Đề tài Công nghệ lên men: Sản xuất phenylalanine

Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 1 MỤC LỤC 1. TỔNG QUAN VỀ PHENYLALANINE .................................................................................... 3 2. NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG ..................................................................................................... 5 2.1. Nguyên liệu sản xuất phenylalanine ............................................................................................ 5 2.2. Nguyên liệu phụ ............................................................................................................................. 7 2.3. Vi sinh vật ....................................................................................................................................... 9 2.3.1. Yêu cầu chọn giống ..................................................................................................... 9 2.3.2. Chọn giống vi sinh vật ................................................................................................. 9 2.3.2.1. Đặc điểm của E. coli ........................................................................................... 10 2.3.2.2. Nguồn dinh dưỡng E. coli có thể sử dụng được ................................................. 10 2.3.2.3. Tổng hợp phenylalanine ở E.coli ........................................................................ 11 3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ ..................................................................................................... 13 4. GIẢI THÍCH QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ ............................................................................... 15 4.1. Chuẩn bị nguyên liệu ................................................................................................................... 15 4.1.1. Làm sạch .................................................................................................................... 15 4.1.2. Nghiền ........................................................................................................................ 16 4.2. Thủy phân ..................................................................................................................................... 17 4.2.1. Hồ hóa ........................................................................................................................ 17 4.2.2. Dịch hóa ..................................................................................................................... 17 4.2.3. Đường hóa .................................................................................................................. 17 4.3. Chuẩn bị môi trường .................................................................................................................... 18 4.4. Nhân giống .................................................................................................................................... 19 4.5. Lên men ......................................................................................................................................... 19 4.6. Tách sinh khối .............................................................................................................................. 21 4.7. Trao đổi ion và nhả hấp phụ ....................................................................................................... 22 4.8. Cô đặc chân không ....................................................................................................................... 24 4.9. Kết tinh .......................................................................................................................................... 26 4.10. Ly tâm tách tinh thể ..................................................................................................................... 