Đề tài Công nghệ lên men: Sản xuất Acid Fumaric

Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 1 Mục lục: PHẦN 1: NGUYÊN LIỆU: .................................................................................................. 3 1.1. Môi trường: ............................................................................................................ 3 1.2. Giống vi sinh vật: ................................................................................................... 6 1.2.1. Sơ lược chung về giống Rhizopus: .................................................................. 6 1.2.2. Rhizopus oryzae: .............................................................................................. 6 1.2.3. Tiêu chuẩn chọn giống vi sinh vật: ................................................................. 7 PHẦN 2: QUI TRÌNH SẢN XUẤT ..................................................................................... 8 2.1. Sơ đồ qui trình sản xuất: ....................................................................................... 8 2.2. Thuyết minh qui trình: .......................................................................................... 9 2.2.2. Tiệt trùng: ..................................................................................................... 10 2.2.3. Nuôi cấy trên môi trường thu nhận bào tử nấm mốc: ................................. 10 2.2.4. Lọc: ................................................................................................................ 11 2.2.5. Lên men: ....................................................................................................... 12 2.2.6. Hấp phụ: ....................................................................................................... 14 2.2.7. Giải hấp phụ: ................................................................................................ 15 2.2.8. Kết tinh: ........................................................................................................ 15 2.2.9. Ly tâm: .......................................................................................................... 16 2.2.10. Sấy: ............................................................................................................ 17 PHẦN 3: SẢN PHẨM ........................................................................................................ 17 3.1. Giới thiệu chung: ..................................................................................................... 17 3.2. Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm: ............................................................................ 18 3.3. ÖÙng duïng cuûa acid fumaric: ............................................................................... 18 PHẦN 4: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ. ....................................................................... 19 4.1. Sản xuất axit fumaric từ axit maleic bằng phản ứng đồng phân hóa: ............... 19 4.2. Sản xuất đồng thời axit fumaric và chitin từ một lọai vật liệu lignocellulosic giàu nitơ – phân bò sữa – sử dụng Rhizopus oryzae ATCC 20344. ............................... 19 PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 21 Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 2 Danh mục bảng: Bảng 1Bảng 1.1: Chỉ tiêu chất lượng của MgSO4.7H2O. ................................................................. 3 Bảng 2Bảng 1.2: Chỉ tiêu chất lượng của KH2PO4. ......................................................................... 4 Bảng 3Bảng 1.3: Chỉ tiêu chất lượng của ZnSO4.7H2O. .................................................................. 4 Bảng 4Bảng 1.4: Môi trường nuôi cấy thu nhận bào tử nấm mốc. ................................................. 5 Bảng 5Bảng 1.5: Môi trường lên men thu nhận acid fumaric. ........................................................ 5 Bảng 6Bảng 4.1: Các đặc điểm của phân bò sữa. .......................................................................... 20 Danh mục hình: Hình 2.1: Sơ đồ qui trình công nghệ. ................................................................................... 8 Hình 2.2: Thiết bị phối trộn. ................................................................................................ 9 Hình 2.3: Thiết bị tiệt trùng dạng bản mỏng. ................................................................... 10 Hình 2.4: Thiết bị nuôi cấy nấm mốc thu nhận bào tử. .................................................... 11 Hình 2.5: Thiết bị lọc ép sử dụng đĩa lọc. .......................................................................... 12 Hình 2.6: Rotating biological contactor. ........................................................................... 13 Hình 2.7: Con đường chuyển hóa glucose thành acid fumaric. ........................................ 13 Hình 2.8: Cột hấp phụ. ...................................................................................................... 15 Hình 2.9: Thiết bị phản ứng có cánh khuấy. ..................................................................... 16 Hình 2.10: Thiết bị lọc ly tâm. ........................................................................................... 17 Hình 2.11: Thiết bị sấy khay. ............................................................................................. 17 Hình 12Hình 3.1: Công thức cấu tạo của acid fumaric. ................................................................ 18 Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 3 PHẦN 1: NGUYÊN LIỆU: 1.1. Môi trường:  Nguồn C: glucose Theo các nghiên cứu đã được công bố nguồn carbon có thể dùng để sản xuất acid fumaric là glucose, fructose đường nghịch đảo, saccharose, mật rỉ, maltose, tinh bột. Trong đó glucose là nguồn được sử dụng rộng rãi nhất. Chỉ tiêu chất lượng của Glucose:  Màu sắc: vàng nhạt hoặc không màu và trong suốt  Nồng độ: 75%-85%  Chỉ số DE: ≥ 60  pH: 4.5-6.0  Nguồn Nitơ: Nguồn nitơ dùng trong công nghệ lên men bao gồm 2 nhóm chính: nguồn nitơ vô cơ và nguồn nitơ hữu cơ. Để lên men sản xuất acid fumaric có thể sử dụng nguồn Nitơ vô cơ như urea. Chỉ tiêu chất lượng của Urea:  Hàm lượng Nitơ: ≥46.6%  Biuret: ≤1%  Độ ẩm: ≤1%  Kích thước tinh thể: 0.85mm-2.8mm.  Khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4, , ZnSO4.7H2O Khoáng và ion kim loại có vai trò rất quan trọng trong lên men.  Các ion kim loại là cofactor của các enzyme.  P là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP…  S là thành phần của các aminoacid chứa S, một số vitamin. Chỉ tiêu chất lượng của khoáng:  MgSO4.7H2O: Bảng 1Bảng 1.1: Chỉ tiêu chất lượng của MgSO4.7H2O. Độ tinh khiết 99% MgSO4 48.30% Fe ≤ 0.0006% Pb ≤ 0.0006% Cl ≤ 0.0001% As ≤ 0.0001% pH 6 ÷ 8 Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 4  KH2PO4: Bảng 2Bảng 1.2: Chỉ tiêu chất lượng của KH2PO4.  ZnSO4.7H2O: Bảng 3Bảng 1.3: Chỉ tiêu chất lượng của ZnSO4.7H2O. Độ tinh khiết ≥ 98% Zn ≥ 37% As ≤ 0.0005% Cl ≤ 0.2% Cd ≤ 0.001% Pb ≤ 0.001% Fe ≤ 0.008% pH 4  Chất sinh trưởng: biotin Chất sinh trưởng ở vi sinh vật là những chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật nhưng tự nó không thể tổng hợp được, chất sinh trưởng có hàm lượng rất nhỏ. Chất được xem là chất sinh trưởng cho vi sinh vật này có thể không phải là chất sinh trưởng cho vi sinh vật khác. Nhu cầu về chất sinh trưởng phụ thuộc vào môi trường sống, kiểu trao đổi chất của vi sinh vật. Trong bài này ta sử dụng chất sinh trưởng là biotin, tham gia vào coenzyme của các phản ứng chuyển nhóm cacboxylic và CO2 (có vai trò quan trọng trong chu trình Krebs). Độ tinh khiết 98% P2O5 ≥ 40% K2O ≥ 53% Pb ≤ 0.0001% As ≤ 0.0003% F ≤ 0.002% pH 8 ÷ 9 Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 5 Bảng 4 Bảng 1.4: Môi trường nuôi cấy thu nhận bào tử nấm mốc. Bảng 5 Bảng 1.5: Môi trường lên men thu nhận acid fumaric. Thành phần môi trường Glucose Urea KH2PO4 MgSO4.7H2O ZnSO4.7H2O Biotin pH 10g/l 2g/l 0.6g/l 0.25g/l 0.088g/l 20µg/l 5.0 Thành phần môi trường Glucose Urea KH2PO4 MgSO4.7H2O ZnSO4.7H2O Biotin pH 20g/l 2g/l 0.6g/l 0.25g/l 0.088g/l 20µg/l 5.0 Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 6 1.2. Giống vi sinh vật: Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng lên men tạo acid fumaric. Thường sử dụng là giống nấm mốc Rhizopus.  Giới : Fungi  Ngành : Zygomycota  Lớp : Zygomycetes  Phân lớp : Incertae sedis  Bộ : Mucorales  Họ : Mucoraceae  Giống : Rhizopus  Loại : Rhizopus oryzae 1.2.1. Sơ lược chung về giống Rhizopus:  Rhizopus là nấm sợi được tìm thấy nhiều trên đất, trái cây hoặc rau quả bị thối rửa. phân động vật và trên bánh mì. Rhizopus là loài gây bệnh phổ biến, chúng thường là nguyên nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm thậm chí gây chết người, một vài loài thì gây bệnh cho cây trồng.  Giống Rhizopus gồm có một vài loài, trong đó phổ biến là Rhizopus oryzae, Rhizopus azygosporus, Rhizopus microsporus, Rhizopus schipperae, and Rhizopus stolonifer.  Một vài hình thái đặc trưng của loài này là chiều dài của sợi rễ giả và của cuống mang bao tử, đường kính của túi bào tử, hình dạng của cuống …..  Sợi nấm có vách hoặc không có vách, đường kính 6-15 µm, cuống mang bào tử có màu nâu và thường không phân nhánh. Chúng có thể phát triển riêng lẻ hoăc thành từng cụm. Bào tử có đường kính 40-350 µm nằm trên ngọn của cuống mang bào tử. Cuống mang bào tử đường kính 4-11 µm cấu tạo đơn bào, trong suốt hoặc nâu, bề mặt nhẵn hoặc có nếp nhăn.  Loài Rhizopus phát triển nhanh chóng lấp đầy đĩa petri và trưởng thành sau 4 ngày, bề mặt giống như những sợi bông. Lúc đầu nó có màu trắng, sau đó chuyển sang màu xám rồi màu vàng nâu.  Nhiệt độ tối ưu thường 33oC- 40oC bắt đầu bị ức chế ở 45oC  Rhizopus thường được nuôi cấy, phát triển trên môi trường dịch thể giàu dinh dưỡng và có thông khí, hệ enzym amylase tương đối hoàn chỉnh, nên thường được dùng trong sản xuất rượu theo phương pháp amilose. 1.2.2. Rhizopus oryzae:  Hình thái và kích thước:  Khi phát triển mạnh trên môi trường thạch trong đĩa petri tạo thành một lớp như sợi bông lúc đầu màu trắng rồi nhanh chóng chuyển sang màu xám và phát triển thành những điểm nhỏ màu đen, khi trưởng thành sẻ tạo bào tử.  Sợi nấm trong suốt, đường kính 5-15 µm, giống như dải lụa, phân nhánh không có qui tắc, không có vách ngăn hoặc có vách ngăn nhưng thưa thớt.  Cuống mang bào tử và rễ giả trên thân của sợi nấm. Cuống mang bào tử dài 500 - 3500 µm hầu như không phân nhánh, màu vàng nâu đến nâu đậm. Bào tử có đường kính 50- 200 µm với cuống bào tử hình ellipse. Rễ giả có đường kính 150 - 300 µm có thể trong suốt hoặc màu nâu đậm, xuất hiện ở chổ giao giữa sợi nấm và cuống nấm mang bào tử. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 7  Một vài tính chất sinh lí:  Nhiệt độ tối ưu: 35oC.  pH tối ưu: 5.0  Rhizopus oryzae thể lên men nhiều loại đường như glucose, fructose đường nghịch đảo, saccharose, maltose … và các nguyên liệu khác như mật rỉ, tinh bột…  Sinh trưởng và phát triển bằng hình thức kí sinh hoặc hoại sinh.  Sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính (hình thành bào tử qua quá trình giảm phân), hữu tính (hình thành giao tử đực và giao tử cái). 1.2.3. Tiêu chuẩn chọn giống vi sinh vật:  Khả năng sinh độc tố thấp.  Tạo ra sản phẩm chính có hàm lượng vượt trội so với hàm lượng sản phẩm phụ.  Tốc độ sinh trưởng mạnh.  Hoạt tính trao đổi chất ổn định. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 8 PHẦN 2: QUI TRÌNH SẢN XUẤT 2.1. Sơ đồ qui trình sản xuất: Hình 2.1: Sơ đồ qui trình công nghệ. Nguyên liệu Chuẩn bị môi trường nhân giống Chuẩn bị môi trường lên men Tiệt trùng Tiệt trùng Nhân giống Giống VSV Lọc Bào tử Bã Lên men Hấp phụ Giải hấp phụ Kết tinh Ly tâm Sấy Chất thải lỏng Sản phẩm Bào tử Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 9 2.2. Thuyết minh qui trình: 2.2.1. Chuẩn bị môi trường:  Mục đích: chuẩn bị. Tạo ra hỗn hợp đầy đủ và cân đối các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV trong quá trình lên men.  