Đề tài Các phương pháp xác định protein

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ******* BÁO CÁO HĨA SINH THỰC PHẨM CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN Nhóm 28 - Lớp HC04TP2 GVHD: ThS Tơn Nữ Minh Nguyệt MỤC LỤC Định tính và định lượng protein bằng những phản ứng đặc trưng 2 Cơ sở xác định phản ứng 2 Phản ứng Biure 2 Phương pháp Lowry 5 Một số phản ứng màu khác 6 Phản ứng Xiorenxen 7 Phương pháp Van-Slyke 7 Xác định protein bằng phương pháp vật lý 8 Phương pháp quang phổ 8 Tính khuếch tán 9 Xác định protein dựa vào khả năng tạo tủa của nó 10 Xác định giá trị dinh dưỡng của protein 13 Chỉ số sinh học : TD, BV, PER, NPU, NDp Cal %, NPR. 13 Chỉ số hoá học : CS. 17 Xác định nhu cầu protein trong cơ thể 18 Phương pháp Bilăng 18 Phương pháp tính từng phần 18 Định tính-định lượng Protein bằng những phản ứng đặc trưng Cơ sở xác định phản ứng Axitamin là đơn vị cấu tạo cơ sở của peptit và protein, các axitamin kết hợp với nhau qua liên kết peptit(-CO-NH-)tạo thành peptit có chiều dài mạch khác nhaugọi là polypeptit,một phân tử protein có một hay nhiều chuổi polypeptit. Như vậy thông qua liên kết peptit, các gốc axitamin , nhóm - amin tự do đầu N của chuỗi polypeptit ta có những phản ứng màu đặc trưng thường dùng để định tính và định lượng protein . Phản ứng Biurê (Phản Ứng Đặc Trưng Của Liên Kết Peptit) Nguyên tắc Trong môi trường kiềm mạnh ,liên kết peptit trong phân tử protein phản ứng với CuSO4 tạo phức chất màu tím hoặc tím đỏ ở dạng anion . Phản ứng tạo phức này có màu bền ,ổn định ,dùng để định lượng protein. è Protein (có từ 2 liên kết peptit trở lên) + Cu2+ -> tạo phức màu xanh tím.(phản ứng được coi là dương tính khi có màu tím rõ Cách tiến hành Cần chuẩn bị THUỐC THỬ : Các dung dịch protein và axitamin: Dung dịch protein trứng 0,1% Dung dịch gelatin 0,1% Dung dịch glycin 0,1% Thuốc thử Biure (pha theo Gornall) Nước cất 500ml KI 1g NaOH 10% 300ml Nước cất vừa đủ 1000ml CuSO4.5H2O 1.5g Hoà tan trong Na, K tartrat 6g Bảo quản trong lọ pyrex hay polyethylen, đậy nút kín. TIẾN HÀNH à Trong 3 ống nghiệm 1 2 3 - Dung dịch protein trứng 0,1% (giọt) - Dung dịch gelatin 0,1% (giọt) - Dung dịch glycin 0,1% (giọt) - Thuốc thử biure (giọt) 10 10 10 10 10 10 è Lắc đều, phản ứng được coi là dương tính khi có màu tím rõ rệt. Chú ý: Chỉ các chất có từ 2 liên kết peptid trở lên mới cho phản ứng này(axitamin và dipeptit không có phản ứng Biure). Phức hợp màu có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540nm và độ đậm màu (mật độ quang ) tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Độ nhạy của phản ứng tăng khi thêm vào thuốc thử Folin-Ciocalteau.Hiện nay , người ta đã cải tiến phản ứng Biurê thành phản ứng Micrôbiure để làm tăng độ nhạy của phản ứng lên hàng chục lần. Bằng phương pháp này ta có thể định lượng protein tổng số , albumin , globulin , fibrinogen trong huyết thanh. Phản ứng tạo phức màu : Phản ứng với thuốc thử Folin -Ciacalteau(phương pháp Lowry)-phản