Đề tài Enzym thực vật

MỤC LỤC PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT TỔNG QUAN 5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT 5 Quy trình công nghệ 5 Thuyết minh quy trình công nghệ 6 Phá vỡ tế bào 6 Thu dịch enzym thô 6 Tách enzyme 8 Tinh sạch 13 Kết tinh 14 NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM 14 ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT 14 Bromelin 14 Đặc điểm 14 Sản xuất 18 Ứng dụng 21 Sản phẩm thương mại 24 Hướng nghiên cứu 27 Papain 29 Đặc điểm 29 Sản xuất 33 Ứng dụng 34 Sản phẩm thương mại 37 1.4.3. Ficin 39 1.4.3.1. Đặc điểm 39 1.4.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzym ficin 41 PHẦN 2 : ENZYM ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2.1. ENZYM PECTINASE 44 2.1.1. Phân loại 46 2.1.2. Đặc điểm enzym pectinase 46 2.1.2.1. Enzym pectinase từ thực vật 46 2.1.2.2. Enzym pectinase từ vi sinh vật 50 2.1.3. Ứng dụng enzym pectinase trong thực phẩm 52 2.1.4. Ứng dụng enzym pectinase trong sản xuất nước dứa 55 2.2. ENZYM AMYLASELASE 57 2.2.1. Phân loại 58 2.2.2. Đặc điểm 58 2.2.2.1. Enzym amylase từ thực vật 58 2.2.2.2. Enzym amylase từ vi sinh vật 60 2.2.3. Ứng dụng amylase trong thực phẩm 61 2.2.4. Một số chế phẩm thương mại 64 2.3. ENZYM CENLLULASE 64 2.3.1. Phân loại 65 2.3.2. Đặc điểm 65 2.4. ENZYM OXY HÓA – KHỬ 67 2.4.1. Enzym peroxydase 67 2.4.2. Enzym polyphenoloxydase 67 2.4.3. Enzym glucooxydase 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin 15 Bảng 1.2: Những tính chất vật lý của protein thân 16 Bảng 1.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin 16 Bảng 1.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin 17 Bảng 1.5: Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau của bromelin thân 17 Bảng 1.6: Ảnh hưởng trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của bromelin 18 Bảng 1.7: Tính chất vật lý của papain 30 Bảng 1.8: Giá trị dinh dưỡng trên100 g chất quả 33 Bảng 1.9: %RDI 34 Bảng 1.10: Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng thái cơ chất của papain 38 Bảng 1.11: Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin 40 Bảng 1.12: Tính chất vật lí của ficin 41 Bảng 2.1 : Phân loại enzym pectinase 53 Bảng 2.2 : Hàm lượng pectin của một số quả và dịch quả 53 Bảng 2.3 : Một số tính chất của amylase từ các nguồn khác nhau 59 Bảng 2.4 : Ứng dụng enzym amylase 61 Bảng 2.5 : hiệu suất chuyển hóa tinh bột bằng enzym cố định trong sản xuất syro fructose 64 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 : Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin 14 Hình 1.2 : Chất chiết từ lá và thân dứa (Ananas comosus) với hàm lượng bromelain cao, được sản xuất dưới dạng viên nén, chứa 200mg bromelin/viên 24 Hình 1.3 : Chế phẩm bromelin có hoạt lực cao (1200gdu/g hay 1800mcu/g) 25 Hình 1.4: Bột bromelin bổ sung vào thức ăn cho gia súc 25 Hình 1.5: Quercetin & Bromelain - Thuốc giúp bệnh thống phong 25 Hình 1.6: Bromelain - Tinh chất quả dứa trị viêm mũi 26 Hình 1.7: Tâm hoạt động của papain 30 Hình 1.8: Cơ chế ảnh hưởng của pH 32 Hình 1.9: Cơ chế hoạt động 33 Hình 1.10: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa 34 Hình 1.11: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ 35 Hình 1.12: Papain ứng dụng trong mỹ phẩm 39 Hình 1.13: Papain trongcác loại dược phẩm 39 Hình 2.1 : Cấu trúc của pectinase từ carrot 47 Hình 2.2 : Polygalacturonase từ erwinia carotovora ssp. carotovora 49 Hình 2.3 : Ảnh hường của pectinase đến hiệu suất trích ly nước dứa 56 Hình 2.4 :Ảnh hưởng của pectinase Ultra SP-L đến hiệu suất trích ly dứa 57 Hình 2.5: Ảnh hường pectinase 3XL đến quá trình làm trong dịch dứa 57 PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT 1.1 TỔNG QUAN [3]: Enzym là những chất không thể tổng hợp bằng phương pháp hoá học, chỉ có thể thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzym có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme gặp rất nhiều khó khăn, nhất là tách với quy mô công nghiệp một cách thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành đối với nguyên liệu có chứa hàm lượng lớn enzym. Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. Từ thực vật người ta cũng thu được một số chế phẩm enzym thuỷ phân như papain, bromelin, ficin, amylase, urease, … Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách khuấy nhựa một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đem sấy khô nghiền nhỏ. Bromelin thu từ thân dứa. Sau khi hái quả người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzym trong dịch ép. Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus. Amylase được thu nhận từ nguồn malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác, được sử dụng chủ yếu trong công nghệ sản xuất rượu bia, bánh kẹo. Urease từ hạt đậu tương, lipase từ hạt thầu dầu, b_amylase từ củ khoai lang, saccharase từ lá củ cải đường … 1.2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT [3],[4]: 1.2.1. Quy trình công nghệ: 1.2.2. Thuyết minh quy trình công nghệ: 1.2.2.1. Phá vỡ tế bào: Trong cơ thể sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân microxom, mitochrondri..…) của tế bào. Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử (mitochrondri) của tế bào. Do đó, để có thể chiết rút các enzym nội bào cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp: Xay nhuyễn Nghiền: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát sạch. Đồng hóa: dùng áp lực cao để phá vỡ tế bào mô thực vật, từ đó làm giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzym nội bào mà không làm biến tính chúng. Điều này cũng tạo thuận lợi khi ta sử dụng phương pháp siêu lọc để làm tinh sạch enzym. Sử dụng sóng siêu âm. Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine... 1.2.2.2.Thu dịch enzym thô: Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. Có thể sử dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly. 1.2.2.3.Tách enzym: Có thể sử dụng nhiều phương pháp như: Phương pháp kết tủa enzym: Nguyên tắc: Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kết hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước cũng như các ion dương. Điều này làm cản trở sự kết tủa của chúng. Enzym có bản chất protein, do đó để kết tủa được enzym phải phá vỡ lớp nước xung quanh bằng cách bổ sung vào dung dịch enzym các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein, giúp protein tủa xuống. Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ở nồng độ cao như ammonium sulphate. Những yếu tố chính ảnh hưởng hiệu suất và chất lượng chế phẩm enzym là: Nồng độ của ammonium sulphate. pH của dịch chiết. Nhiệt độ kết tủa. Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết. Phương pháp siêu lọc: Dung dịch enzym thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa nhiều tạp chất. Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang dùng phương pháp siêu lọc để loại bỏ các chất có phân tử lượng thấp hơn enzym đồng thời cô đặc enzym. Màng siêu lọc: được cấu tạo bằng các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có chứa nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các loại polymer bền như fluoro polymer (FS), cellulose acetate (CA), polysulphone(GR)…. Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp. Ví dụ: Cô đặc protein dùng màng FS, GR. Cô đặc enzym dùng màng GR. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với loại sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng. Áp suất: thường áp suất của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc: Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể. Đối với enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính. Siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym. Trong quá trình thực hiện, nếu cho thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzym càng cao. Trong quá trình siêu lọc, nếu nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzym, do đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất mà không làm mất hoạt tính enzym càng cao. Trong quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC). Phương pháp hấp phụ: Hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào trong dịch enzym) hoặc trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Hấp phụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách: chất hấp phụ protein tạp hoặc chất hấp phụ enzym. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Enzym sau đó được chiết bằng các dung môi thích hợp. 1.2.2.4.Tinh sạch Enzym rất dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài. Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính enzym, cần tiến hành nhanh ở điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn, môi trường có pH thích hợp và không có mặt các tác nhân gây biến tính. Các phương pháp thường được áp dụng khi tinh chế enzym là: Hấp phụ trên gel Phương pháp thẩm tích Cột sắc kí (ví dụ: DEAE –cellulose) Kết tủa phân đoạn hay bằng dung môi hữu cơ Để tinh chế enzym hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Phương pháp hấp phụ có chọn lọc: Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzym quan trọng và thành công nhất, thường được dùng để làm đặc dung dịch enzym. Nguyên tắc: cho dịch enzym chảy từ từ qua cột chất hấp phụ. Tùy theo khả năng tương tác của các chất hấp phụ với từng loại enzym, các enzym khác nhau sẽ được hấp phụ trên chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút enzym ra khỏi cột. Có thể hấp phụ chọn lọc enzym theo hai cách: Hấp phụ âm tính: Dùng chất hấp phụ để tách tạp chất ra khỏi dung dịch enzym. Hấp phụ dương tính: Enzym được hấp phụ và được tách ra khỏi những cấu tử khác trong dung dịch, sau đó được rửa giải bởi dung dịch đệm pH kiềm hoặc các dung dịch đệm khác. Sau khi ly tâm để loại các hợp chất không tan, dung dịch enzym có thể được thẩm tách để loại dung dịch đệm. Để hấp phụ enzym tốt nhất, cần tuân theo những nguyên tắc chung sau: Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%. Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1 Môi trường acid pH = 5 – 6 Nồng độ chất điện ly (muối) thấp trong dung dịch. Sự tồn tại của bất kì một lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ. Vì thế một lượng lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quả mong muốn. Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0oC trong lúc trộn dung dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng. Đây là một phương pháp nhanh, sự cân bằng giữa các chất hấp phụ và dung dịch hình thành rất sớm và chỉ sau vài phút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ. Quá trình được tiến hành tuần tự như sau: Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng gel thích hợp. Trộn đều Quay lắng Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào. Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụ phải được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên (phần sẽ được loại bỏ) lấy đi khoảng 10% enzym và sau khi thu những phân đoạn hoạt động, phải còn lại 10% enzym trong dung dịch. Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ. Nếu enzym không được rửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp phụ vào nước và ly tâm lại. Trong sản xuất, để gel phân tán tốt trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải có cánh khuấy với tốc độ cao. Giải hấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịch đệm base nhẹ (pH = 7,6). Quá trình càng hiệu quả với dung dịch (NH4)2SO4 10%. Thể tích dung dịch rửa giải không nên quá lớn, thường là ít hơn thể tích gel ly tâm. Nên tiến hành rửa giải nhiều lần với thể tích nhỏ hơn là một lần với thể tích lớn. Phương pháp thẩm tích Lấy enzym thô pha trong dung dịch đệm thích hợp, sau khi tất cả enzym đã hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa dung dịch đệm ban đầu. Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm trên. Tiến hành thẩm tích trong thời gian thích hợp, nếu có thể thì nên thay dung dịch đệm bên ngoài nhiều lần để đạt tinh sạch cao. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ. Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì protein enzym sẽ bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym. Chính vì vậy, để làm giảm sự biến tính của enzym do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp. Cột sắc ký: Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzym tinh khiết. Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử. Nhưng trên thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả ba quá trình trên. Nguyên tắc: cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung dịch đệm với cột trao đổi ion đã được cân bằng, tiến hành giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải (gradient muối) với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi cột các enzym vừa liên kết với nhựa. Khi đó enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất, lần lượt các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó có phần chứa enzym cần thu với nồng độ cao nhất. Các chất trao đổi ion có thể được sử dụng là nhựa resin trao đổi ion (đặc biệt là amberlite IRC-50, XE-64), những dẫn xuất khác nhau của cellulose như diethylaminoethyl cellulose (DEAE-cellulose), carboxymethyl cellulose (CMC). Dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu được hiệu quả tốt đối với những enzym có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ, có điểm đẳng điện trong vùng kiềm, đồng thời việc rửa giải những enzym phân tử lớn ra khỏi cột cũng gặp không ít khó khăn. Vì thế DEAE-cellulose và CMC thường được sử dụng rộng rãi hơn do có khả năng loại bỏ được các tạp chất acid nucleic. Quá trình phân tách được tiến hành tuần tự như sau: Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy một lần qua cột để loại muối ra khỏi dung dịch protein. Protein chảy ra khỏi cột với một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với thể tích của nó lúc đưa vào cột. Trên các cột chứa sephadex G-75, G-100, G-200 đồng thời xảy ra sự phân tách từng phần các protein tùy theo phân tử lượng của chúng. Ngoài sephadex, tất cả các cột đều cần gradient muối cho việc rửa giải. Các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kết với nhựa. Đẩy protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau: Tăng nồng độ các dung dịch đệm. Tăng nồng độ dung dịch NaCl hay KCl thêm vào dung dịch. Thay đổi pH của dung dịch tách. Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất (là phân đoạn chứa enzym cần thu) được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc (hoặc làm khô) bằng cách loại hơi ẩm trong chân không ở nhiệt độ thấp. Phương pháp sắc kí trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân tách hỗn hợp protein và trong tách riêng những enzym và hormone tinh khiết tới mức tối đa. Nhờ đó, người ta đã loại được những tạp chất protein nhỏ ra khỏi những chế phẩm enzym thuần nhất về điện ly. Điện di: Là phương pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzym và cũng là phương pháp để xác định sự tinh khiết của các chế phẩm protein. Gần đây, phương pháp này được áp dụng ở những giai đoạn tinh chế enzym cuối cùng. Nguyên tắc: Phân tử protein có điện tích tự do chứa nhóm acid, base. Nếu các phân tử protein enzym không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dương) thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển trong điện trường ở những điều kiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau. Do đó, hỗn hợp protein được phân tách ra thành một số vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt. Những phân đoạn enzym thu được sẽ được xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzym và biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ. 1.2.2.5.Kết tinh: Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh. Tuy nhiên, kết tinh không có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết. Hoạt độ riêng của tinh thể tăng khi các enzym tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần lặp lại nhiều lần cho đến khi hoạt độ riêng tăng đến một giá trị cao nhất, không tăng được nữa. Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzym như là một phương pháp phân đoạn protein có giá trị. Vì thế, tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như là một phương pháp cụ thể của quá trình phân đoạn, và được sử dụng ở những giai đoạn tinh thể cuối cùng. Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch ammonium sulfat. Để thu được những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ qua nhiều ngày hoặc tuần. Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dung dịch enzym đậm đặc cho đến khi bắt đầu thấy đục rõ. Có thể thêm dung dịch muối nồng độ cao từng giọt, từng giọt hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩm tích ( trong một số trường hợp dung dịch enzym được thẩm tích đối với dung dịch ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hoặc dung dịch đơn giản được làm bay hơi chậm. Sau đó, người ta để yên các dung dịch, không khuấy trộn trong vài ngày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể enzym sẽ xuất hiện như ý muốn. Khi thêm nồng độ muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định hình. Ngoài ra cần thử thực nghiệm nhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết tinh. Thay vào đó, quá trình kết tinh được tiến hành ở những nồng độ muối xác định bằng cách thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt độ. Nếu trước khi kết tinh mà thấy dung dịch enzym loãng thì cần cô đặc dung dịch trước. Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó là quá trình phân đoạn với dung môi hữu cơ. Những tinh thể lắng xuống đựơc tách riêng và tái kết tinh nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng. Sự tái kết tinh làm đi làm lại nhiều lần cho tới khi hoạt độ riêng của chế phẩm không tăng lên nữa. Phối hợp những phương pháp phân đoạn khác nhau khi tinh chế: Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương pháp phân đoạn khác nhau phải được xác định. Trình tự hiệu quả nhất được xác định thông qua thực nghiệm, nhưng cần lưu ý một số điểm sau: Quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng. Quá trình đun nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêng một phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoá những lượng lớn dịch chiết ban đầu. Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulphate hoặc kết tủa bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên, khi đó ta có những thể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chóng tách riêng protein tủa xuống. Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trên aluminum hydroxide hoặc calcium phosphate. Những tủa thu được khi đó dễ tách bằng cách để lắng cặn hay ly tâm ở tốc độ nhỏ. Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích do enzym rất kém bền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân thông thường nhất (trừ khi sử dụng nước tinh khiết) là do các kim loại ức chế có trong nước như Cu. Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích. Cột chứa jela sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn toàn khỏi những thể tích dung dịch lớn. Các phương pháp sử dụng cột thường không tiện lợi khi áp dụng trong phạm vi sản xuất lớn vì thế nó thích hợp hơn cho những giai đoạn sau của quá trình tinh chế. So với các phương pháp khác, những phương pháp sử dụng cột t