Đề tài Công nghệ lên men: Tổng hợp sắc tố carotenoid từ Rhodotorula sp

COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 1 - MỤC LỤC Mục lục ............................................................................................................................................ 1 Danh mục bảng ................................................................................................................................ 2 Danh mục hình................................................................................................................................. 3 Lời mở đầu....................................................................................................................................... 4 I. Giới thiệu về Carotenoid ............................................................................................................. 5 1.1 Phân bố ................................................................................................................................ 5 1.2 Phân loại .............................................................................................................................. 6 II. Nguyên liệu ................................................................................................................................. 6 2.1 Thành phần nguyên liệu ...................................................................................................... 6 2.2 Mô tả nguyên liệu ................................................................................................................ 6 III. Giống vi sinh vật ........................................................................................................................ 9 3.1 Giới thiệu giống vi sinh vật ................................................................................................. 9 3.2 Hình thái ............................................................................................................................ 10 3.3 Sinh lý ............................................................................................................................... 11 3.4 Sinh sản .............................................................................................................................. 11 3.5 Tiêu chí chọn giống ........................................................................................................... 12 IV. Quy trình công nghệ ................................................................................................................ 12 4.1 Sơ đồ khối .......................................................................................................................... 12 4.2 Thuyết minh quy trình ....................................................................................................... 12 4.2.1 Chuẩn bị môi trường ................................................................................................. 12 4.2.2 Tiệt trùng .................................................................................................................. 14 4.2.3 Hoạt hóa giống, nhân giống ...................................................................................... 15 4.2.4 Lên men .................................................................................................................... 15 4.2.5 Ly tâm tách sinh khối ............................................................................................... 18 4.2.6 Đồng hóa ................................................................................................................... 20 4.2.7 Trích ly ..................................................................................................................... 21 4.2.8 Lọc ............................................................................................................................ 22 4.2.9 Cô đặc chân không ................................................................................................... 