Đề tài Các tiêu chí kiểm nghiệm salmonella

ĐỀ TÀI:CÁC TIÊU CHÍ KIỂM NGHIỆM SALMONELLA KIỂM NGIỆM SALMONELLA Đặt vấn đề Những năm gần đây các mặt hàng thực phẩm của Việt Nam đã bắt đầu mở rộng, thâm nhập vào thị trường các nước châu Á, châu Âu, châu Mỹ. Đây là những thị trường mà yêu cầu về các chỉ tiêu vi sinh vật rất cao, luôn đòi hỏi những sản phẩm chất lượng tốt. Salmonella là một loài vi khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae, là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trong thực phẩm. Hiện nay có khoảng 4% người thường mang mầm bệnh. Tất cả các tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm đều không cho phép có Salmonella trong thành phẩm. Sự hiện diện của chúng luôn được kiểm tra gắt gao. Tuy nhiên, việc phát hiện Salmonella trong thực phẩm thường rất thấp, có thể bị bỏ sót bởi các lý do: Trong khi xử lý nguyên liệu và chế biến có thể làm cho tế bào Salmonella bị tổn thương, chúng khó phục hồi trong quá trình nuôi cấy phân lập khi xét nghiệm. Khả năng chịu nhiệt của Salmonella kém nên số lượng giảm dần trong quá trình bảo quản đông lạnh. Do đó vấn đề kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Với ý nghĩa trên, nhóm xin thuyết trình đề tài: Các tiêu chí kiểm nghiệm Salmonella. Khái quát chung Định nghĩa Salmonella là những trực khuẩn Gram (-), hiếu khí và kị khí tuỳ ý, không tạo bào tử, nói chung di động, lên men glucose sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophan, thuộc họ Enterobacteriaceae (họ các trực khuẩn đường ruột) nên có các tính chất chung của họ này, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Phân loại Về phân loại khoa học, Salmonella được xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Loài: Salmonella bongori, Salmonella enterica Các loài điển hình: Salmonella typhi: gây bệnh thương hàn Salmonella paratyphi: gây bệnh phó thương hàn Salmonella cholera_suis: gây bệnh nhiễm trùng máu Salmonella entertidis: gây rối loạn tiêu hoá Một số chủng Salmonella khác: S.thompson, S. derby, S.newport, S.meleagnidis, S.anatum, S.panama, S.dublin, S.gallinarum, S.pullorum... Nguồn chứa Salmonella Nguồn chứa Salmonella là ở bất kỳ thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật như thịt lợn, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm sữa, trứng, hải sản cùng với một số rau, quả có thể chứa vi khuẩn salmonella. Vì thế, tránh ăn các thực phẩm này dạng sống, dạng chưa chín hay sữa chưa được diệt khuẩn. Trong danh sách này còn có thức ăn tự làm có chứa trứng tươi như kem, bột làm bánh Nguồn lây ngoài thực phẩm Động vật nuôi trong nhà cũng có thể mang vi khuẩn salmonella. Vì thế cẩn thận khi làm vệ sinh cho chim, rùa cảnh trong nhà. Nên nhớ luôn rửa tay sạch sẽ sau khi sờ vào chúng. Bên cạnh đó, Cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (CDC) cũng khuyên các bậc phụ huynh tuyệt đối không để trẻ dưới 5 tuổi sờ vào vịt, gà con Từ năm 1995, ở Việt Nam đã xuất hiện nhiều ổ dịch thương hàn do các chủng S.typhi đa kháng kháng sinh như chloramphenicol, tetracyclin ampicilin và co-trimoxazol làm cho việc điều trị hết sức khó khăn. Các đặc điểm Tính chất nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, chúng có thể sống ở nhiệt độ từ 5 – 46oC và pH từ 3,7 - 9,5 nhưng phát triển tốt nhất ở 37oC và pH từ 6,8 - 7,2. Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ. Trên môi trường canh sau khi nuôi cấy Salmonella từ 5 - 6 giờ thì làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ làm đục đều, nếu nuôi cấy lâu hơn 24 giờ thì môi trường có lắng cặn. Trên môi trường thạch thường vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn,lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc dạng R (Rough), kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm. Trên môi trường thạch Macconkey vi khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, đường kính 2 – 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa. Trên môi trường thạch SS (Shigella – Salmonella Agar) Salmonella hình thành những khuẩn lạc tròn, bóng không màu hay có màu hồng và có tâm đen ở giữa. Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) Salmonella cho khuẩn lạc trong suốt, không màu hay có màu hơi nhuốm đỏ đôi khi có tâm đen,thường xuất hiện vùng đỏ hồng xung quanh khi khuẩn lạc Salmonella phát triển mạnh. Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant Green Phenol Red Lactose Agar) Salmonella cho khuẩn lạc tròn, màu trắng hồng, môi trường xung quanh đỏ hồng. Trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulphite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thường có ánh kim bao quanh. Sức đề kháng Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 15 phút, 100oC trong 5 phút. Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 – 12oC. Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng Salmonella tồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống 1 - 2 tháng. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong sau 5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ. Salmonella bị diệt bởi clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3% trong 15 - 20 phút. Đặc tính sinh hóa Salmonella có những biểu hiện đặc tính sinh hóa chủ yếu như Bảng , dựa vào các đặc điểm này mà người ta có thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác. Bảng :C ác biểu hiện đặc tính sinh hóa của Salmonella Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm  Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm  Theo CDC, mỗi năm nước Mỹ có khoảng 40 000 người là nạn nhân của vi khuẩn Salmonella, tuy nhiên con số này có thể còn cao hơn 30 lần. Số người tử vong vì nhiễm Salmonella hằng năm vào khoảng 600 người. Hầu hết số người bị vi khuẩn này tấn công đều có biểu hiện tiêu chảy, sốt và chuột rút ở bụng. Bệnh kéo dài 4 – 7 ngày. Ở Hà Lan, từ năm 1996 đến năm 2001, có 13 970 trường hợp bị ngộ độc do Salmonella, trong đó S. enteritidis chiếm tới 43,6%, S. typhimurium chiếm 32%, S. typhi chiếm 0,8%. Ở các loài động vật được dùng làm thực phẩm thấy tỉ lệ nhiễm S.typhimurium cũng khá cao như ở bò là 32,9%, lợn chiếm 66,4%, riêng gia cầm chỉ có 5,3% nhưng có tỉ lệ nhiễm S. enteritidis tới 20,3%. Ở Việt Nam, theo thống kê năm 2001 của Bộ Y tế thì trong quý III có 1684 trường hợp mắc bệnh thương hàn làm chết người Các chỉ tiêu an toàn thực phẩm. Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các  nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng.  Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm như Bảng 2.3. Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào.  Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả. Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA. Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ đã là chuyện bình thường. Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella. Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.  Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông tƣ 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế . Nhóm thực phẩm Phương pháp kiểm tra  Thịt và các cơ quan nội tạng dùng làm thực phẩm muối, sấy khô, hun khói TCVN 5153:90  Sữa và kem chưa cô đặc, chưa pha thêm đường hoặc chất ngọt khác TCVN 6402:98  Sữa nước tách bơ, sữa chua và sữa kem khác để lên men hoặc acid hóa TCVN 6402:98  Xúc xích và các sản phẩm tương tự làm từ thịt, cá làm từ bộ phận nội tạng hoặc tiết động vật; các chế phẩm thức ăn từ các sản phẩm đó TCVN 5153:90  Điều đáng lưu ý là chỉ tiêu Salmonella không phân biệt chủng có gây bệnh hay không. Trong thực tế các phòng phân tích vi sinh thực phẩm chỉ thực hiện các xét nghiệm để phát hiện Salmonella spp., không làm xét nghiệm để phân biệt loài hay định danh chủng gây bệnh. Đây là một rào cản lớn cho các nhà sản xuất và xuất nhập khẩu thực phẩm Nguyên tắc phát hiện và phân lập - Phương pháp phát hiện và xác đinh truyền thống được thiết lập lâu và mất thời gian từ 3 đến 5 ngày mới có kết quả. - Pháp pháp phát hiện và xác định nhanh được sử dụng rộng rãi và có khả năng phát hiện trong vòng 24h. - Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự sinh trưởng của Salmonella. Bước 1: Tiền tăng sinh trong môi trường lỏng Cấy phẩn mẫu thử vào môi truừng tiền tăng sinh thích hợp và nuôi ấm ở 37°C từ 16h đến 20h. Bước 2: Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc Cấy dịch cấy thu đuợc vào môi trường tetrathionat và môi trường selenit xystin và nuôi môi trường tetrathionat ở 43°c và môi trường selenit xystin ở 37°C trong hai giai đoạn từ 18h đến 24h. Bước 3: Ria cấy lên đĩa và nhận dạng Từ các dịch cấy thu được, cấy hai môi trường đặc chọn lọc Nuôi hai môi trường đặc chọn lọc này ở 37°C và kiểm tra sau 20h đến 24h và, nếu cẩn, sau 40h đến 48h kiểm tra sự có mặt của các khuẩn lạc được coi là Salmonella theo các đặc tính của chúng. Bước 4: Khẳng định Các khuẩn lạc được coi là Salmonella sẽ được cấy truyển tiếp và khẳng định qua các thử nghiệm sinh hoá và huyết thanh học. Môi trường và hoá chất Môi trường canh RV (Rappaport Vassiliadis Soya Pepton) Môi trường pha loãng mẫu BPW (Buffered Pepton Water) Môi trường XLD ( Xylose Lysine Deoxycholate Agar) Môi trường TSA (Trypton Soya Agar) Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar) Môi trường TT (Tetrethionate Muller – Kauffmanm) Môi trường HE (Hektoen Entric Agar) Môi trường BS (Bismuth Sulphite Agar) BPLS (Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose) Canh LDC (Lysine Decarboxylase) Ornithine Decarboxylase Môi trường MR – VP Broth Môi