Đề tài Kỹ thuật chuyển gen thực vật và ứng dụng

MỤC LỤC A. MỞ ĐẦU 2 B. NỘI DUNG 5 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen 5 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen 6 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật 7 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 7 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens 7 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 11 3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 12 3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) 12 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) 14 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) 14 3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 15 3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học 15 3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) 16 4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen 16 4.1. Lợi ích 16 4.2. Nguy cơ tiềm ẩn 18 5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng chuyển gen 20 6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen 21 6.1. Chuyển gen kháng sâu 21 6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 22 6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh 22 6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật 24 6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh dưỡng của cây 24 6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc 25 7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi) 26 C. KẾT LUẬN 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 A. MỞ ĐẦU Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra cơ thể lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần nhau. Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống. Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển gen. Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A và sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây - Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm: - Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hoang dại - Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen - Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học. Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống. B. NỘI DUNG 1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau: - Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency) - Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai - Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây. - Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan. - Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm. - Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen - Các ADN (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome - Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó được đưa vào - Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem). 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng. Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế mà hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)... Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật. Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện genomic ADN) - Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E. coli - Tách chiết ADN plasmid - Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau đã kể trên - Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc - Tái sinh cây biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác...) Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh. Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những enzym phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo thành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen. 3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. 3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens * Nguyên lý chung Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen ở thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định. Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như hình sau Hình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gen cần chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid. Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (T- complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. Ti plasmid Bộ gen của vi khuẩn Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciens Cụ thể như sau: Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Ti plasmid của Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm hai thành phần: T- DNA và vùng Vir. T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. T- DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp các chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Trong plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải. Vùng Vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirA đến VirG và VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp. Để thiết kế vector dùng trong biến nạp: trước hết là cắt bộ gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng gắn gen cần biến nạp. * Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen thực vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể. - Vector liên hợp (Cointegrated vector) Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên hợp gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc trong vi khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật. Như vậy vector liên hợp được hình thành từ một plasmid mang trình tự ADN mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờ lặp lại của T-ADN. Sau tái tổ hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng cho chuyển gen vào thực vật. - Vector nhị thể (Binary vector) Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: một cung cấp T-ADN đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất mang gen chọn lọc ở thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khi plasmid này được đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những sản phẩm mang gen vir có thể đưa T-AND vào tế bào thực vật, mặc dù T-ADN nằm trên phân tử ADN khác. * Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả, đặc biệt là chuyển gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều giống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt như giống lúa Golden rice có chứa hàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường. Nhờ giống lúa này đã giải quyết được vấn đề hết sức khó khăn về sự thiếu vitamin A ở các nước đang phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi. * Ưu điểm - Gen ít bị đào thải - Số lượng bản sao ít hơn. Do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau và câm lặng lẫn nhau. - Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay sau đó. * Nhược điểm - Có phổ tấn công giới hạn - Gây khối u cho cả cây khỏa tự và cây hai lá mầm nhưng lại không gây khối u cho cây một lá mầm (do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến hoá nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm...) 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta còn sử dụng virus làm vector chuyển gen vào cây trồng. Chuyển gen nhờ virus có thể thuận lợi do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật và động vật đồng thời virus có thể mang đoạn ADN lớn hơn nhiều so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen cần phải có các tiêu chuẩn sau: - Hệ gen của virus phải là ADN - Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở vách tế bào - Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen này vào tế bào thực vật - Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây) - Không gây tác hại đáng kể cho thực vật Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử dụng làm vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus. Tuy nhiên, việc sử dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khó ghép nối với hệ gen của thực vật. 3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) Hình 3. Súng bắn gen * Nguyên lý Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 - 1,5 mm với dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5 - 0,9 cm. Đĩa kim loại này được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tượng bắn rồi rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Các gen cần chuyển có thể tái tổ hợp vào hệ gen của cây, từ đó tạo thành cây chuyển gen. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gen chuyển do vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén là helium áp lực cao để bắn gen. Hình 4. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen * Ưu điểm - Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào - Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô hóa và mô phân sinh) * Nhược điểm Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của phương pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời. Tuy nhiên, những năm gần đây phương pháp này đã thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này. 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) * Nguyên lý Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho ADN bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta chuẩn bị protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cần chuyển vào thực vật. Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200 – 400 V/cm) trong khoảng thời gian 4 - 5 phần nghìn giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid có thể xâm nhập và gắn vào hệ gen của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau quá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích hợp, môi trường chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp. Tiếp theo là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gen. * Đối với protoplast phương pháp xung điện đã có kết quả khích lệ nhưng chưa chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi cấy protoplast ở một số loài cây vẫn còn gặp khó khăn. 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) Phương pháp này sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đưa ADN những tế bào nhất định, nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn. * Ưu điểm - Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào - Quyết định được đưa ADN vào loại tế bào nào - Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được - Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù hạn chế về số lượng cũng có thể tiêm chính xác - Có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây * Nhược điểm - Mỗi lần tiêm chỉ được một phát tiêm và chỉ với một tế bào - Thao tác trong khi làm đòi hỏi độ chính xác cao 3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần protoplast. Sau khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20KHz theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 mili giây. Số nhịp khoảng từ 6 - 9 nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 - 900 mili giây. Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong các môi trường thích hợp, chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gen. Nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài. 3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG). Khi có mặt PEG, màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu nhận ADN ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp chuyển gen bằng hóa chất có thể áp dụng với nhiều loài thực vật nhưng khả năng chuyển gen với tần số chuyển gen rất thấp. Tuy nhiên, với khả năng tạo ra số lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được hạn chế của phương pháp này. 3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) (Ray Wu & cộng sự, 1988) Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô invitro. Nguyên tắc của phương pháp này là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gen vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắ