Đề tài Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 1 LỜI NÓI ĐẦU Enzyme giữ vai trò cực kì quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện đại, hiện nay việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzym đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta là một nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Vì thế ngành công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng chúng ở nước ta hiện nay rất phát triển, trong đó hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Với đề tài: “Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng”, thuộc môn Công nghệ Lên Men Thực Phẩm, đây là đề tài rất thú vị và phù hợp với xu thế phát triển hiện nay của ngành công nghiệp enzyme, nhờ sự chỉ dẫn tận tình của quý thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, mà đặc biệt là thầy Lê Văn Việt Mẫn, chúng tôi đã hoàn thành đề tài này. Trong quá trình thực hiện đề tài, không tránh khỏi thiếu sót, kính mong sự góp ý của thầy và để chúng tôi có thêm kinh nghiệm cho các bài báo cáo tiếp theo, và luận văn sau này. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 2 MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU CHUNG ...................................................................................... 4 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI .......................................................................... 4 2.1 Định nghĩa .................................................................................................... 4 2.2 Phân loại ....................................................................................................... 4 2.2.1 α – amylase .......................................................................................... 5 2.2.2 β – amylase .......................................................................................... 7 2.2.3 Glucoamylase ....................................................................................... 8 2.2.4 Một số amylase khác ......................................................................... 10 3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ................................................ 12 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật ......................................................... 12 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật ...................................................... 13 4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG .............. 13 A. Sơ đồ quy trình công nghệ .......................................................................... 14 B. Giải thích quy trình ..................................................................................... 15 4.1 Chọn giống vi sinh vật ................................................................................ 15 4.2 Nhân giống vi sinh vật ................................................................................ 16 4.2.1 Môi trường nhân giống ..................................................................... 16 4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống ............................................. 16 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống ............................. 17 4.2.4 Thiết bị nhân giống ........................................................................... 17 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men .................................................................... 18 4.4 Tiệt trùng môi trường ................................................................................ 19 4.4.1 Mục đích ............................................................................................. 19 4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng ........................................ 19 4.4.3 Thiết bị ............................................................................................... 19 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme .................................................................. 20 4.5.1 Mục đích ............................................................................................. 20 4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men .................................... 20 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ................................... 21 4.5.4 Thiết bị ............................................................................................... 22 4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô .................................................... 24 4.7 Tách và tinh sạch enzyme .......................................................................... 25 4.7.1 Siêu lọc ................................................................................................ 