ứng đặc trưng của một hay một số gốc axitamin Nguyên tắc Tính hàm lượng protein nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của protein và phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin-Ciocalteau.Cường độ màu dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein. Thuốc thử : Dung dịch protein chuẩn có 10 –100 mg protein có trong 1ml. Protein được hoà tan trong dung dịch NaCl 0,9% với lượng protein trong 1ml có 10 , 20 , 30 , 40 , 80 , 100 mg protein . Dung dịch chuẩn thường dùng tinh thể albumin huyết thanh bò . Dung dịch A : dung dich Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N Dung dịch B1 : dung dịch CuSO4 1% Dung dịnch B2 : dung dịch muối Seignett 2% ( Kali tactarat ) Dung dịch B1 0,5 ml Dung dịch B2 0,5 ml Dung dịch A 50 ml Dung dịch C Dung dịch D :dung dịch Folin 0,1 N. Nước cất 700ml NaWO4 . 2H2O 100g NaMoO4 . 2H2O 25g Acid H3PO4 85% 50ml HCl đậm đặc 100ml Li2SO4 . H2O 150g 5 giọt Brom Dung dịch D Cách tiến hành Lấy 1ml dung dịch protein nghiên cứu cho vào ống nghiệm , thêm 5 ml dung dịch C .Lắc đều , để ở nhiệt độ phòng 10 phút . Tiếp tục cho thêm 0,5 ml dung dịch D , lắc đều ,ø để ở 30 phút và đo trên máy so màu ở bước sóng 750 nm. Chú ý Giai đoạn đầu thực hiện phản ứng Biure, sau đó thêm Folin-Ciocalteau tạo thành phức xanh. Thuốc thử Folin-Ciocalteau chủ yếu gồm:Natri molypđat (NaMoO4), Natri wonframat (NaWO4) , Liti sunfat (LiSO4) Tác dụng của thuốc thử :tăng độ nhạy của phản ứng Biurê ,phản ứng với gốc Tyrosin và Trytophan trong phân tử prôtêin tạo phức chất màu xanh da trời hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm. Đối với mỗi loại prôtein , cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein .Còn đối với các protein với nhau, cường độ màu phụ thuộc vào loại protein(VD:cùng 1 nồng độ ,cường độ màu của tripxin, hemoglobin,gelatin theo thứ tự giảm dần),do đó để kết quả chính xác protein phải qua tinh sạch ít nhiều. Một số chất tăng cường độ màu: phenol, purin, pirimidin, axit uric, nhóm-SH,1 số ion kim loại…Lí do :chúng sẽ cùng phản ứng với Folin-Ciocalteau. Một số chất làm giảm cường độ màu:etanol, ete có nồng độ cao hơn 5%, axeton, Ba(OH)2 có nồng độ cao hơn 1%, Cl3COOH, HClO4 trung hoà. è Ưu điểm của phương pháp này: độ nhạy cao, phát hiện được protein trong dung dich ở nồng 1g/cm3 Một số phản ứng màu khác Phản ứng với axit piric: Đun dung dịch protein với axit piric và Na2CO3 sẽ có màu cam đỏ, phản ứng đặc trưng cho prôtein nào có vòng dixentopiperazin Phản ứng Xantoprotein: Axit nitric đậm đặc tác dụng với protein sẽ có màu vàng (do trong protein có axit amin có vòng thơm : fenylalanin , tyrozin , typtofan) Phản ứng Millon: Đặc trưng cho sự cò mặt của tyrosin, thuốc thử Millon(Hg-NO3+HNO3) cho muối thuỷ ngân có màu đỏ Phản ứng Paulli: Thuốc thử diazo trong dung dịch kiềm của prôtein có màu đỏ da cam , phản ứng đặc trưng của tyrosin , histidin có trong protein Phản ứng Adamkevic: Cho axit axetic đậm đặc vào dung dịch