Các nguyên tố cơ bản: C, H, O, N  Yếu tố sinh trưởng: biotin.  Các loại khoáng: đa lượng, vi lượng.  Các biến đổi:  Hóa học: có sự phân li thành các ion của các muối.  Hoá lý: sự hòa tan các chất vào môi trường tạo nên hệ đồng nhất.  Thiết bị phối trộn: Hình 2.2: Thiết bị phối trộn.  Cách thực hiện:  Cân chính xác riêng biệt từng thành phần dinh dưỡng của môi trường theo hàm lượng đã định.  Hòa tan các muối khoáng riêng sau đó bổ sung vào môi trường.  Trộn lẫn tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau theo tỉ lệ đã định, cho vào bồn phối trộn và thêm đủ thể tích nước cất.  Kiểm tra pH bằng máy đo pH và hiệu chỉnh về pH bằng 5.0.  Môi trường được giữ ở nhiệt độ 35oC.  Thông số công nghệ:  pH bằng 5.0.  Nhiệt độ 35oC. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 10 2.2.2. Tiệt trùng:  Mục đích: bảo quản, chuẩn bị. Tiêu diệt các VSV có trong môi trường sao cho ít làm biến đổi các thành phần của môi trường nhất.  Các biến đổi:  Vật lý: tạo gradient nhiệt độ, có sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng.  Hóa học: các thành phần trong môi trường có thể phản ứng với nhau.  Hóa lý: có sự bốc hơi nước.  Sinh học: các VSV bị tiêu diệt.  Hoá sinh: các enzym bị vô hoạt.  Thiết bị:  Thiết bị tiệt trùng dạng bản mỏng: Hình 2.3: Thiết bị tiệt trùng dạng bản mỏng.  Thiết bị gồm những tấm bản được đặt sát vào nhau. Độ dày của các tấm bản rất mỏng và trên bề mặt của chúng có các khe lồi lõm nhằm mục đích làm tăng bề mặt và hệ số truyển nhiệt. Khi ghép các tấm bản lại với nhau trên bộ khung của thiết bị sẽ tạo nên hệ thống đường dẫn vào và ra cho thực phẩm và chất tải nhiệt. Tuỳ theo năng suất của thiết bị và nhiệt độ thanh trùng, tiệt trùng cần đạt mà các nhà sản xuất sẽ chọn phương án bố trí sơ đồ dòng chảy thực phẩm và tác nhân nhiệt trong hệ thống thiết bị.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ: 121oC.  Thời gian: 10 phút. 2.2.3. Nuôi cấy trên môi trường thu nhận bào tử nấm mốc:  Mục đích: nhân giống. Thu nhận bào tử nấm sử dụng cho quá trình lên men. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 11  Các biến đổi:  Sinh học:  Tế bào nấm mốc phát triển tăng sinh khối, các sợi nấm mọc dài ra sau đó hình thành bào tử (con đường sinh sản vô tính).  Sự hoạt hóa và sinh tổng hợp enzym của nấm mốc.  Hóa sinh: các phản ứng xảy ra với sự tham gia của enzym do nấm mốc tổng hợp.  Vật lý: nhiệt độ tăng do quá trình trao đổi chất của nấm mốc.  Hóa lý: có sự bốc hơi nước do nhiệt độ tăng.  Thiết bị: Hình 2.4: Thiết bị nuôi cấy nấm mốc thu nhận bào tử.  Thể tích của bình nuôi cấy: 3m3 với thể tích hoạt động là 2m3  Tốc độ quay: 215 vòng/phút.  Điều kiện hiếu khí: không khí vô trùng được sục vào liên tục từ phía đáy thiết bị với vận tốc 2.0 lít/lít/phút.  Cách thực hiện:  Cho môi trường nuôi cấy thu nhận bào tử vào bình nuôi cấy có cánh khuấy trong điều kiện vô trùng.  Cấy bào tử giống vào môi trường nuôi cấy.  Môi trường nuôi cấy được sục khí liên tục để đảm bảo điều kiện nuôi cấy hiếu khí.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ: 35oC.  pH 5.0.  Thời gian nuôi cấy: 2 ngày. 2.2.4. Lọc:  Mục đích: Thu nhận bào tử dưới dạng huyền phù sử dụng cho quá trình lên men thu nhận acid fumaric.  Các biến đổi:  Khi dịch nuôi cấy đi qua thiết bị lọc phần chất lỏng có chứa bào tử sẽ đi qua màng lọc, các sợi nấm bị giữ lại trên màng lọc. Kết quả là ta thu được bào tử ở dạng huyền phù.  Vật lý: độ nhớt của pha lỏng thu được giảm. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 12  Hóa lý: có sự tách dịch nuôi cấy thành hai phần: phần lỏng là huyền phù bào tử, phần rắn là các sợi nấm trên màng lọc.  