25 4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel ................................... 27 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 3 4.8 Sấy ............................................................................................................... 32 5. CHẾ PHẨM AMYLASE ................................................................................. 34 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp ........................... 34 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme ...................................................................... 35 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại ..................................................... 35 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ .......................................................................... 38 6 α – amylase Bacillus subtilis .................................................................................. 38 6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải trong công nghiệp thực phẩm .......... 43 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 47 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 4 1. GIỚI THIỆU CHUNG Hệ enzyme amylase là một trong những hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp thực phẩm, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu từ những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi nhà bác học Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết malt nảy mầm và nhận thấy trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, tức là vào năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột thành đường từ dịch chiết malt, hai ông đã dùng rượu để kết tủa nó và thu được enzyme dưới dạng bột, đồng thời đặt tên nó là diastase. Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Hiện nay, người ta chủ yếu sản xuất amylase từ vi khuẩn và nấm mốc. Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm amylase và là cơ sở khoa học để áp dụng chúng trong sản xuất và đời sống, đồng thời cũng mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn đối với nền kinh tế quốc dân. 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 2.1 Định nghĩa Amylase thuộc nhóm hydrolase, phân giải liên kết glycoside, enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử có chiều dài mạch ngắn hơn như dextrin, oligosaccharide, glucose, … 2.2 Phân loại Dựa theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có thể chia amylase thành các loại sau: Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 5 2.2.1 α – amylase Hình 2.2.1.1: Cấu trúc không gian của α – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  α – amylase (α – 1,4 – glucan – 4glucanohydrolase) là một endo enzyme. Nó xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α – 1,4 – glycoside nằm bên trong phân tử của các cơ chất amylase, amylopectin và glycogen.  α – amylase được tìm thấy trong cơ thể của động vật, thực vật và tế bào vi sinh vật.  Tùy theo nguồn gốc mà phân tử lượng của enzyme sẽ thay đổi, thường dao động trong khoảng 45 – 60kDa. Có một số trường hợp đặc biệt như α – amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130kDa.  Tất cả các α – amylase đều là metalloenzyme. Người ta tìm thấy Ca2+ trong phân tử enzyme với hàm lượng từ 1 – 30g.nguyên tử/1g.mol enzyme. Nếu chúng ta tách toàn bộ Ca 2+ ra khỏi α – amylase, enzyme sẽ bị vô hoạt.  Nhìn chung, tỷ lệ tryptophan và tyrosin trong phân tử của các amylase là khá cao. Riêng thành phần acid glutamic và acid aspartic có thể chiếm tới 25% trọng lượng phân tử. Ngoài thành phần protein, một số enzyme amylase từ nấm mốc còn có phân đoạn glucid có chứa mannose, xylose và hexosamine. Chức năng của thành phần glucid này hiện này còn chưa rõ.  Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết các α – amylase khá bền với các tác động của các protease như peppin, trypsin, papain, … Bảng bên dưới giới thiệu tính chất của 1 số chế phẩm α – amylase từ vi sinh vật. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 6 Bảng 2.2.1.1: Một số tính chất của α – amylase từ vi sinh vật (Fogarty, 1983) Tên vi sinh vật pHopt Topt Phân tử lượng (kDa) Bacillus acidocaldarius 3.5 75 68 Bacillus stearothermophilus 4.5 – 6.5 65 – 73 48 Bacillus subtilis 5.3 – 6.4 50 47 Acinetobacter sp.I 7.0 50 – 55 55 Acinetobacter sp.II 7.0 50 – 55 65 Bacteirodes amylophilus 6.3 43 92 Micrococcus halobius 6.0 – 7.0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5.0 – 6.0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4.6 – 5.3 40 40 Thermonospora curvata 5.5 – 6.5 65 62 Aspergillus oryzae 5.5 – 5.9 40 52 Mucor pusillus 3.5 – 4.0 65 – 70 48 Lipomyces kononenkaae 5.5 40 38 Schwaniomyces castellii 6.0 60 40  Dựa trên quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose, người ta tạm thời chia α – amylase thành hai nhóm: enzyme dịch hóa và enzyme đường hóa. o α – amylase dịch hóa - Sản phẩm thủy phân tinh bột bởi các amylase dịch hóa chủ yếu là các dextrin. - Enzyme này thường được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân tinh bột, nhằm hỗ trợ cho quá trình hồ hóa và dịch hóa. o α – - α – oligosaccharide. - Tùy . Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 7 ư α – Aspergillus oryzae ủy 2 (maltose 3 (maltotriose α – Bacillus subtilis thủy 6 (malitohexaose 9. α – amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững đối với acid hơn α – amylase của malt và vi khuẩn Bacillus subtilis. , tùy thủy α – thủy . 2.2.2 β – amylase Hình 2.2.1.2: Cấu trúc không gian của β – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  β – amylase là một exo enzyme, thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin và glycogen. Chúng phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra maltose (dạng β – anomeric).  Enzyme này không thủy phân được liên kết α – 1,6 – glycoside ở amylopectin nên sản phẩm cuối cùng thường gồm 50 – 60% maltose và β – dextrin.  β – amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa, enzyme này vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca2+.  Điều kiện hoạt động:  β – amylase bền trong môi trường acid (kể cả pH 3 – 4), enzyme này hoạt động mạnh trong môi trường có pH 4.5 – 5.5.  β – amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, bị vô hoạt hoàn toàn dưới tác dụng của nhiệt độ 700C, nhưng trong dịch nấu, topt là 60 – 65 0 C. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 8 2.2.3 Glucoamylase Hình 2.2.1.3: Cấu trúc không gian của glucoamylase  Đặc điểm và hoạt động:  Glucoamylase ( – c ủy – – – amylase.  .  5 – 48 – bên dưới . Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 9 2.2.3.1: a glucoamylase t Gratreva, 1987) pHopt Topt ( o C) (kDa) pH Aspergillus awamori 4.5 60 83.7 – 88 3.7 Aspergillus niger 1 4.5 – 5.0 - 99 3.4 Aspergillus niger 2 4.5 – 5.0 - 112 4.0 Aspergillus oryzae 1 4.5 60 76 5.6 Aspergillus oryzae 2 4.5 50 38 5.6 Aspergillus oryzae 3 4.5 40 38 5.6 Aspergillus saitoi 4.5 - 90 3.9 Cephalosporium eichhorniae 4.2 45 – 62 26.85 - Lipomyces kononenkoae 4.5 50 81.5 6.1 Mucor rouxianus 1 4.6 55 59 8.4 Mucor rouxianus 2 5.0 55 49 8.4 Penicillium oxalicum 1 5.0 55 – 60 84 7.0 Penicillium oxalicum 2 4.5 60 86 7.45 Rhizopus delemar 4.5 40 100 - Rhizopus javanicis 5.0 – 5.2 - 48 7.5 – 8.0 Endomycopsis sp. 20-9 5.7 – 5.9 50 53 3.8 Endomyces JF 00111 4.8 – 5.0 - 55 4.8 – 5.5  Nhận xét: o Đa số các chế phẩm glucoamylase của vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) và của mô động vật đều có pH tối ưu ở vùng acid: pH 3.5 – 5.5. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 10 o T0opt của glucoamylase là 50 – 60 0C, nhưng hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 700C. o So với α – amylase, glucoamylase bền acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu, acetone, không được bảo vệ bằng Ca2+. Bảng 2.2.3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến glucoamylase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau Chỉ số Nguồn thu glucoamylase Rhizopus detemar Aspergillus niger pHopt 4.5 3.8 pH bảo đảm độ bền cho enzyme trong 1 ngày ở 300C 3.5 – 8.0 2.2 – 7.5 Nhiệt độ cao nhất (0C) mà enzyme có thể chịu được trong 15 phút ở pH 5.5 55 70 Điểm đẳng điện pI 7.4 6.5 2.2.4 Một số amylase khác Bên cạnh 3 loại amylase trên, các enzyme thủy phân liên kết nhánh cũng được sử dụng nhiều trong công nghiệpt thủy phân tinh bột. α – glucosidase thủy phân từ đầu không khử các liên kết α – 1,4 – glycoside và α – 1,6 – glycoside của các gốc glucopyranose để tạo ra α – D – glucose. Enzyme này thủy phân rất tốt đường đôi và các oligosaccharide, có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong chuyển hóa syrup giàu maltose sang syrup giàu glucose. Enzyme thủy phân liên kết α – 1,6 – glycoside trong phân tử amylopectin, glycogen và một số polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isomaltose. Enzyme này thường được sử dụng kết hợp với β – amylase, glucoamylase trong sản xuất một số sản phẩm syrup hay glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân. Kể từ khi Robyt và Ackerman phát hiện amylase thủy phân tinh bột thành maltotetraose năm 1971, một số amylase của vi khuẩn đã được công bố có khả năng tạo ra các sản phẩm từ DP2 đến DP6. Hiện nay, các enzyme thủy phân tinh bột tạo các malto – oligosaccharide đang được quan tâm. Malto – oligosaccharide có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp hóa chất tinh khiết. Những sản phẩm từ DP2 đến DP6 đã được sử dụng trong việc chẩn đoán lâm sang để xác định sự có mặt của α – amylase. Những chất này đều tan rất tốt, tạo ra một dung dịch nhớt và là một thực phẩm tuyệt hảo cho trẻ sơ sinh cũng như người già. Tuy nhiên, giá thành của những sản phẩm này khá đắt do những khó khăn trong việc sản xuất chúng. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 11  Amylase tạo maltotriose: Lần đầu tiên, Wako mô tả một exo – amylase từ Streptomyces griceus có khả năng thủy phân tinh bột từ đầu không khử, cho sản phẩm chủ yếu là maltotriose, không có glucose và maltose. Gần đây, một số công bố về khả năng tạo maltosetriose của α – amylase từ chủng Bacillus subtilis với hàm lượng 56%. Enzyme này không tác dụng lên pullutan và cyclodextrin, khi sử dụng cùng pullulanase, lượng maltosetriose có thể tăng lên 73% (Forgaty 1990, Hebeda 1995).  Amylase tạo maltotetraose:  Đặc điểm và hoạt động: Hoạt tính này được tìm thấy ở amylase của Pseudomonas stutzeri. Đây là một exo – amylase ngoại bào, nó tấn công tinh bột từ đầu không khử của mạch và phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside thứ tư để tạo maltotetraose.  Điều kiện hoạt động: o pHopt 8.0. o Bị mất hoạt tính ở 400C. Một số tác giả thử nghiệm sản xuất maltotetraose liên tục bằng cách sử dụng amylase từ Pseudomonas stutzeri NRRLB – 3389, được cố định trên các hạt xốp resin kị nước. Gen sinh tổng hợp exo – maltotetraose của chủng Pseudomonas sacharophila cũng đã nghiên cứu biểu hiện ở E.coli với hoạt tính enzyme thu được cao gấp 4 lần chủng bình thường (Duedahl – Olesen 2000, Gerhartz 1990).  Αmylase tạo maltopentaose: Maltopentaose được sử dụng như cơ chất để nhận biết serum α – amylase. Nó cũng được sử dụng làm thức ăn cho người bị bệnh thận hoặc suy dinh dưỡng. α – amylase từ ngoại bào của Bacillus cereus có thể tạo ra pentaose với hàm lượng 44% từ tinh bột. Một số chủng Pseudomonas từ đất cũng có khả năng tạo maltopentaose, đặc biệt trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân (Duedahl – Olesen 2000, Forgaty 1990).  Amylase tạo maltohexaose:  Đặc điểm và hoạt động: Acetobacter aerogenes (Klebsiella pneumonia) tổng hợp một exo – enzyme có khả năng tạo maltohexaose từ tinh bột, amylopectin và amylase. Khi thủy phân amylopectin và glycogen, ngoài maltohexaose, còn có một lượng dextrin giới hạn, các β – limit dextrin sau đó tiếp tục được thủy phân tạo ra các oligo phân nhánh.  Điều kiện hoạt động: o pHopt 5.8 – 6.0. o t0opt = 50 – 520C. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 12 Enzyme này có hoạt tính transferase tạo maltohexaose từ maltotetraose. α – amylase của Bacillus circulans và Bacillus amyloliquefacines cũng có khả năng thủy phân tinh bột đến 30 – 34% maltohexaose. Sự có mặt của pullanase có thể tăng lượng maltohexaose thêm 12%. 3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật Từ lâu, người ta đã biết sử dụng các loại enzyme từ hạt nảy mầm để sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia), … hoặc sản xuất bột enzyme amylase để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho trẻ em, người già, những người bị suy tiêu hóa. Hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp để giữ nguyên hoạt tính của enzyme được gọi là malt. Malt có thể được sản xuất từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại mạch, lúa, ngô, đậu, … mà chủ yếu là từ đại mạch, lúa,…  Đại mạch (Hordeum sativum): Các enzyme có vai trò rất quan trọng: nó tham gia xúc tác tất cả các phản ứng sinh hóa trong suốt quá trình sản xuất malt và sản xuất bia. Trong hạt khô, enzyme phần lớn ở dạng liên kết, chúng chỉ được giải phóng và hoạt động khi hạt đi vào giai đoạn nảy mầm và các quá trình đường hóa sau đó. Các enzyme thủy phân tinh bột: chủ yếu là amylase gồm có – amylase và – amylase. Quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển các enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời còn tổng hợp nên hàng loạt các enzyme mới và trong giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của hạt bằng cách đảo trộn thường xuyên để tạo độ thóang khí. Hạt đại mạch trước khi ngâm không có hoạt lực của enzyme - amylase. Khi hạt trải qua 3 – 4 ngày trong giai đoạn nảy mầm thì hoạt lực của enzyme đạt đến mức cực đại vào ngày thứ 7, sau đó sẽ giảm xuống.  Lúa (Oryza sativa L.): Hệ enzyme amylase trong hạt lúa gồm – amylase và – amylase Trong quá trình nảy mầm hoạt động của các enzyme tăng cao thúc đẩy cho các quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và các quá trình sinh hóa gần giống ở đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phản ứng. Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. Khi hạt nảy mầm, các enzyme này chuyển sang hoạt động. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 13 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật Trong ba nguồn sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật) để khai thác và thu nhận enzyme thì nguồn vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất, do nguồn enzyme khai thác từ vi sinh vật có ưu điểm sau: