Đề tài Kỹ thuật Real time PCR chẩn đóan sớmHIV trên trẻ em

1Kỹ thuật Real time PCR chẩn đóan sớm HIV trên trẻ em Eric Nerrienet HIV/Hepatitis Laboratory IP Cambodia, Phnom Penh Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 2 Tình nhiễm HIV ở Campuchia • Tần suất nhiễm HIV: • Người lớn ở độ tuổi từ 15-49: 1.9% (2003) • Chủng lưu hành chủ yếu là HIV-1 CRF 01 AE • Phụ nữ mang thai: 2.8% • Đường lây từ mẹ sang con là một trong những đường lây quan trọng trong dịch bệnh Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 23 Vấn đề đặt ra Nếu trẻ không được phát hiện sớm và điều trị thuốc kháng virus Trẻ có nguy cơ tử vong là 50% trong 02 năm đầu tiên của cuộc sống Nếu không có sự tầm sóat sớm nhiễm HIV ở trẻ, BS Nhi Khoa phải chờ đợi đến tháng thứ 15 để có thể biết tình trạng huyết thanh học thực sự của trẻ sinh ra từ bà mẹ HIV(+) Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales Kỹ thuật kinh điển trong chẩn đóan nhiễm HIV ở trẻ -RT PCR/b-DNA -Giá thành đắt -Nested-DNA PCR (gen: Gag, Pol và/hoặc Env) -Đắt, kỹ thuật phức tạp -Nuôi cấy và phân lập virus -Đắt, kỹ thuật phức tạp, mất nhiều thời gian -Cần labo an tòan mức độ 3 4 Mục tiêu Xây dựng Chuẩn hóa Đánh giá Kỹ thuật real time PCR Để chẩn đoán sớm, giá thành thấp ở trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 3-1.00E-01 4.00E-01 9.00E-01 1.40E+00 1 6 11 16 21 26 31 36 Số chu kỳ H uỳ nh q ua ng (d el ta R n) Phân tích theo thời gian thực Phân tích điểm cuối Kỹ thuật « Real-time PCR » có độ nhạy, đặc hiệu cao, giá thành thấp so với những kỹ thuật kinh điển, dùng để định tính hay định lượng RNA/DNA HIV Ct Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 6 2 106 cp/ml 2 105 2 104 2000 200 Chu kỳ ngưỡng:35 (17 000 cp/ml) Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales Lượng virus dưới mức phát hiện 47 • Xây dựng và chuẩn hóa kỹ thuật • Nhóm nghiên cứu ANRS (AC11/AC12) trong việc định lượng HIV ở các nước phía Nam bán cầu • Trên 10 phòng thí nghiệm virus ở Pháp • Châu Phi: Cote d’Ivoire, Cameroon, Senegal, Burkina Faso, Central African Republic • Đông Nam Á: Việt Nam và Cambodia (bắt đầu từ tháng 1-7/2005) Kết quả • Ứng dụng đầu tiên ở Campuchia •từ 3/2005: Chẩn đoán HIV-1 sớm ở trẻ sinh từ mẹ nhiễm HIV • Đánh giá tại Campuchia •9/2005: Kiểm định của ANRS •11/2005: Kiểm định của NIH Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 8 • Phương pháp: • So sánh phương pháp chẩn đoán HIV ở trẻ em • Phương pháp kinh điển nested DNA PCR • So sánh với kỹ thuật real time RT PCR thực hiện trên gene LTR (theo ANRS protocol) • Mẫu bệnh phẩm: • Huyết thanh của nhóm trẻ được chẩn đoán HIV (+) và nhóm trẻ HIV(-) ở Campuchia (n=226) và Việt Nam (n=38) • 145 trẻ em gái và 119 trẻ trai • độ tuổi từ 1-28 tháng, độ tuổi trung bình 7,2 tháng) Tiếp cận kỹ thuật Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 59 10 1950DNA- 069DNA+ RNA-RNA + Nested DNA PCR Real RT PCR Độ đặc hiệu 100% (95% CI, 90 đến 100%) Độ nhạy 100% (95% CI: 97,3 đến 100%) Kết quả 2 Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 264 trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV ở Cambodia và Việt Nam Kết quả nồng độ HIV định lượng 611 • Độ đặc hiệu và độ nhạy tốt so vơí kỹ thuật kinh điển: kỹ thuật nested DNA PCR, RT PCR và kỹ thuật bDNA) • Nguỡng phát hiện : 400 cp/mL*, kỹ thuật thực hiện trên 200 µl huyết thanh • Không cần giai đoạn sau khuếch đại • Độ lặp lại cao : trong cùng lần thử nghiệm, giữa các phòng xét nghiệm khác nhau. • Đơn giản • Nhanh • Giá thành rẻ Kết luận 1 Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 12 •Việc theo dõi chỉ số virus học (nồng độ HIV) bắt đầu thực hiện được ở Campuchia Nhằm chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở trẻ em sinh ra từ mẹ nhiễm HIV và cũng để đánh giá hiệu quả điều trị kháng virus Đánh giá biến chứng/tuân thủ điều trị bằng HAART của bệnh nhân Phát hiện sớm thất baị điều trị do xuất hiện đột biến kháng thuốc Hỗ trợ cho nghiên cứu và trong áp dụng thường quy Kết luận 2 *Giá thành cuả kỹ thuật real times PCR sẽ giảm dần theo thời gian: •Nhờ vào kit thương mại hoá sản suất bởi ANRS •Nhờ vào nhu cầu chẩn đoán ngày càng tăng < 25 USD* Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 713 Định hướng Phát triển kỹ thuật lấy mẫu trên giấy thấm trong việc xác định nồng độ virus và tìm đột biến kháng thuốc một cách dễ dàng hơn và phổ biến ở vùng quê Campuchia Xác định qui trình chẩn đoán, đóng góp cho việc phát hiện sớm trẻ nhiễm HIV Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales 14 Cám ơn sự quan tâm của quí vị. Agence Nationale de recherches sur le Sida et les hépatites virales