Thiết bị:  Thiết bị: thiết bị lọc ép sử dụng đĩa lọc. 1-cửa quan sát, 2-thân thiết bị, 3-đĩa lọc, 4-ống trung tân để thu hồi dịch lọc, 5-động cơ, 6-bộ phận truyền động, 7-khớp trục Hình 2.5: Thiết bị lọc ép sử dụng đĩa lọc.  Nguyên tắc hoạt động: đầu tiên bơm dịch sau khi nuôi cấy vào thiết bị. Các sợi nấm có kích thước lớn sẽ được giữ lại trên bề mặt vách ngăn của các đĩa lọc. Pha lỏng có chứa bào tử sẽ chui qua vách ngăn vào kênh dẫn ở bên trong đĩa lọc rồi chảy tập trung về ống thu hồi (4) để thoát ra ngoài. Trong quá trình lọc, ống thu hồi (4) và các đĩa lọc có thể xoay được nhờ động cơ (5).  Thông số công nghệ:  Kích thước lỗ của vách ngăn lọc được chọn: 240µm (vì bào tử có kích thước 50- 200µm). 2.2.5. Lên men:  Mục đích: chuyển hóa cơ chất (glucose) thành acid fumaric.  Các biến đổi:  Vật lý: nhiệt độ tăng do quá trình trao đổi chất của VSV.  Hóa học: hàm lượng cơ chất (glucose) và các thành phần dinh dưỡng giảm xuống, hàm lượng acid fumaric và các sản phẩm phụ như acid malic, ethanol, glycerol … tăng lên.  Hóa sinh: xảy ra các phản ứng do enzyme xúc tác.  Sinh học: sinh khối của nấm mốc tăng lên. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 13  Thiết bị:  Thiết bị lên men: rotating biological contactor. Hình 2.6: Rotating biological contactor.  Là thiết bị lên men dạng hình trụ có thể tích 20m3 với 9m3 hoạt động, đường kính 2,7m, dài 3,5m.  Trên trục có gắn các đĩa plastic, trục quay đươc nhờ một động cơ.  Các đĩa plastic chế tạo từ polysulfone có tác dụng như là chất mang cho nấm mốc, khi đĩa quay thì một phần đĩa nằm trong môi trường lên men, một phần nằm trong không gian phía trên chứa không khí.  Cơ chế sinh tổng hợp acid fumaric từ glucose: Hình 2.7: Con đường chuyển hóa glucose thành acid fumaric. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 14  Glucose được chuyển hóa thành pyruvic acid theo chu trình đường phân tạo ra 2 phân tử acid pyruvic và 2 ATP.  Theo nghiên cứu của Overman và Romano 1969, tiếp theo là tổng hợp acid oxaloacetic theo cơ chế C3 cộng C1 bằng cách gắn CO2 vào acid pyruvic nhờ xúc tác của enzyme pyruvate carboxylase. Sau đó là sự chuyển hóa acid oxaloacetic thành acid malic NAD-malate dehydrogenase và sự chuyển hóa acid malic thành acid fumaric nhờ enzyme fumarase.  Cũng theo nghiên cứu trong quá trình tổng hợp acid fumaric đã xảy ra đồng thời theo 2 con đường: citrate cycle và reductive carboxylation. (Kenealy et al. (1986))  Cách thực hiện:  Dùng 1m3 huyền phù bào tử có nồng độ 106 bào tử/ml cho vào thiết bị lên men chứa 8m3 môi trường lên men.  pH 5.0 được giữ trong suốt quá trình lên men bằng CaCO3.  Điều kiện nuôi cấy hiếu khí: không khí vô trùng được thổi vào khoảng không gian phía trên của thiết bị lên men với tốc độ 1lít/lít/phút.  Sau khoảng thời gian nuôi cấy nấm mốc sẽ phát triển thành một lớp màng trên bề mặt của các đĩa, khi đó môi trường sẽ đươc chuyển sang môi trường giới han N giới hạn, và không bổ sung CaCO3, dịch lên men sau đó được bơm vào vào thiết bị hấp phụ.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ nuôi cấy 35oC.  pH 5.0.  Tốc độ quay của đĩa là 20 vòng/phút.  Thời gian nuôi cấy 60h. 2.2.6. Hấp phụ:  Mục đích: khai thác. Tách acid fumaric từ dịch lên men.  Các biến đổi:  Hóa học: pH trong dịch lên men giảm do acid fumaric bị hấp phụ lên nhựa, nồng độ acid fumaric trên nhựa tăng lên rồi bão hòa.  Vật lý: có sự ma sát giữa dòng lưu chất và cột hấp phụ.  Hóa lý: sự hấp phụ của acid fumaric lên bề mặt nhựa. Công nghệ lên men thực phẩm Acid Fumaric 15  Thiết bị: Hình 2.8: Cột hấp phụ.  Đường kính cột: đường kính trong 0.2m, đường kính ngoài 0,22m.  Chiều dài cột: 1.5m.  Số lượng cột hấp thu: 3 cột.  Cách thực hiện: cho nhựa hấp phụ PVP-425 vào cột hấp phụ, nhựa đươc cố định lên bề mặt trong của cột. Dịch lên men chứa acid fumaric được bơm tuần hoàn vào cột hấp phụ, acid fumaric được hấp phụ lên nhựa cho đến khi cột hấp phụ bão hòa (k