Đề tài Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate

1 Phần 1. LỜI NÓI ĐẦU Enzyme là một chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thức phẩm, trong y học, trong kỹ nghệ phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường. Ngày nay, những nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong sản xuất công nghiệp phát triển rất mạnh. Các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tăng khả năng sử dụng enzyme, kéo dài thời gian, số lần sử dụng enzyme giảm giá thành sử dụng enzyme. Một trong những bước tiến quan trọng nhất hiện nay là kỹ thuật cố định enzyme trên giá thể tạo ra các dạng enzyme cố định (enzyme không hòa tan). Enzyme cố định ở các nước phát triển đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều qui trình công nghệ như: chế biến thực phẩm, y sinh học và nghiên cứu khoa học. Tuy nhiên hiện nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố định ở Việt Nam chưa được phổ biến lắm và vẫn còn là hướng phát triển mới mẻ. Để góp phần vào những nghiên cứu về enzyme cố định đồng thời được sự chấp thuận của bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, tôi thực hiện đề tài “Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate” tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thuộc trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME [2 ] 2.1.1 Khái niệm về enzyme Trong các phản ứng hóa học nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác. Chất xúc tác có hai đặc điểm quan trọng  Làm tăng phản ứng hóa học.  Bản thân chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng. Chất xúc tác hóa học chỉ làm thay đổi tốc độ phản ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sử dụng trong phản ứng. Trong các phản ứng sinh học xảy ra trong cơ thể sinh vật cũng có các chất làm tăng phản ứng. Chất đó dược gọi là enzyme. Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng hóa học trong cơ thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ. Sau này các nhà khoa học xác định bản chất của enzyme là protein. Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể. Điểm rất khác biệt của enzyme là chúng hoạt động trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa trong cơ thể sinh vật. Trong khi đó, các chất hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Những ưu điểm cơ bản của enzyme có thể tóm tắt như sau : 3 1. Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất. 2. Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao. 3. Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm của phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo. 4. Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít. 5. Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. 6. Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra hơn 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng thật có trong mỗi tế bào. Dị hóa ngoài tế bào Vật chất có kích thước nhỏ Tế bào Vật chất dị hóa ra khỏi tế bào Vật chất tổng hợp ra khỏi tế bào Môi trường Sinh khối (sản phẩm bậc 1) Sản phẩm bậc 2 Hình 2.1 : Hệ thống tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật Enzym ngoại bào Vật chất có kích thước lớn Enzym Dị hóa nội bào trong tế Quá trình bào tổng hợp 4 2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme a. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn Giai đoạn 1 : Enzyme tương tác với cơ chất tạo thành phức enzyme cơ chất E S. Giai đoạn 2 : Phức enzyme cơ chất sẽ được tách ra. Giai đoạn 3 : Enzyme sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm. Như vậy ở giai đoạn đầu, nếu cơ chất có nồng độ thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Hình 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng của enzyme Vận tốc phản ứng được tính như sau : SK S VV m max Phương trình trên gọi là phương trình Michealis Menten Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng. Nhưng khi tốc đố phản ứng đạt giá trị cực đại, cho dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo. Nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng Km 5 b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme Trong các phản ứng hóa học, nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản ứng xúc tác càng tăng. Trong các phản ứng sinh học, nhiệt độ tăng khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng. Nhưng khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định. Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh. Hình 2.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme Hiện tượng đặc biệt này ở enzyme có liên quan đến bản chất hóa học của enzyme. Các enzyme là những protein thường không bền nhiệt. Trường hợp ta tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất. Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính enzyme sẽ mất dần và đi đến chỗ triệt tiêu. c. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme Trong những nghiên cứu thí nghiệm về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng : nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt tới điểm cực đại giá trị pH, mà ở đó vận tốc phản ứng enzyme đạt giá trị cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme. Vượt quá giá trị pH này hoạt động enzyme sẽ giảm. Nhiệt độ Tốc độ phản ứng 6 Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Mỗi loại enzyme sẽ có khoảng pH tối ưu và điểm pH tối ưu. pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES. d. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm các hoạt tính enzyme Hoạt tính của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm. Những chất kìm hãm là những chất hoa học có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme. Các chất kìm hãm thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ và cả protein. Các chất chia ra làm 2 loại : Chất kìm hãm cạnh tranh. Chất kìm hãm không cạnh tranh. Chất kìm hãm cạnh tranh : Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với enzym, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức chất ES. pH Vận tốc phản ứng pH op 7 Hình 2.5 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh đến hoạt tính enzyme Chất kìm hãm không cạnh tranh : Các chất kìm hãm không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzym không phải ở trung tâm hoạt động của enzym mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzym. Người ta còn gọi vị trí này là trung tâm kìm hãm của enzym. Khi chất kìm hãm kết hợp với enzym ở ngoài trung tâm hoạt động của enzym sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzym. Nhờ vậy, chúng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng của enzym. Trong rất nhiều trường hợp, sản phẩm cuối của chuỗi phản ứng hay của một phản ứng thường là chất kìm hãm không cạnh tranh. Hình 2.6 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm không cạnh tranh đến hoạt tính enzyme 8 e. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa đến hoạt tính của enzym Các chất hoạt hóa (activator) là những chất làm tăng khả năng xúc tác của enzym. Các chất hoạt hóa có bản chất hóa học khác nhau. Các amin, các chất hữu cơ có cấu trúc hóa học khác nhau. Khả năng làm tăng hoạt tính của enzym của những chất hoạt hóa cũng có một giới hạn nhất định, vượt quá giới hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của enzym. 2.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM CỐ ĐỊNH 2.2.1. Khái niệm, đặc điểm của enzym cố định a. Khái niệm enzym cố định Enzym cố định (immobilised enzym) hay enzym không hòa tan (insolube enzym) được hiểu theo cả nghĩa hẹp và nghĩa rộng. Theo nghĩa hẹp : được hiểu theo Michael Trevan: thuật ngữ enzyme cố định là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do. Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn. Pha enzyme // Pha dung dịch tự do Hình 2.7 : Mô hình hệ thống hai pha của enzym cố định Theo nghĩa rộng : Theo Kkaus Mosbach : Các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme đã được cố định và một 9 chất mang, bao gồm cả enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. Enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này enzyme chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan. b. Đặc điểm của enzyme cố định Nhờ những tính chất ưu việt do đó ngày nay enzyme cố định đang ngày càng sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghệ : Những ưu điểm nổi bật của enzyme cố định. Enzyme là những chế phẩm sinh học đắt tiền, nếu sử dụng ở dạng hòa tan thì chỉ sử dụng được một lần và khó thu hồi trở lại. Ngược lại khi enzyme được cố định trên giá thể polymer nên có thể sử dụng liên tục trong nhiều ngày, thậm chí hàng tháng mà không mất hoặc chỉ giảm hoạt tính, vì vậy rất kinh tế. Do được cố định ở một pha riêng, do đó dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi enzyme, vì vậy sản phẩm dễ tinh sạch hơn do không trộn lẫn với enzyme. Điều này đặc biệt có ý nghĩa khi ứng dụng enzyme cố định trong dược học, trong công nghệ sản xuất hóa chất và trong phân tích. Có thể dừng hóa trình chuyển hóa ở bất kỳ giai đoạn nào cần thiết khi dễ dàng tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất trong trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa. – Khi được cố định trên giá thể enzyme có khả năng bền vững hơn, hoạt tính ổn định hơn khi có những thay đổi của môi trường như nhiệt độ, pH,… so với enzyme tự do. Nhờ được cố định trên giá thể nên enzyme ít bị biến tính hơn khi môi trường thay đổi. Sử dụng chế phẩm enzyme cố định, đặc biệt thích hợp với các qui trình công nghệ liên tục, tự động hóa ngày nay. Thường thì enzyme cố định được nhồi 10 vào các cột, tháp, fermentor, với dòng cơ chất liên tục được chảy vào và đầu ra là sản phẩm. Tuy nhiên enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định là vì được cố định nên đã hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Vì vậy hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme tự do, đặc biệt là trong trường hợp cơ chất là các chất có trọng lượng phân tử lớn như : protein, tinh bột, chitosan. Trong trường hợp enzyme được cố định bằng phương pháp nhốt (entrapment method) trong khuôn gel thì chỉ một phần enzyme nằm ở lớp vỏ ngoài của gel là hoạt động. Đặc biệt khi enzyme được cố định bằng phương pháp cộng hóa trị thì một lượng đáng kể enzyme bị mất hoạt tính do chất hoạt hóa và có thể do liên kết không đặc hiệu xảy ra ở trung tâm hoạt động của enzyme. 