23 4.2.10 Sấy phun ................................................................................................................. 23 V. Chỉ tiêu ...................................................................................................................................... 25 5.1 Vật lý ................................................................................................................................. 25 5.1.1 Dạng tồn tại .............................................................................................................. 25 5.1.2 Tính hấp thu ánh sáng ............................................................................................... 25 5.1.3 Nhiệt độ nóng chảy ................................................................................................... 26 5.1.4 Tính tan ..................................................................................................................... 26 5.1.5 Màu sắc ..................................................................................................................... 26 5.2 Hóa lý ................................................................................................................................ 26 5.3 Sinh học ............................................................................................................................. 26 5.3.1 Vai trò ....................................................................................................................... 27 5.3.2 Tính miễn dịch .......................................................................................................... 27 5.3.3 Tác dụng chống sự lão hóa ....................................................................................... 27 VI. Thành tựu ................................................................................................................................ 27 VII. Tài liệu tham khảo .................................................................................................................. 29 COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 2 - Danh mục bảng Bảng 1: Sự phân bố và đặc điểm của carotenoid ở các sinh vật ...................................................... 5 Bảng 2: Thành phần hóa học chính trong mật rỉ đường mía (tính theo % chất khô) ...................... 6 Bảng 3: Thành phần tro trong mật rỉ (tính theo % khối lượng của tro) ........................................... 6 Bảng 4: Thành phần vitamin trong mật rỉ (tính theo μg/g rỉ đường) ............................................... 6 Bảng 5: Thành phần chất chiết men ................................................................................................ 7 Bảng 6: Thành phần chất chiết malt ............................................................................................... 7 Bảng 7: Thành phần của KH2PO4 thương phẩm .............................................................................. 8 Bảng 8: Thành phần hóa học của K2HPO4 ...................................................................................... 8 Bảng 9: Thành phần của (NH4)2SO4 ................................................................................................ 9 Bảng 10: Một vài loài sinh tổng hợp chất màu carotenoid ............................................................ 10 Bảng 11: Thành phần các chất màu carotenoid được tổng hợp bởi các chủng Rhodotorula ....... 18 Bảng 12: Khả năng hấp thụ ánh sáng của một số carotenoid ........................................................ 25 Bảng 13: Khả năng tạo chất màu carotenoid bởi Rhodotorula rubra GED8 và chủng đột biến Rhodotorula rubra 56 – 13 trong môi trường glucose và lactose ................................................. 28 COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 3 - Danh mục hình Hình 1: Tảo ...................................................................................................................................... 5 Hình 2: Cà chua ............................................................................................................................... 5 Hình 3: Rhodotorula sp. .................................................................................................................. 9 Hình 4: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC - 20 ................................................................................ 14 Hình 5: Thiết bị lên men có bộ đảo trộn dạng sủi bọt ................................................................... 16 Hình 6: Con đường sinh tổng hợp carotenoid ............................................................................... 17 Hình 7: Máy ly tâm siêu tốc loại ống ............................................................................................ 19 Hình 8: Thiết bị đồng hóa .............................................................................................................. 20 Hình 9: Thiết bị trích ly liên tục dạng trục vis ............................................................................... 21 Hình 10: Sơ đồ thiết bị lọc chân không dạng thùng quay tác động liên tục .................................. 22 Hình 11: Thiết bị cô đặc một nồi ................................................................................................... 23 Hình 12: Sơ đồ hệ thống sấy phun................................................................................................. 24 Hình 13: Thiết bị sấy phun ............................................................................................................ 25 Hình 14: Chuyển hóa β-carotene thành vitamin A ........................................................................ 27 COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 4 - Lôøi môû ñaàu Xaõ hoäi ngaøy caøng phaùt trieån keùo theo söï phaùt trieån cuûa caùc ngaønh khoa hoïc kó thuaät. Coâng ngheä sinh hoïc ñaõ vaø ñang trôû thaønh moät trong nhöõnh ngaønh ñöôïc quan taâm haøng ñaàu treân theá giôùi noùi chung vaø ôû Vieät Nam noùi rieâng. Coâng ngheä sinh hoïc phaùt trieån nhanh choùng ñang taïo ra moät cuoäc caùch maïng sinh hoïc trong caùc ngaønh noâng nghieäp vaø coâng nghieäp thöïc phaåm, laøm thay ñoåi phöông thöùc saûn xuaát trong caùc ngaønh y döôïc, naêng löôïng khai thaùc khoaùng vaø moâi tröôøng… Ñoái vôùi Vieät Nam, moät ñaát nöôùc noâng nghieäp thì vieäc öùng duïng, xöû lyù vaø taùi cheá caùc nguoàn pheá phuï phaåm töø ñoäng vaät vaø thöïc vaät trong caùc ngaønh saûn xuaát noâng nghieäp vaø coâng nghieäp thöïc phaåm để làm bieán ñoåi nhöõng nguoàn nguyeân lieäu reû tieàn này taïo ra nhöõng saûn phaåm coù chaát löôïng cao, giaûm nguy cô oâ nhieãm moâi tröôøng mang laïi hieäu quaû kinh teá cho xaõ hoäi đang ngày càng được ưu tiên. Hằng ngày cơ thể chúng ta hấp thu rất nhiều loại chất dinh dưỡng khác nhau. Bên cạnh những dưỡng chất quan trọng như nước, protein, lipit, carbonhydrate, cơ thể chúng ta cũng cần được cung cấp một lượng khoáng, vitamin cho cơ thể phát triển cân đối. Trong đó chúng ta đặc biệt quan tâm tới thành phần vitamin trong thực phẩm được sử dụng. Và một trong những nhóm vitamin không thể thiếu trong các bữa ăn hằng ngày có thể kể đến là vitamin A. Vitamin A coù vai troø raát quan troïng ñoái vôùi söï soáng cuûa con ngöôøi noùi chung vaø giôùi ñoäng vaät noùi rieâng. Nguoàn nguyeân lieäu thöïc vaät vaø vi sinh vaät ñöôïc xem laø caùc nguoàn cung caáp doài daøo saéc toá carotenoid (nguồn gốc tạo tiền chất cho quá trình tổng hợp vitamin A). Vaø moät trong raát ít gioáng naám men coù khaû naêng toång hôïp ñöôïc saéc toá carotenoid laø Rhodotorula sp. Ñaõ coù nhieàu coâng trình ngieân cöùu veà khaû naêng sinh toång hôïp saéc toá carotenoid treân caùc nguoàn cô chaát khaùc nhau, vôùi caùc phöông phaùp nuoâi caáy khaùc nhau: nhö nuoâi caáy giaùn ñoaïn, baùn lieân tuïc, leân men dòch theå, leân men baùn raén…chæ töø gioáng Rhodoturula sp hay nuoâi caáy keát hôïp vôùi moät chuûng vi sinh vaät khaùc nhö: naám men, naám moác, vi khuaån…Những nghiên cứu này hiện nay cũng đang được ứng dụng khá nhiều trong công nghiệp và không ngừng phát triển trong tương lai… COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 5 - I. GIỚI THIỆU VỀ CAROTENOID Carotenoids laø nhoùm chaát maøu hoøa tan trong chaát beùo coù trong luïc laïp, trong quaû và rau maøu coù maøu da cam, maøu vaøng vaø maøu ñoû. Có khoảng hơn 600 loại Carotenoid tồn tại trong tự nhiên. Chuùng raát phoå bieán vaø ñöôïc taïo ra raát nhieàu trong töï nhieân. Ngöôøi ta öôùc tính raèng haøng naêm coù treân 100 trieäu taán caroteoid ñöôïc saûn sinh ra trong töï nhieân. Phaàn lôùn löôïng naøy ôû daïng fucoxanthin (trong taûo), vaø trong 3 carotenoid chính của laù caây laø lutein, violaxanthin vaø neoxanthin. Coøn laïi tuy chieám löôïng nhoû hôn nhöng hieän dieän khaép nôi laø β-carotene vaø zeaxanthin. Nhöõng saéc toá khaùc laø lycopene (caø chua), capsanthin (tieâu ñoû), bixin (ñieàu). Hình 1: Tảo Hình 2: Cà chua 1.1 Phaân boá: Baûng 1: Sự phân bố và đặc điểm của carotenoid ở các sinh vật Nguoàn goác Ñaëc ñieåm Thöïc vaät  Carotenoid thöôøng toàn taïi ôû phaàn dieäp luïc cuûa moâ xanh, maøu cuûa chuùng bò che laáp bôûi maøu cuûa chorophyll.  Haøm luôïng carotenoid haàu nhö gioáng nhau ôû caùc loaøi laù caây: β-carotene (25-30%), lutein (khoaûng 45%), violaxanthin (15%), neoxanthin (15%) trên tổng số khối lượng carotenoid. Ngoaøi ra coøn coù moät löôïng nhoû α-carotene, α vaø β-cryptoxanthin, zeaxanthin, atheraxanthin, lutein – 5, 6 – epoxdide. Carotenoid cuõng phaân boá trong caùc moâ thöôøng (khoâng coù phaûn öùng quang hôïp) taïo ra maøu vaøng, cam, ñoû cho hoa quaû nhö caø chua, caø roát, bí ñoû… Ñoäng vaät  Carotenoid taïo maøu vaøng, ñoû cho loâng caùnh caùc loaøi chim; taïo maøu loâng vaø da vaøng cho gaø con, taïo maøu ñoû cho loøng ñoû tröùng.  Trong moät soá ñoäng vaät bieån nhö toâm huøm, cua… toàn taïi moät daïng phöùc hôïp giöõa carotenoid vaø protein goïi laø carotenoprotein luùc coøn soáng coù maøu xanh laù, tím hoaëc xanh döông; nhöng khi naáu chín protein bò bieán tính maøu ñoû cuûa carotenoid môùi hieän ra. Vi sinh vaät  Carotenoid laø chaát maøu noäi baøo cuûa moät soá caùc loaøi vi sinh vaät nhö: vi khuaån (Brevibacterium tạo canthaxanthin, Flavobacterium taïo zeaxanthin), naám men (Rhodotorula sp.), naám moác (Neurospora Crassa, Mucorals choanophoracea), taûo (Dunadiella). COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 6 - 1.2 Phaân loaïi Carotenoids ñöôïc caáu taïo töø 8 ñôn vò isoprene lieân tieáp nhau ôû trung taâm cuûa phaân töû taïo neân caáu truùc ñoái xöùng, coù theå chia laøm hai nhoùm chính: - Carotenes : goàm caùc hydrocarbon carotenoid (C40H56) - Xanhthophylls: goàm caùc daãn xuaát coù nhoùm chöùa chöùa oxy nhö keto, epoxy, methoxy, acid cuûa carotenoid. (C40H56O2) II. NGUYEÂN LIEÄU 2.1 Thaønh phaàn nguyeân lieäu • Mật rỉ đường mía • Chất chiết nấm men • Chất chiết malt • KH2PO4 • K2HPO4 • (NH4)2SO4 2.2 Moâ taû nguyeân lieäu  Mật rỉ đường mía Nguồn cacbon sử dụng là mật rỉ đường, có hàm lượng chất khô 75 -83 % khối lượng, pH = 4.5-6 Bảng2: Thành phần hóa học chính trong mật rỉ đường mía (tính theo % chất khô) Succrose 32 - 45 Glucose 5 - 11 Fructose 6 - 15 Lượng đường tổng 52 - 65 Nitơ tổng 0.4 -1.5 Tro 7 - 11 Binkley and Wolfrom (1953) ; Wiley (1954), p.314; Olbrich (1956),p.12;Ruter (1975); Paturau (1989) Bảng3 : Thành phần tro trong mật rỉ (tính theo % khối lượng của tro) Na2O 0.3 - 9 CaO 7 – 15 MgO 2-14 P2O5 0.5 – 2.5 SO3 7 -27 SiO2 1-7 K2O 30 – 50 Olbrich (1963), p.540, Chen and Chou (1993), p. 408 Ngoaøi ra, ra trong maät ræ coøn coù chöùa moät soá vitamin Baûng 4: Thaønh phaàn vitamin trong maät ræ (tính theo μg/g ræ ñöôøng) Thiamine 8.3 Riboflavine 2.5 Nicotimic acid 21 Pantothenic acid 21.4 COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 