27 4.11. Sấy ................................................................................................................................................. 28 4.12. Đóng gói ........................................................................................................................................ 28 Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 2 5. SẢN PHẨM .............................................................................................................................. 29 6. THÀNH TỰU ........................................................................................................................... 31 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Công thức cấu tạo phenylalanine .......................................................................................... 3 Hình 2: Hạt bắp .................................................................................................................................. 5 Hình 3: Cấu tạo của hạt bắp ............................................................................................................... 6 Hình 4: Vi khuẩn E.coli ................................................................................................................... 10 Hình 5: Sơ đồ tổng quan về các phản ứng trong trung tâm trao đổi chất của E. coli ...................... 11 Hình 6: Con đường sinh tổng hợp acid amin vòng thơm trong E. coli ............................................ 12 Hình 7: Sơ đồ khối quy trình lên men tạo phenylalanine ................................................................ 13 Hình 8: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch phenylalanine ..................................................................... 14 Hình 9: Thiết bị làm sạch ................................................................................................................. 15 Hình 10: Cấu tạo của máy nghiền búa ............................................................................................. 16 Hình 11: Thiết bị thủy phân ở áp suất cao ....................................................................................... 18 Hình 12: Bốn giai đoạn trong sản xuất L-phenylalanine có tính chất khác nhau cần kiểm soát khác nhau để thu được sản lượng cao trong thời gian ngắn nhất ............................................................. 20 Hình 13: Cấu tạo thiết bị lên men .................................................................................................... 20 Hình 14: Thiết bị lên men ................................................................................................................ 20 Hình 15: Máy ly tâm siêu tốc loại ống ............................................................................................. 22 Hình 16: Các hạt nhựa trao đổi ion trong thiết bị trao đổi ion ......................................................... 23 Hình 17: Thiết bị trao đổi ion .......................................................................................................... 24 Hình 18: Sơ đồ thiết bị cô đặc nhiều nồi ......................................................................................... 25 Hình 19: Thiết bị kết tinh bằng phương pháp làm lạnh ................................................................... 27 Hình 20: Thiết bị ly tâm lọc ............................................................................................................. 27 Hình 21: Thiết bị sấy chân không .................................................................................................... 28 Hình 22: Phenylalanine ở dạng bột .................................................................................................. 29 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hàm lượng phenylalanine trong một số thực phẩm (g/100g thực phẩm) ............................ 4 Bảng 2: Cấu tạo của hạt bắp so với khối lượng của toàn hạt ............................................................. 6 Bảng 3: Thành phần hóa học của hạt bắp .......................................................................................... 6 Bảng 4: Thành phần acid amin trong protein bắp (g acid amin/16g N) ............................................ 7 Bảng 5: Nhiệt độ hồ hóa của bắp và một số tinh bột khác ................................................................. 7 Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men ..................................................... 7 Bảng 7: Chỉ tiêu sản phẩm phenylalanine ........................................................................................ 29 Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 3 1. TỔNG QUAN VỀ PHENYLALANINE L-Phenylalanine (phenylalanine) là acid amin mạch vòng có một nhóm (−NH2) và một nhóm (−COOH) trong phân tử, có công thức cấu tạo: Hình 1: Công thức cấu tạo phenylalanine Một số tính chất vật lý của phenylalanine: - Công thức phân tử: C9H11NO2 - Tinh thể màu trắng, bền ở nhiệt độ ở 20 - 25oC - Phổ hấp thu: 280nm - Điểm đẳng điện pI: 5,5 - Điểm nóng chảy: 270 - 275oC - Tỷ trọng: 0,754 - Hòa tan trong H2O, không màu - Độ hòa tan nước: 1-5g/100 ml ở 25ºC - Tính ổn định: ổn định trong điều kiện bình thường. Không bền với các tác nhân ôxi hóa mạnh. Phenylalanine là một trong tám acid amin không thay thế, cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp được mà phải lấy từ các nguồn bên ngoài. Đối với cơ thể người nhu cầu là 4,4g/người/ngày. Từ những năm 1980 đến nay nhu cầu về phenylalanine ngày càng tăng. Trước đây người ta sản xuất phenylalanine bằng phương pháp enzyme, từ cuối năm 1996 tại Trung Quốc phenylalanine được sản xuất bằng phương pháp lên men. Việc sản xuất phenylalanine trên thế giới chủ yếu tập trung ở Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, Tây Âu. Nhu cầu phenylalanine trên thế giới 3,06.108kg/năm Phenylalanine được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và sản xuất aspartame. L-phenylalanine có trong một số loại thực phẩm như thịt bò, cá, đậu nành, sữa, trứng… Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 4 Bảng 1: Hàm lượng phenylalanine trong một số thực phẩm (g/100g thực phẩm) Phenylalaninne food sources Phenylalanine content (grams/100 gram food) Soybeans, mature seeds, raw 1,91 Cowpea, catjang, mature seeds, raw 1,39 Lentils, raw 1,38 Peanuts, all types, raw 1,34 Nuts, almonds 1,15 Chickpeas (garbanzo beans, bengal gram), mature seeds, raw 1,03 Flax seed, raw 0,96 Seeds, sesame butter, tahini, from raw and stone ground kernels 0,94 Salami, Italian, pork 0,94 Beef, round, top round, separable lean and fat, trimmed to 1/8" fat, select, raw 0,88 Beef, top sirloin, separable lean only, trimmed to 1/8" fat, choice, raw 0,87 Crustaceans, shrimp, mixed species, raw 0,86 Chicken, broilers or fryers, thigh, meat only, raw 0,78 Fish, salmon, pink, raw 0,78 Nuts, walnuts, english 0,71 Chicken, broilers or fryers, wing, meat and skin, raw 0,70 Egg, white, raw, fresh 0,69 Egg, whole, raw, fresh 0,68 Egg, yolk, raw, fresh 0,68 Sausage, Italian, pork, raw 0,48 Milk, sheep, fluid 0,28 Hummus 0,26 Pork, fresh, separable fat, raw 0,22 Milk, goat, fluid 0,16 Soy milk, fluid 0,15 Milk, whole, 3,25% milkfat 0,15 Asparagus 0,08 Snap beans, green, raw 0,07 Milk, human, mature, fluid 0,05 Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 5 2. NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG 2.1. Nguyên liệu sản xuất phenylalanine Để sản xuất phenylalanine ta có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu như: gạo, bắp, mật rĩ… Trong bài này chúng tôi trình bày phương pháp sản xuất phenylalanine từ bắp. Hình 2: Hạt bắp Bắp có nguồn gốc từ Nam Mỹ, những khu vực nóng như Amazon, Peru và được coi như là một loại cây trồng dùng cho chăn nuôi, sau đó được gieo trồng khắp nơi và trở thành một loại lương thực thực phẩm chủ yếu ở nhiều nước. Bắp được chia làm 6 loại: - Bắp đá: hạt có màu vàng, trắng ngà hoặc có màu tím, hạt rất cứng, dùng để sản xuất bột bắp. - Bắp bột: hạt màu vàng, trắng, dùng để sản xuất bột bắp. - Bắp răng ngựa: hạt có hình dạng giống răng ngựa, vàng, dùng sản xuất bột bắp. - Bắp đường: vỏ nhăn nheo, màu vàng, trắng, hàm lượng đường, protein rất cao, chủ yếu để sản xuất dịch đường glucose. - Bắp rỗ: đầu hơi nhọn, hạt cứng, cũng dùng để sản xuất bột bắp. - Bắp nếp: trắng đục, dạng đầu tròn, khi nấu chín dẻo dính. 2.1.1. Cấu tạo Cấu tạo hạt bắp gồm có 5 thành phần chính là: tầng vỏ, lớp biểu bì, phôi, nội nhũ và mũ hạt. Ngoài ra đầu dưới của hạt còn có gốc hạt liền với lõi. Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 6 Hình 3: Cấu tạo của hạt bắp Bảng 2: Cấu tạo của hạt bắp so với khối lượng của toàn hạt Các phần của hạt bắp Tỉ lệ về khối lượng so với toàn hạt (%) Tầng vỏ hạt 6 – 9 Lớp biểu bì 6 – 8 Nội nhũ 70 – 78 Phôi 8 – 15 2.1.2. Thành phần hóa học - Vỏ hạt bắp chủ yếu là cellulose. - Nội nhũ là phần tập trung hầu hết tinh bột bắp. - Tinh bột là nguồn carbohydrate chính của bắp chứa khoảng 72% amylose, 28% amylopectin. - Protein trong bắp bao gồm zein chiếm khoảng 39%, globulin khoảng 10%, glutelin khoảng 30% và albumin chiếm khoảng 7%. Bảng 3: Thành phần hóa học của hạt bắp Thành phần hóa học Vỏ hạt (%) Nội nhũ (%) Phôi (%) Protein 3,7 8,00 18,40 Chất béo 1,00 0,80 33,20 Cellulose 86,70 2,70 8,80 Tro 0,80 0,30 10,50 Tinh bột 7,30 87,60 8,30 Đường 0,34 0,62 10,80 Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 7 Bảng 4: Thành phần acid amin trong protein bắp (g acid amin/16g N) (Theo Rinson và Hartwing 1977) Amino acid Tỷ lệ Arginine 3,7 Histidine 2,4 Lysine 2,6 Tyrosine 3,6 Triptophane 0,6 Phenylalanine 4,1 Threonine 3,0 Methyonine 1,6 Cystine 1,3 Leucine 11,2 Valine 3,9 Glycine 2,9 Glutamic acid 14,1 Bảng 5: Nhiệt độ hồ hóa của bắp và một số tinh bột khác Tinh bột tự nhiên Nhiệt độ hồ hóa (t0C) Bắp 62 – 73 Bắp nếp 62 – 72 Lúa miến 68 – 75 Lúa miến nếp 67 – 74 Gạo 68 – 74 Lúa mì 59 – 62 Sắn 52 – 59 Khoai tây 59 – 70 2.2. Nguyên liệu phụ 2.2.1. Dịch chiết nấm men Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men Thành phần Hàm lượng Protein 27,8g Carbohydrate 11,8g Nước 37g Tro 23,4 Vitamin Khoáng Thiamin 9,7mg Ca 86mg Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 8 Riboflavin 14,3mg Fe 3,7mg Vitamin B6 1,3mg Mg 180mg Folate 1010mcg Phospho 104mg Vitamin B12 0,5mcg K 2600mg Choline 65,1 mg Na 3600mg Zn 2,1mg Cu 0,3mg Se 18mcg 2.2.2. Tryptone Nitơ tổng 11 -12 % Nitơ amin ≥ 3,5% Protein ≥ 70% E.Coli Không có Samonella Không có pH 6,5 – 7,2 2.2.3. Tyrosine Độ tinh khiết 98,5% Cl ≤ 0,04% SO4 ≤ 0,04% Fe ≤ 30 ppm Pb ≤ 15ppm 2.2.4. K2HPO4 Màu sắc Màu trắng Độ tinh khiết 98% P2O5 ≥ 40% K2O ≥ 53% pH 8,0 – 9,0 Pb ≤ 0,001% As ≤ 0,0003% F ≤0,002% 2.2.5. MnSO4.H2O Độ tinh khiết 98% Mn ≥ 31,8% Fe ≤ 0,004% Pb ≤ 15 ppm As ≤ 5 ppm Cd ≤ 10 ppm Cl ≤ 0,005% pH 5,0 – 6,5 Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 9 2.2.6. MgSO4.7H2O Độ tinh khiết 99,5% Fe ≤ 0,0015% Pb ≤ 0,0005% Cl ≤ 0,01% As ≤ 0,0004% pH 6,5 2.3. Vi sinh vật 2.3.1. Yêu cầu chọn giống - Khả năng sinh độc tố: không có. - Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính: sản lượng phenylalanine tạo thành là lớn nhất. - Khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng : dễ nuôi cấy, thích nghi tốt với môi trường, tốc độ sinh sản nhanh. - Điều kiện nuôi cấy: môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền. 2.3.2. Chọn giống vi sinh vật Trong thiên nhiên, có nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp phenylalanine, nhưng số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nhiều phenylalanine để sử dụng trong qui mô sản xuất công nghiệp là không nhiều. Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin do chúng tự tổng hợp được thường đủ đáp ứng yêu cầu bản thân nhưng trong điều kiện không bình thường nào đó lượng các acid amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào hay thoát ra ngoài môi trường. Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinh vật. Để thu nhận phenylalanine từ vi sinh vật ở quy mô công nghiệp, cần phải tiến hành phân lập giống, tuyển chọn, gây đột biến, chọn điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp. Chọn loài vi sinh vật tích lũy được nhiều acid amin là khâu quan trọng nhất. Người ta đã xác định nhiều loài vi sinh vật tổng hợp được phenylalanine với lượng khác nhau. Trong số đó đáng kể là vi khuẩn và nấm men có thể tổng hợp được một lượng khá lớn phenylalanine, tiêu biểu là các loài: • Corynebacterium glutamicum • Corynebacterium equi • Brevibacterium flavum • Escherichia coli (E. coli) • Rhodotorula rubra • Bacillus lactofermentum • Candida boidinii Hiện nay, người ta tạo ra được các chủng E.coli tái tổ hợp, đột biến có khả năng tổng hợp phenylalanine cao. Các tác nhân gây đột biến có thể là tác nhân vật lý như tia bức xạ ion hóa hay tác nhân hóa học, sử dụng các chất oxy hóa mạnh như etylen hoặc các chất gây đồng vị phóng xạ mạnh. Qua khâu đột biến ta thu dược những chủng mới có khả năng tổng hợp phenylalanine cao như là E.coli đột biến dị dưỡng tyrosine. Trong bài này chúng tôi sẽ giới thiệu việc sử dụng thể E.coli đột biến dị dưỡng tyrosine để sản xuất phenylalanine. Escherichia coli đột biến dị dưỡng tyrosine (E.coli W3110). Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 10 2.3.2.1. Đặc điểm của E. coli Vực (domain): Bacteria Ngành (phylum): Proteobacteria Lớp (class): Gamma Proteobacteria Bộ (ordo): Enterobacteriales Họ ( familia): Enterobacteriaceae Chi (genus): Escherichia Loài (species): E. coli - Gram âm, kỵ khí tùy tiện, không sinh bào tử. - Tế bào hình que dài khoảng 2 μm, đường kính 0,5 μm, thể tích tế bào 0,6 – 0,7 μm3. - Là vi sinh vật ưa ấm, có thể sống trong khoảng nhiệt độ 70C-500C, nhiệt độ gây chết 600C- 650C trong 1 phút - Topt 370C, pH = 4,4 - 8,5 - Độ ẩm tối thiểu: aw = 0,91 - Có thể sử dụng nhiều cơ chất khác nhau. - Sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí dùng nhiều cặp oxy hóa khử khác nhau, bao gồm sự oxi hóa pyruvic acid, formic acid, hydroge, amino acids và sự giảm cơ chất như oxygen, nitrate, dimethyl sulfoxide và trimethylamine N-oxide. 2.3.2.2. Nguồn dinh dưỡng E. coli có thể sử dụng được  Nguồn cacbon: Glucose, lactose, mannitol, maltose, fructose, galactose, sorbitol, glycerol, acid cinamic.  Nguồn nitơ:  Vô cơ: ammonia, nitrate, NH4Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2-H-citrate  Hữu cơ: peptone, L-asparagine, adenine, adenosine, agmatine, L- and D-alanine, allantoin (anaerobically), [gamma]-aminobutyrate, arginine, aspartate, cytidine, cytosine, glucosamine, glutamine, glutamate, glycine, ornithine, proline, putrescine, L- and D-serine, threonine.  Nguồn khoáng: KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4.12H2O, MgSO4.7H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O, ZnCl2.7H2O, MnSO4, CuSO4.5H2O, Mo7O2.4H2O, Co(NO3)  Các chất sinh trưởng: Folic acid, Biotin, Pyridoxine (B6), Riboflavin (B2), Thiamine (B1), Vitamin K, Vitamin B12, Nicotinic acid, Pantothenic acid, thymine. Hình 4: Vi khuẩn E.coli Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 11 2.3.2.3. Tổng hợp phenylalanine ở E.coli Hình 5: Sơ đồ tổng quan về các phản ứng trong trung tâm trao đổi chất của E. coli Chữ viết tắt được sử dụng: PTS: phosphoenolpyruvate phosphotransferase system Tkt: transketolase G6Pdh:glucose-6-phosphate dehydrogenase Tal: transaldolase Pgi: phosphoglucose isomerase Ppc: PEP-carboxylase Pyk: pyruvate kinase Pyk: PEP carboxykinase Pps: PEP synthetase G6P: glucose 6-phosphate F6P: fructose 6-phosphate GA3P: glyceraldehyde 3-phosphate PEP: phosphoenolpyruvate OAA: oxaloactetate 6P-Gnt: 6-phosphogluconate Rul5P: ribulose 5-phos-phate Rib5P: ribose 5-phosphate Xul5P: xylulose 5-phosphate Sed7P: sedoheptulose 7-phosphate E4P: erythrose 4-phosphate Phenylalanine GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 12 Hình 6: Con đường sinh tổng hợp acid amin vòng thơm trong E. coli Để chỉ ra