protein , sau đó cho thêm từng giọt H2SO4 đậm đặc theo thanh ống nghiệm thì ở giới hạn 2 chất lỏng sẽ có màu tím đỏ, phản ứng đặc trưng cho tryptopan có trong protein. Phản ứng Sacaguichi: Dung dịch protein tác dụng với hyporo-bromit Na vàøa-naptol thì dung dịch có màu đỏ anh đào,phản ứng này đặc trưng cho sự có mặt của arginin trong phân tử protein. Phản ứng của nhóm amin với fomaldehit (Phản ứng Xiorenxen ) à đánh giá mức độ thuỷ phân của protein. Phản ứng để nhận biết: fomaldehit phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất mêtilen của axitamin theo phản ứng sau: R CH COOH + HC = O R CH COOH + H2O NH2 H N = CH2 à nhóm amin đã bị khoá nên có thể chuẩn độ axitamin bằng kiềm, từ đó tính được số nhóm amin. Phương pháp Van-Slyke Căn cứ vào lượng Nitơ thoát ra ,có thể định lượng axitamin và protein trong dung dịch R CH COOH + HNO2 R - CH - COOH + N2 + H2O OH OH Các phương pháp xác định protein dựa vào tính chất vật lý Phương pháp quang phổ Nguyên tắc Dựa vào tính chất quang học của protein:protein có khả năng hấp thu tia cực tím . Quang phổ thu được phụ thuộc vào các axitamin có vòng như phenylalanin , tyrozin , trytophan trong phân tử protein. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo .Nếu protein không tinh sạch thì nồng độ protein tổng được tính 1 cách tương đối. Cách tiến hành Li tâm mẫu loại các phân tử hoặc phức hợp khác trong thể huyền phù. Đặt bước sóng 280nm ở máy quang phổ và điều chỉnh độ hấp thụ về 0 với cuvet chứa đệm. Tính tỉ số hấp thu 206 -280nm è tỉ số < 0.6 : protein sạch không lẫn axit nucleic. Nồng độ mẫu = Độ hấp thu ở 280nm . 10 mg/l Hệ số tắt ở 280nm HAY Nồng độ mẫu = 1,55 . ( độ hấp thụ ở 280nm ) - 0,77 . (độ hấp thụ ở 260nm ) Chú ý : Không dùng với những chất có nồng độ protein thấp (<0,05g/ml-0,1g/ml) , hoặc khi có mặt những chất khác hấp thụ cùng 1 vùng cực tím (VD: axit nucleic hay một số chất béo ) hoặc khi protein ở dạng huyền phù chứ không phải trong dung dịch ø(VD : trong màng hay trong những phức hợp có KLPT lớn). Sự hấp thụ tia cực tím: protein hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 240-280nm. Axitamin nhân thơm : trytophan , tyrozin, phenylanilin có phổ hấp thu ở 280nm. Đồng thời chúng cũng hấp thụ bước sóng thấp hơn 215-230nm–độ hấp thụ này phù hợp cho peptit không có trytophan, tyrozin. So với phương pháp so màu phương pháp này đơn giản, nhạy, mẫu dùng lại thường ổn định hoá phần lớn protein. Tính khúc xạ ánh sáng Dung dịch protein có tính chất khúc xạ ánh sáng. Chỉ số khúc xạ còn gọi là chiết xuất phụ thuộc nồng độ protein trong dung dịch ( chiết xuất của protein lớn hơn chiết xuất của nước). Hiệu số giữa chiết xuất của dung dịch protein 1% trong nước và chiết xuất của nước gọi là sự tăng chiết xuất riêng .Ta có thể ứng dụng sự đo mức tăng chiết xuất riêng của dung dịch protein để xác định hàm lượng protein è Lưu ý : các protein khác nhau có độ tăng chiết suất khác nhau. Xác Định Protein Dựa Vào Khả Năng Tạo Tủa Protein