7 - Folic acid 0.038 Pyridocine 6.5 Biotin 12 Mật rỉ trước khi dùng pha chế môi trường phải được xử lý để phá hệ keo và màu sẫm của mật rỉ. Hệ keo của mật rỉ do protein và pectin hình thành. Hệ keo thường tạo độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Nếu hệ keo không được phá đi sẽ gây hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, sinh khối nấm men thu nhận sẽ bám đầy vào các chất keo này dẫn đến khó làm sạch sản phẩm. Keo càng nhiều, khả năng hòa tan của oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng kém. Màu sẫm bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men có màu vàng thẫm, không phải màu tự nhiên của nấm. Ngoài ra rỉ đường cũng là môi trường dinh dưỡng khá lý tưởng cho vi sinh vật xâm nhập và phát triển. Để xử lý hệ keo và màu sẫm của mật rỉ, người ta sử dụng 3.5kg acid sunfuric đậm đặc cho một tấn mật rỉ. Khi cho H2SO4 vào mật rỉ, có ba cách thực hiện quá trình xử lý này. Cách thứ nhất: Khi cho 3.5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy đều ở nhiệt độ thường trong 24h, sau đó ly tâm thu dịch đường. Cách thứ hai: Khi cho 3.5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun toàn bộ lên 850C và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch đường Cách thứ ba: cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt giá trị 4, người ta đun nóng đến 120 – 1250C trong một phút để các chất vô cơ kết tủa, đó ly tâm thu dịch đường. Dịch đường sau khi xử lý được pha chế thành môi trường có nồng độ phù hợp cho quá trình lên men thu sinh khối.  Chất chiết nấm men Bảng5: Thaønh phaàn chaát chieát men Tiêu chuẩn Paste nấm men bia Bột nấm men bia Màu Vàng nâu Bột vàng sáng Tổng N, % KL chất khô ≥ 7 ≥ 9 Nitơ amin, % KL chất khô ≥ 3 ≥ 3.5 Chất khô ,% KL chất khô ≥ 65 ≥ 94 NaCl, % KL chất khô ≤ 4 ≤ 4 pH 5 – 6.5 5 – 6.5 Tro % KL chất khô ≤ 10 ≤ 10  Chất chiết malt Bảng 6: Thành phần chất chiết malt Màu Từ vàng sáng đến nâu Chỉ số DE 39 – 60 COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 8 - Protein % KL chất khô ≥ 4.2 Acid (ml/100g) ≤ 23 pH ≥ 5 Ñoä ẩm, % ≤ 4 Thể tích riêng (ml/100g) 180 Tro, % KL chất khô ≤ 2 Cloriform (tế bào/g) ≤ 100 Hàm lượng vi sinh vật (cfu/g) ≤ 50000  KH2PO4 Bảng 7: Thành phần của KH2PO4 thương phẩm Độ tinh sạch, % KL chất khô ≥ 99 P2O5, % KL chất khô ≥ 51.5 K2O, % KL chất khô ≥ 34 Chloride ,% KL chất khô ≤ 0.2 pH ≤ 4.4 – 4.8 Chất không tan trong nước, % KL chất khô ≤ 0.1 Độ ẩm, % ≤ 0.2 Kim loại nặng (như Pb), % KL chất khô ≤ 0.001 Arsen, % KL chất khô ≤ 0.0003 Flour, % KL chất khô ≤ 0.005  K2HPO4 Bảng 8: thành phần hóa học của K2HPO4 Độ tinh sạch, % KL chất khô 98 P2O5, % KL chất khô 40 K2O (khan), % KL chất khô 53 pH 8 – 9 Chất không tan, % KL chất khô 0.05 COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 9 - Kim loại nặng (như Pb), % KL chất khô 0.001 Arsen, % KL chất khô 0.0003 Flour, % KL chất khô 0.002  (NH4)2SO4 Bảng 9: Thành phần của (NH4)2SO4 Nitơ tổng, % KL chất khô 21 Độ ẩm ,% 0.2 Acid tự do, % KL chất khô 0.03 Fe, % KL chất khô 0.007 As , % KL chất khô 0.00005 Kim loại nặng (Pb) , % KL chất khô 0.005 Chất không tan, % KL chất khô 0.01 III. GIOÁNG VI SINH VAÄT Hình 3: Rhodotorula sp 3.1 Giôùi thieäu gioáng vi sinh vaät - Theo phaân loaïi Harison(1927) naám men Rhodotorula sp thuoäc: • Giôùi: Naám(fungi) • Ngaønh: Basidiomycota • Lôùp: Urediniomycetes COÂNG NGHEÄ LEÂN MEN THÖÏC PHAÅM - 10 - • Boä: Sporidiales • Hoï: Sporidiobolaceae • Gioáng: Rhodotorula - Naám men Rhodotorulasp coøn ñöôïc goïi laø naám men sinh saéc toá carotenoid (carotengensis), laø moät trong raát ít caùc chi naám men coù khaû naêng toång hôïp tích luõy moät löôïng lôùn caùc saéc toá carotenoid trong ñoù chuû yeáu laø β_ caroten, torulene, torulahodin… - Rhodotorula thuoäc cô theå ñôn baøo, khoâng sinh baøo töû, khoâng coù sôïi khuaån ti hay sôïi khuaån ti giaû. - Rhodotorula laø nhoùm sinh vaät öa aám, khoaûng nhieät ñoä hoaït ñoäng töø 20-400C. - Chuùng phaân boá roäng raõi khaép nôi: trong