2.2.2. Chất mang dùng để cố định enzyme  Theo Michael Trevan, một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau đây : + Chất mang lý tưởng trong sử dụng cố định enzyme điều trước hết là cần phải rẻ. Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ. + Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định. + Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng. Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme. + Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật. + Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định enzyme vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố định và số lần tái sử dụng. 11 + Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể sử dụng ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng …  Phân loại chất mang : Tất cả chất mang dùng trong cố định enzyme được chia làm 2 nhóm : Chất mang polymer hữu cơ. Chất mang vô cơ. a. Chất mang là polymer hữu cơ Trong nhóm chất mang là polymer hữu cơ được chia làm 2 nhóm là polymer tổng hợp và polymer tự nhiên.  Chất mang là polymer tự nhiên (natural polymer)  Chất mang là polysaccharide (gluxit) : Là nhóm chất mang đang thịnh hành và được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng. Agarose là vật liệu ổn định, đồng nhất dễ dàng tạo hạt. Tuy nhiên do vấn đề về giá cả nên agarose chỉ thường được sử dụng trong nghiên cứu và mục đích y học (theo signa : 800 2000 USD/kg). Cellulose và các dẫn suất của chúng như CM Cellulose, DEAE Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất và ổn định nên chỉ sử dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt. Alginate và carrageenam là hai loại vật liệu khá mới mẻ. Cả hai loại vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào và enzyme. Tuy nhiên, hai loại vật liệu này có một nhược điểm căn bản là gel không ổn định trong môi trường có phosphate. Tinh bột là vật liệu phong phú và rẻ tiền. Từ lâu tinh bột, tinh bột khâu mạch, diathanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzyme như lipase, glucoisomerase, tripsin, amilase. Tuy nhiên tinh bột có nhược điểm là độ trương còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng (functional groups). Vì vậy khả 12 năng cố định và hoạt tính enzyme cố định còn thấp : để khắc phục nhược điểm này tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước, acrylamide, acrylic acid vừa cải thiện tính chất cơ lý, độ trương, vừa tạo các nhóm chức năng trên bề mặt như [ NH2], [ COOH] làm tăng diện tích tiếp xúc và khả năng cố định enzyme. Chitin và chitosan là vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố định tế bào và enzyme. Chitin là một polymer rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng thứ hai sau cellulose, chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là polymer của 2 acetomido deoxy D glucose. Chitin tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật. Chitosan là dẫn xuất của chitin khi xử lý bằng kiềm đặc. Chitin, chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố định enzyme qua cầu nối glutaraldehyde. Tuy nhiên cả chitin và chitosan đều có một nhược điểm là tính chất kỵ nước, độ trương kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay đang có xu hướng ghép copolymer với monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid, hydroxy ethylmethacrylate. Hiện nay, cũng có xu hướng chung là các vật liệu tự nhiên được ghép copolymer với các polymer tổng hợp để cải thiện tính chất cơ lý.  Chất mang là Protein : Chất mang là protein thường dùng là getalin, keratin, albumin. Vật liệu thuộc nhóm này thường dễ tạo màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là nhóm NH2 và vì vậy thường dùng sử dụng nhốt enzyme trong khuôn gel với tác nhân khâu mạch là glutaraldehyde. Nhóm chất mang này là protein có nhược điểm là thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn. 13  Chất mang là các polymer tổng hợp : Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định enzyme như polyacrylamide, polyester, polyvinilalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxylethylacrylate, polystyren, polyethylen ghép với vinyl monomer, …Ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước siêu lo ã, … – Polyhydroxyethylmethacrylate : khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững, không phân hủy trong tự nhiên. Vì vậy gây ô nhiễm môi trường. Đây là vấn đề quan trọng đòi hỏi con người cần quan tâm giải quyết. – Polyacrylamide là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt, kích thước lỗ gel có thể điều chỉnh được và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Polyacrylamide và polyacrylate thường được nạp vào cột, và có rất nhiều dạng khác nhau như polymer có nhóm amin hoặc aldehyde. Phương pháp cố định chủ yếu là nhốt enzyme tế bào trong khuôn gel khi được polymer bằng hóa chất như ammoniumpersulphate, bức xạ gamma, tia rơnghen, thường thì để tăng khả năng khâu mạnh của gel poly acrylamide, cần phải bổ sung thêm N, N methylenbisacrylamide làm chất khâu mạch (crosslinking agent). Ngoài ra còn có thể cố định enzyme trên các vật liệu này bằng phương pháp hấp thụ, liên kết cộng hóa trị và microcapsule. b. Chất mang vô cơ Ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang, còn co