Đề tài Các phương pháp định lượng protein

Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 1 Mục lục LỜI NÓI ĐẦU ............................................................................................................... 3 I. TỔNG QUAN: ....................................................................................................... 4 1. CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN: ............................................................................ 4 1.1. Cấu trúc bậc 1: ........................................................................................ 4 1.2. Cấu trúc bậc 2: ........................................................................................ 5 1.3. Cấu trúc bậc 3: ........................................................................................ 6 1.4. Cấu trúc bậc 4: ........................................................................................ 6 II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN ........................................... 7 1. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL ........................... 7 1.1. Định lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl ............................... 7 1.2. Định lượng nitơ phi Protein: .................................................................. 12 1.3. Định lượng Protein trong nguyên liệu: .................................................. 13 2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU ...................................... 13 2.1. Định lượng Protein theo phương pháp Biure. ........................................ 13 2.2. Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến): ............ 16 2.3. Định lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G - 250): .................................................................................................... 19 3. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID (BCA): ................................................................................................................... 22 3.1. Nguyên tắc: ............................................................................................ 22 3.2. Cách tiến hành: ..................................................................................... 22 3.3. Tính kết quả: .......................................................................................... 22 3.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: ............................................................ 22 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ ................................ 23 4.1. Nguyên tắc: ............................................................................................ 23 Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 2 4.2. Cách tiến hành: ..................................................................................... 23 4.3. Tính kết quả: .......................................................................................... 24 4.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: ............................................................ 24 5. PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): ........................ 25 5.1. Nguyên tắc: ............................................................................................ 25 5.2. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: ............................................................ 25 6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMONIAC ............................................................ 25 6.1. Nguyên tắc: ............................................................................................ 25 6.2. Cách tiến hành: ..................................................................................... 26 6.3. Tính kết quả: .......................................................................................... 27 6.4. Khả năng ứng dụng: .............................................................................. 27 7. PHƯƠNG PHÁP DUMAS: .................................................................................. 27 7.1. Nguyên tắc: ............................................................................................ 28 7.2. Thiết bị: ................................................................................................. 28 7.3. Cách tiến hành: ..................................................................................... 29 8. PHƯƠNG PHÁP PRM (PYROGALLOL RED MOLYBDATE): ................................ 31 8.1. Nguyên tắc: ............................................................................................ 31 8.2. Dụng cụ: ................................................................................................ 32 8.3. Tiến hành:.............................................................................................. 32 III. SO SÁNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN ................ 33 1. SO SÁNH MẪU BIA CÓ VÀ KHÔNG QUA THẨM TÍCH ......................................... 33 1. KẾT LUẬN ...................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 34 Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 3 LỜØI NÓÙI ĐẦÀU Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sinh vật, nó được cấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hợp với nhau bằng các liên kết peptid. Tỉ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này trong phân tử Protein như sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… (Sách Hóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc Tú- NXB khoa học và kĩ thuật HN, trang 94) Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng một cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chất đạm) tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein (comoniac hoặc muối amonium). Để xác định được chúng hiện nay có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác, người ta áp dụng từng phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp. Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để định lượng Protein, cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 4 I. Tổång quan: 1. Cấáu tạïo phâân tửû Protein: Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H, một số còn chứa một lượng nhỏ S. Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử protein như sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, nổi bật cấu trúc có cấu trúc và chức năng khác nhau và giữ vai trò rất quan trọng đối với tất cả các cơ thể sinh vật. Cấu trúc protein được chia thành 4 bậc: 1, 2, 3, 4 1.1. Cấáu trúùc bậäc 1: Là trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong mạch polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hoá trị) O O + H3N – CH – C + + H3N – CH – C R1 O - R2 O O O + H3N – CH – C – NH – CH – C + H2O R1 R2 O – Liên kết peptide H H H O H H H O H – HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – R1 O R2 H R3 O R4 H R5 Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 5 1.2. Cấáu trúùc bậäc 2: Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch polypeptide. Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide. Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành giữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác định. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 6 1.3. Cấáu trúùc bậäc 3: Tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở xa nhau trong mạch polypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của mạch polypeptide (hình dạng chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều protein hình cầu có chứa các gốc Cys, sự tạo thành các liên kết disunfua giữa các gốc Cys ở xa nhau trong mạch polypeptide, làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như liên kết Vandecvan,liên kết tĩnh điện, liên kết hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin … đều tham gia làm bền cấu trúc bậc 3. Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy chính trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc 3. 1.4. Cấáu trúùc bậäc 4: Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu, tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 7 polypeptide gọi là”phần dưới đơn vị ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực Vandecvan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vị”. II. Cáùc phương pháùp định lượïng protein 1. Định lượïng nitơ tổång sốá bằèng phương pháùp Kjeldahl Theo nguyên tắc Protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng số và kết quả nhân với 6.25, như thế nghĩa là coi Protein luôn chứa 16% là nitơ (vì trong phân tử Protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn định khoảng 15 – 17%). Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric….Các chất này gọi là nitơ phi Protein. Vì vậy trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó xác định nitơ Protein. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein  Nitơ protein = Nitơ tổng số – Nitơ phi protein 1.1. Định lượïng Nitơ tổång sốá theo phương pháùp Kjeldahl Nguyêân tắéc: Quá trình gồm 2 giai đoạn:  Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte) Ơû nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H2SO4 thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bị phân hủy và bị oxi hóa đến CO2 và H2O , còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) rồi kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate  Giai đoạn cất đạm: (quá trình xảy ra trong máy cất đạm) Sau khi vô cơ hóa ta đuổi NH3 ra khỏi dunh dịch bằng NaOH. (NH4)2SO4 + NaOH  Na2SO4 + NH3 + H2O Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 8 Lượng NH3 sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một erlen có chứa một lượng thừa H2SO4 đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH3 sẽ tác dụng với H2SO4 chuyển thành (NH4)2SO4 . NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 + H2SO4 dư Sau đó đi chuẩn độ lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu. NaOH + H2SO4  Na2SO4 + H2O Cáùch tiếán hàønh: Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị:  Nguyên liệu: các mẫu cần xác định hàm lượng Protein, nếu nguyên liệu khô cần được sấy khô tuyệt đối (105 o C, trong 30 phút).  Hóa chất: hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (9:1), H2SO4 đặc, H2SO4 0,01N, H3PO3 2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96 o , acid tricloacetic (TCA), thuốc thử đỏ metyl.  Thiết bị: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger. (chen hình vào) Quá trình được thực hiện qua các bước.  Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành trong tử hotte để tránh khí độc SO2, CO2). Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô đạm để thấm ước bột. Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2 – 5 ml,nếu nước quả hộp thì nên lấy 10 – 20ml. tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK2SO4/CuSO4 (hoặc selen, hay H2O2 30%, hay HCLO4 70%) và 10ml H2SO4 đặc. Để bình Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt là được. Lấy ra để nguội. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 9 Chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô đạm và định mức đến vạch định mức.  Bước 2: Cất đạm Sơ đồ máy cất đạm Rửa máy: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình và mở nước vào ống làm lạnh D, cả 3 khóa điều đóng, sau đó cho lên phiểu C một ít nước cất (khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình B rồi khóa van 2 lại. Hơi nước của bình A sẽ từ từ qua erlen E, cứ để như vậy cho đến khi ở E có khoảng 5ml nước. Ngắt điện ở bình A, hơi nước trong máy sẽ nguội lại,làm giảm áp xuất ở A và B do đó nước trong bình B sẽ rút qua G. khi nước rút hết, thêm nước vào phiễu C và mở van 2 cho nước chảy vào B, kế đó nước sẽ rút qua G. ta có thể làm như vậy vài lần. Nếu nước ở bình G đầy thì mở van 3 cho nước rút đi. Khóa van 3 và 2 lại. Cất đạm: lấy vào erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dịch H2SO4 0,01N và 3 giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dịch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ốngsinh hàn D ngập trong dung dịch H2SO4 0,01N của erlen E Hút 10ml dung dịch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiễu C. đun sôi bình A, mở van 2 để dung dịch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại. Đổ nước cất vào và tráng C, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 10 giọt cho đến khi mực nước trong C xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại. Rửa C một lần nữa với thao tác tương tự như trên. Thêm vào phiễu C 10ml NaOH đậm đặc. Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy xuống C từng giọt một. Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp tục cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B. Tráng phiễu C hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp 2 mà thôi. Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu nhọn của ống làm lạnh D bằng một tia nước của bình xịt. Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài lần như trên rồi chuẩn độ lượng H2SO4 thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,01N.  Bước 3: chuẩn độ Lượng H2SO4 còn dư trong bình E được chuẩn độ bằng NaOH 0,01N. quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ sang màu nhạt. Xác định hệ số hiệu chỉnh x: lấy 3 erlen cho vào mỗi erlen 20ml H2SO4 0,01N và vài giọt đỏ metyl. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH 0,01N lấy giá trị trung bình của 3 lần chuẩn độ Tính kếát quảû: Hệ số hiện chỉnh x sẽ được tính theo công thức sau: x là tỉ số giữa thể tích H2SO4 0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ. Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tinh toán cuả NaOH. Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinh1 theo công thức: X=  0 1 * *0,0014*100*100 10* v v x m  Trong đó: X: % khối lượng nitơ trong mẫu Vo: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 V1: số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi khi chuẩn độ H2SO4 thừa Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 11 m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa 0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N Nếu là mẫu lỏng: N/l=   41 1000 14* * *10 *o m v v x v  Trong đó: Vm là thể tích mẫu *Ghi chú: Nếu chuẩn độ trực tiếp với hệ chuẩn H2SO4 – H3BO3 Sử dụng hệ chuẩn H2SO4 – H3BO3 để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và tránh được những sai số về sự thay đổi nồng độ đương lượng của kiềm hoặc không khí. Cách tiến hành:  Nguyên liệu và hóa chất: H3BO3 2%, thuốc thử Tarshiro, H2SO4 0,01N, các hóa chất dùng cho việc vô cơ hóa mẫu và cất đạm. Cho vào bình hứng 2ml H3BO3 2%, thêm một ít nước cất sao cho dd H3BO3 ngập đầu mút của ống sinh hàn. Trong bình hứng, dd H3BO3 tự phân li: H3BO3  HBO2 + H2O Khi cất đạm NH3 bị kiềm đẩy khỏi (NH4)2SO4 theo hệ thống sinh hàn vào bình hứng, phản ứng với HBO2 : NH4OH + HBO2  NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - là một bazơ mạnh làm dd của bình hứng chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2 - được tạo thành tương đương lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2 - bằng cách độ ngược với H2SO4 0,01N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ. BO2 - + H +  HBO2 Tính kết quả: Hàm lượng N%(mg N trong 100g mẫu) sẽ được tính theo công thức sau: Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 12 *0,14 *100 (%) * t m V V N V m  Trong đó: Vt – lượng H2SO4 0,01N để chuẩn độ BO2 - (ml) V – số mol dd mẫu pha loãng (100ml). Vm – số ml dd mẫu cất đạm. m – trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (mg). 0,14 – số mg N tương đương 1ml H2SO4 0,01N. 1.2. Định lượïng nitơ phi Protein: Nguyêân tắéc: Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi Protein. Tuy nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein. Vì vậy cần dùng các chất kết tủa để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút. Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: Aceton, muối kim loại nặng, acid, thẩm tích đối nước … Nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau: TCA 10 – 20% (acidtricloacetic), Pb(CH3COO)2 10 – 15%, CuSO4 10% trong hổn hộp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1. Lọc kết tủa Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được dung dịch phi Protein. Vô cơ hóa dung dịch, cất đạm… tương tự định lượng nitơ tổng số. Cáùch tiếán hàønh: Nguyên liệu: các mẫu cần được xác định hàm lượng phi Protein Hóa chất: cồn 70 o và các chất cần cho việc định lượng Protein theo phương pháp Kjeldahl. Cân chính xác 5 – 10g mẫu nguyên liệu đã nghiền nhuyễn, cho vào cối sứ hay thủy tinh, nghiền lẫn với etanol 70 o (tỉ lệ thể tích : nguyên liệu là 1:4 nếu mẫu tươi và 1:8 nếu mẫu khô). Nghiền trong 20 phút, sau đó để ngâm khoảng 40 – 80 Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 13 phút và khuấy liên tục. Lọc tách bã hay ly tâm 5000 vòng/phút, sau đó đổ phần bã vào một becher 250ml còn phần bã lấy ra cối chiết lại bằng cồn 70 o một lần nữa theo tỉ lệ 1:4 và nhiều lần bằng nước cất vô đạm cho đến khi nước chiết không còn phản ứng với thuốc thử ninhydrin. Dồn tất cả các dịch chiết lại và đem kết tủa Protein, sau đó đem lọc trong đó cặn chứa n