có thể hoà tan trong nước tạo dung dịch keo là do : Trong dung dịch các tiểu phân protein cùng loại tích điện cùng dấu Xung quanh tiểu phân protein có lớp áo nước ( phân tử lưỡng cực liên kết với các nhóm phân cực như - OH , - COOH , -NH2 , = NH … ) Protein sẽ kết tủa rõ ràng nếu đồng thời làm mất 2 yếu tố hoà tan Làm mất điện tích của protein hoà tan bằng cách : Đưa PH của dung dịch protein về PI của protein đó ,khi đó đa số protein ở dạng lưỡng cực , không mang điện tích . Thêm các chất NaCl ,( NH4)2 SO4 , … các ion này sẽ trung hoà điện tích của tiểu phần protein . Ở phần này ta sẽ xem xét cách tạo tủa protein bằng phương pháp dùng muối ( còn gọi là phương pháp diêm tích ) : Giải thích về phương pháp này : Diêm tích là phương pháp dùng muối trung tính như : NaCl , (NH4)2SO4 …để kết tủa protein . Nguyên nhân kết tủa : Các tiểu phân tử protein trung hoà diện tích . Các protein khác nhau sẽ tủa ở nồng độ muối khác nhau ( vì vậy ta có thể tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp và tiến hành định tính , định lượng chúng) è Phương pháp này không làm protein bị biến tính - nghĩa là các tính chất hoá lý ,sinh vật học không bị thay đổi ; do đó thường dùng để chiết xuất protein hoạt tính è Aùp dụng phương pháp này vào việc phân đoạn albumin và globulin của lòng trắng trứng . Nguyên tắc : Ở dung dịch có nồng độ (NH4)2SO4 nửa bão hoà các tiểu phân globulin bị trung hoà điện tích và bị kết tủa . Ở dung dịch có nồng độ (NH4)2SO4 bão hoà các tiểu phân albumin bị trung hoà điện tích và bị kết tủa . Thuốc thử : Dung dịch protein 1%. Dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà. Bột amoni sulfat (NH4)2SO4 ( bột mịn ) Tiến hành : Cho 2ml dung dịch amonisulfat bão hoà vào ống nghiệm đựng 2ml dung dịch long trắng trứng để được dung dịch (NH4)2SO4 nửa bão hoà è globulin bị trung hoà điện tích và bị kết tủa . Lọc bỏ tủa globulin , trong dung dịch còn lại albumin. Thêm một ít bột amonisulfat cho đến bão hoà ( còn dư một ít lượng amoni sulfat không tan ) è tủa albumin sẽ nổi lên trên . Tiếp tục thêm nước cất vào ống nghiệm để làm mất nồng độ bão hoà của amonisulfat è tủa albumin sẽ tan trở lại ,dùng dung dịch hoà tan ở trên làm phản ứng Biure . Trong ống nghiệm cho : 10 giọt dung dịch hoà tan 10 giọt thuốc thử Biure. Lắc đều và quan sát màu của ống thử. Làm mất lớp áo nước bằng cách : Gây biến tính protein , cấu trúc protein sẽ bị đảo lộn bằng cách đun sôi , thêm muối của ion kim loại nặng , thêm axit ( axit tricloaxetic 10% Cl3CCOOH, axit sulfosalisilic C6H5OHCOOHSO3H ) , kiềm mạnh ,các tác nhân lý học .. Thêm các chất hút nước như ancol ethylic , ( NH4) 2 SO4 , tanin … Ở phần này ta sẽ xem xét cách tạo tủa protein bằng acid hữu cơ : Nguyên tắc : Phản ứng kết tủa protein bằng acid hữu cơ xảy ra không thuận nghịch . Thường dùng : Acid tricloacetid Cl3COOH làm tủa protein nhưng không tủa peptid và acidamin (người ta đã sử dụng tính chất này để loại bo ûprotein ra khỏi huyết thanh trong việc định lượng các chất không phải là protein có trong huyết thanh ). Acid sulfosalislic C6H3OHCOOHSO3H à phát hiện protein trong nước tiểu và trong các dịch sinh vật. Cách tiến hành khi tạo tủa protein bằng acid sulfosalislic Thuốc thử : Dung dịch protein 1% Dung dịch acid sulfosalislic 20% Tiến hành : Cho vào một ống nghiệm : 5 giọt dung dịch protein 0,1% 2 giọt dung dịch acid sulfosalislic 20%. Quan sát kết quả sẽ thấy có kết tủa trắng protein xuất hiện è Mục đích của việc làm tủa protein trong trường hơpï này: đầu tiên là để tách protein ra khỏi hỗn hợp và sau đó sẽ tiến hành định lượng nó Các phương pháp xác định giá trị dinh dưỡng của protein trong thức ăn Như ta đã biết protein là thành phần cơ bản của vật chất sống,tham gia vào mỗi 1 tế bào và là yếu tố tạo hình chính.Protein là chất dinh dưỡng vô cùng quan trọng đối với cơ thể sống.Vì vậy việc xác định hàm lượng protein thức ăn để đưa vào cơ thể cũng là việc đáng lưu ý. Giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn được quyết định bởi tỉ lệ hấp thu tiêu hoá và tỉ lệ tận dụng nó trong cơ thể , và tỉ lệ tận dụng lại được quyết định bởi sự tạo thành các axitamin cần thiết (về chủng loại , số lượng ,tỉ lệ ) Khi sự tạo thành axitamin cần thiết tiếp cận được với nhu cầu cơ thể thì cả tỉ lệ tận dụng và giá trị dinh dưỡng đều cao Các phương pháp sinh vật học : Tỉ lệ tiêu hoá protein (TD): Lượng hoặc mức độ protein thức ăn được hấp thụ sau khi đã qua tiêu hóa: tỉ lệ tiêu hoá protein được tính dựa vào việc đo lượng nitơ trong phân và trong thức ăn TD(%) = I-(F-Fm) .100% I Với: I : Nitơ thức ăn F : Nitơ phân Fm : Nitơ chuyển hoá phân(Nitơ vi sinh vật đường ruột) – được đo trong phân trong trường hợp cơ thể được nạp thức ăn đầy đủ năng lượng nhưng hoàn toàn không hấp thu protein) è Nếu bỏ qua Fm thì kết quả có được sẽ gọi là “ tỉ lệ tiêu hoá bề ngoài“, nếu tính cả Fm thì gọi là “tỉ lệ tiêu hoá thực“ hay “tỉ lệ tiêu hoá“. è Ví dụ : tỉ lệ tiêu hoá albumin trong trứng các loại là 98% nghĩa là : khi ăn 100 g protein trong trứng các loại sẽ có 98g được hấp thu vào cơ thể thông qua tiêu hoá , 2 g không được tiê hoá hấp thu , thải ra ngoài theo phân . Lưu ý : Tỉ lệ tiêu hoá của protein động vật thường cao hơn thực vật Tỉ lệ này phụ thuộc vào 2 yếu tố: cơ thểå (trạng thái toàn thân,tinh thần, tình cảm,cảm quan đối với thức ăn,tập quán ăn uống,chức năng tiêu hoá…)và thức ăn (thuộc tính,cách chế biến, thức ăn ăn cùng…) Giá trị sinh học protein(BV-Biological Value) Giá trị sinh học protein hay tỉ lệ tận dụng protein thức ăn :tỉ lệ phần trăm của Nitơ tích trữ chiếm trong lượng Nitơ hấp thu BV = Lượng Nitơ tích trữ . 