trường Urea Broth Môi trường Mannitol Phenol Red Broth base Sucrose Sorbitol Canh Trypton Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Barritt Kháng huyết thanh Salmonella đa giá Cồn 70% và 96% Nước cất Quy trình phân tích định tính Salmonella trong thực phẩm Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh (BPW), ủ ở 370C, 18h đến 24h Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc (RV), ủ ở 420C, 18h đến 24h Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt (XLD, HE, BS, SS), ủ ở 37oC, 24h Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: -Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không -Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol (+); Sorbitol (+) Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh: Poly: O, Poly: H Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu Tăng sinh Đối với mẫu thông thường: Tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225mL dung dịch BPW và đồng nhất bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây. Ủ 37 độ trong 18 đến 24 giờ. Đối với mẫu gia cầm tươi sống: Đặt gia cầm vào trong một bao nhựa lớn, thêm vào 1 lít môi trường tăng sinh BPW, lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trường thấm vào mẫu Đối với sữa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225mL môi trường BPW, để yên 60 phút, nhiệt độ phòng, sau đó lắc đến khi sữa tan hoàn toàn. Đối với gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất mẫu ở độ pha loáng 1/100 trong BPW trước khi nuôi tăng sinh Đối với các loại mẫu như casein, phomat, bơ: thực hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 40oC. Đối với sản phẩm chứa cocoa: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim Milk Broth được làm ấm đến 40oC Đối với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: Đồng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2-3 giọt Triton X100 trước khi ủ tăng sinh. Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1mL sang 10mL môi trường tăng sinh Rappapport-Vassliadis Soya Pepton đã được ủ ấm đến 42oC, ủ ở 42oC trong 18-24 giờ. Ngoài ra còn có một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác: Selenite Cysteine Broth, Tetrathionate Muller-Kauffman. Phân lập và nhận diện Dùng que cấy vòng thực hiện kĩ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau: Môi trường XLD: Khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Môi trường HE: Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen Môi trường BS: Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển thành màu đen nếu kéo dài thời gian ủ. Môi trường BPLS: khuẩn lạc có màu hồng nhạt trong suốt, xung quanh khuẩn lạc, môi trường chuyển màu đỏ Môi trường SS: Khẳng định Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt, chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc ví dụ như TSA. Ủ ở 37oC trong 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hoá và huyết thanh. Các thử nghiệm sinh hoá cần thực hiện cho Salmonella: Thử nghiệm H2S (TSI hay KIA): Salmonella chir leen men dduocwj dduongwf Glucose trong các môi trường trên vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu của môi trường có màu vàng. Hầu hết có khả năng sinh H2S nên xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này, có hiện tượng sinh hơi Thử nghiệm LDC(+): Sauk hi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu môi trường được chuyển thành màu như ban đầu (tím hay xanh) Thử nghiệm Ure (-) môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam, Salmonella không làm thay đổi pH môi trường. Lên men mannitol, sorbitol (+): môi trường sau nuôi cấy bị acid hoá và chuyển thành màu vàng. Thử nghiệm Indol và VP (-) Báo cáo kết quả Kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu Lưu ý: Salmonella là nhóm có chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm, do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm đối chứng (+) cũng như thao tác trên các chủng phân lập dc. Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa. Quy trình phân tích định tính Salmonella trong nước Salmonella có thể hiện diện trong các loại nước, do vậy để phát hiện Salmonella trong nước cần phải qua bước lọc thu gộp tế baofqua màng lọc, làm giàu trong môi trường tăng sinh để phục hồi các tế bào bị tổn thương. Quy trình phát hiện gồm 4 bước tương tự như trường hợp thực phẩm. Lưu ý: Nếu thể tích mẫu nhỏ hơn 10mL, cho mẫu vào trong 50mL môi trường BPW có nồng độ đơn. Nếu mẫu có thể tích lớn hơn 10 mL, cho mẫu vào môi trường BPW có nồng độ kéo theo tỉ lệ 1:1. Trường hợp dùng màng lọc để thu gộp tế bào, sau khi lọc mẫu, cho màng lọc vào 50mL môi trường BPW. Tiến hành ủ ở 36oC trong 16-20 giờ, sau đó tiếp tục bước tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.