tăng lên [75]. Nấm men sử dụng để lên men dịch nho Nấm men là vi sinh vật quan trọng, kiểm soát quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang. Nấm men trong quá trình lên men rượu vang có thể có từ 3 nguồn gốc khác nhau: bề mặt trái nho, bề mặt thiết bị và từ canh trường được cấy vào. Thành phần và chất lượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến nấm men. Trong quá trình lên men, bên cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO2, nấm men tạo thành nhiều sản phẩm phụ, ví dụ như glycerol, acid acetic, acid succinic và đặc biệt là các hợp chất hương, góp phần đáng kể vào chất lượng của rượu vang.[3,58,59] Các nấm men thường gặp Giống nấm men thường sử dụng nhất trong sản xuất vang là saccharomyces. Chúng có bào tử trong nang thường là 1-4 bào tử, có khi lên đến 8. Tế bào của chúng có hình dáng khác nhau như tròn, oval, elip. Chúng sinh sản bằng cách nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men, không sử dụng được muối nitrat. Giống saccharomyces có tới 18 loài , nhưng chỉ có 7 loài thường gặp trong nước quả.[3] Một số nấm men thường gặp nhất trong sản xuất rượu vang [3,27]: Saccharomyces cerevisiae: Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả và chiếm tới 80% trong tổng số saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hay dạng bông. Nguồn dinh dưỡng carbon của chủng này là đường, cồn, và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, thiamin, và piridoxin. Đa số các tế bào của chủng này hình oval, kích thước (3-8)x (5-12) m, sinh sản theo cách nảy chồi và tạo thành bào tử. S.cerevisiae sinh ra enzym invertase có khả năng chuyển đường saccharose thành glucose và fructose, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dịch quả. Hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của nấm men này chỉ đạt 8-10% thể tích Ngoài S.cerevisiae, đôi khi người ta còn sử dụng các chủng nấm men khác như S.uvarum, S. chevalieri, S. oviformis, Henseniaspora apiculate … Các tiêu chuẩn lựa chọn nấm men [3,27] Có lực lên men cao đối với nước quả, sử dụng đường cho lên men gần như là hoàn toàn, kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh, chịu được độ rượu cao và độ acid của môi trường, cũng như các chất sát trùng, chịu áp suất thẩm thấu tốt, sinh khối tạo thành vừa phải, tạo cho rượu vị thơm ngon thanh khiết. Tạo thành ít sulphite, thiol, ít acid dễ bay hơi và rượu bậc cao, hoạt tính esterrase thấp Có tính ổn định cao về mặt di truyền, khả năng chịu sulphite cao, ít liên kết với sulphite, ít tạo bọt, có khả năng kết bông, kết lắng cặn nhanh, nhu cầu nitơ thấp Các sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men dịch nho Sản phẩm tạo thành do quá trình trao đổi chất của nấm men Đây là những chất do nấm men tạo ra trong quá trình sống và được giải phóng vào môi trường. Một số chất này là sản phẩm trao đổi chất của nấm men rất đáng được quan tâm đối với rượu vang, đặc biệt chúng tạo ra hương đượm và vị dịu êm của vang. [3,6] Trong lên men có hai sản phẩm chính tạo thành là ethanol và CO2. Ngoài ra còn có các sản phẩm phụ là các chất thứ cấp hay là các sản phẩm bậc 2. Các sản phẩm được tạo thành từ protein hay acid amin với các chất phân giải trung gian của đường tạo thành các loại rượu bậc cao. Ngoài ra còn có glycerin, acid succinic, acetaldehyde, acid acetic, aicid propionic, acid lactic, acid citric, acetoin, diacethyl, ester.[3,6] Glycerin: tạo thành trong lên men khi acetaldehyde liên kết với Natri bisulphite. Nó tạo thành mạnh mẽ khi bắt đầu lên men. Nhờ có vị ngọt và sánh như dầu, glycerin đóng vai trò nhất định trong việc tạo vị hài hòa cho rượu vang. Bình thường, hàm lượng của nó trong dịch nho sau lên men khoảng 7-14g/L. Aceton và diacethyl: đều ảnh hưởng đến chất lượng vang, mặc dù số lượng của chúng được tạo ratrong vang không lớn lắm. Acetoin 2-84 mg/L, diacethyl 0,1-1,8 mg/L. Diacethyl ở nồng độ thấp tạo cho vang có mùi xác định, nhưng lớn hơn 1 mg/L sẽ tạo cho vang mùi vị chua oxy hóa. Những loại champagne và vang khô tốt thường diacethyl chỉ ở dạng vết. Việc tạo thành acetoin có liên quan đến quá trình sulphite hóa dịch quả: dịch quả không sulphite hóa cho hàm lượng acetoin cao gấp hai lần dịch quả đã sulphite hóa. Việc tạo thành hai chất này phụ thuộc vào nồng độ đường ban đầu: nồng độ càng cao càng tích tụ nhiều diacethyl. Aldehyde: hay gặp nhất là acetaldehyde, aldehyde propionic, butyric, valeric, enantic.. Các aldehyde này có mùi rất gắt. Khi pha loãng, trừ acetaldehyde, các alhehyde khác có mùi dễ chịu của tông mùi quả tự nhiên. Acetaldehyde thường tích tụ trong vang với lượng khá nhỏ. Các acid: các acid bay hơi thường gặp là acid acetic, propionic, isobutyric, butyric, isovaleric, caproic, caprilic, valeric. Các loại acid dễ bay hơi được tích tụ chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình lên men. Acid acetic được tạo thành nhanh chóng giai đoạn đầu, sau đó giảm rõ rệt trong giai đoạn cuối là do một số nấm men có thể dùng acid acetic làm cơ chất dinh dưỡng. Ngoài ra, trong vang còn có các acid khác như: acid lactic, citric, malic, cetoacid. Các ester: được tạo thành trong quá trình lên men và đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành hương vị của vang. Các ester tạo thành rất phức tạp và khác nhau khi sử dụng các giống và loài nấm men khác nhau. Trong các ester, ethyl acetat vượt trội nhất về hàm lượng, nó có mùi quả tự nhiên, và đây là một trong những cấu tử tạo hương quan trọng nhất. Ngưỡng cảm nhận của nó là 180-200 mg/L, nếu thấp hay cao hơn mức này đều ảnh hưởng trực tiếp tới vị của vang, cao hơn sẽ cho vị gắt, khó chịu. Các ester thuộc cả 2 nhóm có độ sôi cao và thấp. Điều kiện lên men chỉ ảnh hưởng tới số lượng ester. Lên men ở điều kiện kị khí sẽ tạo thành ester nhiều gấp 6 lần so với hiếu khí và 4 lần so với lên men dừ thừa CO2. Lên men ở điều kiện kị khí hay hiếu khí sẽ dẫn đến việc thay đổi nồng độ của các ester có độ sôi cao và làm tăng nồng độ các ester có độ sôi thấp. Lipid: lipid có trong vang có thể từ 2 nguồn là quả và chủng loài nấm men. Trên bề mặt nho thường phủ một lớp sáp và chất sáp này sẽ rơi vào dịch quả. Các acid béo thường gặp trong vang là acid oleic, linoleic, stearic và palmitic Rượu bậc cao: được tạo thành từ quá trình khử amin hoặc chuyển amin của các acid amin, tiếp nữa là khử carbonyl của các cetoacid và khử các aldyhyde trong quá trình lên men rượu. Trong vang, ta thấy có các rượu sau: methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol, 2-methyl butanol, 3-methyl butanol, n-heanol, triptofol, phenyl ethylic. Hàm lượng các rượu này phụ thuộc vào điều kiện lên men dịch nho. Trong điều kiện dư oxi không khí thì sẽ tạo thành các rượu bậc cao có hàm lượng lớn hơn điều kiện kị khí. Một số rượu mạch vòng như triptofol, phenyl ethylic góp phần tạo hương vị êm dịu cho vang. Sulfuhydryl (-SH): làm thay đổi thế oxi hóa-khử của môi trường. Đây là các hợp chất có tính khử cao, nó sẽ giúp bảo vệ các cấu tử hương khỏi bị tác dụng của các chất oxi hóa. Các sản phẩm tạo thành từ quá trình tự phân của nấm men Tự phân là sự phân hủy các cấu tử tế bào dưới tác dụng của các enzym thủy phân của chính bản thân tế bào. Trong quá trình tự phân này, protein, hydrocarbon, nucleotide, lipid và các vật chất tế bào khác sẽ bị phân hủy. Sản phẩm sẽ hòa tan vào môi trường. Điều kiện để có sự tự phân là tế bào đã chết và vẫn còn giữ được hoạt tính của các enzym nội bào. [3] Nhiều nhà khoa học đã khẳng định, quá trình tàng trữ dịch nho sau lên men hoặc bổ sung các sản phẩm tự phân của nấm men sẽ làm tăng chất lượng hương vị của dịch nho sau lên men (cũng như vang). Các sản phẩm dạng này thường là các hợp chất chứa Nitơ và đặc biệt là các vitamin nhóm B, đặc biệt là acid pantotenic-vitamin B3 và acid nicotinic- vitamin B5 (là những chất có hoạt tính sinh học cao, một lượng nhỏ cũng ảnh hưởng đến các quá trình hóa sinh làm cho dịch nho sau lên men “chín” và hình thành hương vị cho sản phẩm).[3] 1.2 CÁC CẤU TỬ HƯƠNG TRONG DỊCH NHO SAU LÊN MEN 1.2.1 Phân loại Tìm hiểu về bản chất hóa học của các cấu tử hương của dịch nho sau lên men cũng như rượu vang, người ta thường quan tâm đến việc định tính và định lượng chúng. Các cấu tử hương có hàm lượng thay đổi trong một khoảng rất rộng (tùy loại nho và vang) và hàm lượng rất khác nhau. Vì vậy, việc phân tích định lượng chúng cũng khá khó khăn và phải có chiến lược phân tích hợp lý.[33,41,42,60,64] Một trong các chiến lược phân tích được nhiều nhà khoa học ủng hộ là phân loại các cấu tử hương trong dịch nho sau lên men theo hàm lượng gồm 3 nhóm như sau [60]: Nhóm 1: Bao gồm các cấu tử dễ phân tích, thường là những cấu tử có hàm lượng khá cao (C>0,1 mg/L) như acetaldehyde, các rượu bậc cao, acid béo và một số ethyl ester. Các cấu tử này thường được phân tích khá đơn giản: chúng được tách khỏi hỗn hợp qua một bước tách đơn giản rồi đem chạy sắc kí khí với đầu dò FID Nhóm 2: gồm các cấu tử có khả năng phân tích trung bình. Để phân tích chúng, người ta sẽ tách riêng chúng khỏi hỗn hợp đồng thời làm giàu (tăng nồng độ) trước khi phân tích GC-MS. Các cấu tử này thường nằm trong khoảng nồng độ từ 0,1g/L đến 0,1 mg/L, gồm các cấu tử như các hợp chất phenol, lactone, dẫn xuất của vanillin, một số ester hàm lượng thấp và một số hợp chất nor-isoprenoid (như damascenone và ionone) Nhóm 3: gồm các hợp chất rất khó phân tích. Đây là những hợp chất ít nhạy với phân tích sắc kí và không bền hóa học, và thường ở nồng độ cực kì thấp, gồm các hợp chất d