100 Lượng Nitơ hấp thu Với: Lượng Nitơ tích trữ = I - ( F - Fm) - ( U - Um) Lượng Nitơ hấp thụ= I - ( F – Fm ) Với I, F, Fm giống như trên U: Nitơ niệu Um: Nitơ có từ trong nước tiểu (Nitơ niệu khi trong bữa ăn không có protein ) BV cao hay thấp phụ thuộc vào sự cấu thành các axitamin của prôtein (về chủng loại , số lượng , tỉ lệ tương hỗ lẫn nhau của các axitamin cần thiết có trong đó ).Nếu sự cấu thành các axitamin gần hoặc tiếp cận với loại protein mà cơ thể đòi hỏi thì giá trị sinh học của nó cao,ngược lại sẽ thấp. BV chỉ phản ánh mức độ tận dụng protein sau khi được tiêu hoá hấp thu khi vào cơ thể , còn quá trình tiêu hoá hấp thu protein phải chịu ảnh hưởng của rất nhiều nhân tố .Vì thế ta lại có thêm tỉ lệ tận dụng protein NPU. è Nguyên tắc : Nên dùng động vật làm đối tượng thử nghiệm, lấy protein được tính làm nguồn nitơ duy nhất trong bữa ăn. Giá trị sinh học của protein thức ăn thường dùng Protein Giá trị sinh học Protein Giá trị sinh học Protein trứng gà Lòng trắng trứng gà Lòng đỏ trứng gà Sữa bò tách bơ Cá Thịt bò Thịt lợn 94 83 96 85 83 76 74 Đậu nành sống Khoai lang Khoai tây Ngô Đậu nành chín Lạc 57 72 67 60 64 59 Tỉ lệ tận dụng protein (NPU-Net protein Utilization): Tỉ lệ lượng Nitơ giữ lại so với lượng Nitơ ăn vào hay tỉ lệ protein giữ lại so với protein ăn vào, bao gồm cả giá trị sinh học BV và hệ số tiêu hoá D của protein. NPU = BV. D = Nitơ giữ lại . 100% Nitơ ăn vào NPU gồm cả quá trình tiêu hoá và hấp thu. Hiện nay khẩu phần ăn với protein có NPU xung quanh 70 được khuyến cáo là thích hợp cho phần lớn đối tượng ,tuy nhiên ở trẻ em chất kượng protein đòi hỏi tốt hơn là do trong những tháng đầu protein là từ sữa mẹ , sau đó mới chyển dần sang chế độ ăn bổ sung vì vậy chất lượng proteincũng giảm dần ở những lứa tuổi lớn gần với chế độ ăn của người trưởng thành. Tỉ lệ hiệu quả của protein hay Hệ số tăng trọng (PER: Protein Efficiency Ratio): Phản ánh tỉ lệ hiệu quả mà protein được tận dụng cho sự sinh trưởng của chuột theo những điều kiện quy định ( hay hiểu đơn giản hơn : tỷ số phản ánh số g trọng lượng chuột tăng lên trên số gam protein sử dụng ở chuột đang lớn ). Hệ số tăng trọng càng cao chứng tỏ protein càng tốt PER = Trọng lượng tăng thêm của động vật (g) .100 Protein đã ăn (g) è PER dùng để đánh giá chất lượng của protein. Phần trăm năng lượng protein được sử dụng (NDp Cals%: Net-Dietary calories percent). Các xét nghiệm trên chỉ đánh giá về chất lượng protein . Để thể hiện về chất và lượng protein trong khẩu phần ăn, ta sẽ xem xét đến NDp Cals % (phần trăm năng lượng protein được sử dụng ) NDp Cal% = ( NPU) . (% năng lượng do protein) Tỉ lệ protein tịnh NPR : Tỉ số giữa nhóm động vật chênh lệch về cân nặng được nuôi lần lượt bằng protein thức ăn thử nghiệm và bằng thức ăn không có protein có năng lượng tương đương với lượng protein ăn vào. NPR = Trọng lượng tăng bình quân (g) + Trọng lượng giảm bình quân (g) Protein ăn vào (g) NPR dùng để tính tỉ lệ tận dụng protein thức ăn . Chỉ số hoá học (CS-Chemical score):. Tỷ số các axitamin cần thiết trong protein nghiên cứu so với axitamin trong protein chuẩn (thường dùng trứng hay mô hình axitamin mà tổ chức Nông Nghiệp và Lương Thực thế giới (FAO ) / Tổ chức Y Tế thế giới ( WHO ) đưa để làm protein tham khảo ). CS = a .100 b Với: a = hàm lượng axitamin có t