Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng Kali và Photpho đến sự hình thành và phát triển chồi lan DendrobiumSonia trong môi trường Murashige Skoog (MS, 1962)

Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -1- LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hoa lan là một trong những giống hoa rất được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã. Chính vì vậy hiện nay, rất nhiều hộ gia đình đang có thú chơi hoa lan. Nguyên nhân của trào lưu trên là do cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo góc vườn nhỏ, mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của những người dân ngày càng cao. Với ưu điểm ít chiếm diện tích, không quá khó trồng, cho hoa đẹp lại lâu tàn nên việc chọn, trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều người. Bên cạnh đó, hoa lan là sản phẩm cây trồng có giá trị kinh tế cao, ngày càng có nhiều cơ sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại. Nhưng làm sao để có số lượng lớn cây giống, đồng đều, chất lượng cao là một vấn đề khó. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngành vi nhân giống cây đặc biệt trên đối tượng cây hoa lan từng bước phát triển, nhiều đơn vị nhà nước cũng như tư nhân đã mạnh dạn đầu tư để sản xuất cây giống phục vụ cho nông dân. Tuy nhiên qui mô cũng như những hạn chế về đội ngũ kỹ thuật cũng như kiến thức về lĩnh vực này có hạn, vì thế cây giống có chất lượng thấp không đồng đều, không đáp ứng được nhu cầu của thị trường. Hiện nay trên Thế giới nhiều nước có ngành Công nghệ Sinh học phát triển đã ứng dụng các công nghệ cao để nhân nhanh giống cây trồng như: hệ thống fermenter, bioreactor, quang tự dưỡng,… Ở nước ta các công nghệ này mới chỉ thực hiệân ở phòng thí nghiệm của một số trường Đại Học, Viện Nghiên cứu hoặc Trung tâm Công nghệ Sinh học trong mấy năm gần đây. Tuy nhiên việc nghiên Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -2- cứu xác định môi trường thích hợp cho từng cây trồng nhân bằng các hệ thống này còn rất hiếm. Để từng bước áp dụng công nghệ mới trong sản xuất cây lan giống ở nước ta, đẩy nhanh tiến độ sản xuất cây giống theo qui mô công nghiệp, góp phần khắc phục sự thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay. Chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu ảnh hưởng Kali và Photpho đến sự hình thành và phát triển chồi lan Dendrobium Sonia trong môi trường Murashige Skoog (MS, 1962)". 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của Kali và Phosphore trong môi trường nuôi cấy mô Murashige & Skoog (MS) đến sự hình thành và phát triển chồi lan Dendrobium Sonia, nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân chồi lan Dendrobium Sonia trong vi nhân giống lan in vitro. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu hàm lượng Kali và Phosphore trong môi trường MS ảnh hưởng tới chồi của giống lan Dendrobium Sonia. Đây là vật liệu nền rất quan trọng trong nuôi cấy mô vi nhân giống hoa lan. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: Từ trước tới nay việc nhân giống in vitro đối với cây hoa lan hầu hết đều sử dung môi trường Murashige & Skoog, 1962) đây là môi trường cơ bản sử dung chung cho nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên dối với mỗi cây trồng khác nhau thi nhu cầu dinh dưỡng khác nhau đặc biệt là các nguyên tố đa lượng N, P, K. Thậm chí ngay trên cùng một giống cây trồng ở các giai đoạn sinh trương khác nhau hai mục đích khai thác khác nhau của con người thi yêu cầu N, P, K cũng khác nhau. Vi vậy việc xác định hàm lượng P, K thích hợp trong môi trường nhân chồi hoa lan là cơ sở khoa học cho việc hoàn thiện qui trình sản xuất cây giống có hiệu quả cao Ý nghĩa thực tiễn: Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -3- Việc xác định ảnh hưởng của K và P đến sự hình thành và phát triển chồi lan Dendrobium Sonia làm cơ sở cho việc thiết lập và hoan thiện qui trình sản xuất cây lan giống in vitro có chất lượng và hiệu quả cao, phục cho sản xuất hoa lan thương mại ở nước ta, giảm nhập khẩu cây lan giống từ nước ngoài, góp phần ngăn ngừa sự lây lan bệnh dịch qua cây giống 5. Phương pháp nghiên cứu Đề tài thực hiện nhân chồi trong môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) đặc. Nghiên cứu 9 môi trường nuôi với các nồng độ Kali khác nhau trên giống lan Dendrobium Sonia. Đồng thời, nghiên cứu 10 môi trường nuôi cấy với nồng độ Phosphore khác nhau trên giống lan Dendrobium Sonia. Thí nghiệm bố trí kiểu đầy đủ ngẫu nhiên hoàn toàn thực hiện với 5 lần lặp lại, gồm 9 nghiệm thức (thí nghiệm Kali) và 10 nghiệm thức (thí nghiệm Phosphreo). Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -4- TÓM TẮT Trong nuôi cấy mô vi nhân giống lan, chồi là nguyên liệu nền rất quan trọng hình thành cây giống. Nó ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng và chất lượng cây giống. Sự hình thành và phát triển của chồi phụ thuộc vào các yếu tố trong môi trường nuôi cấy. Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của Kali và Phospho trong môi trường nuôi cấy MS ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển chồi ở giống lan Dendrobium Sonia. Kết quả đã xác định được ảnh hưởng của Kali và Phosphore đến chồi giống lan nhiên cứu như sau: hàm lượng kali trong môi trường từ 780mg/l trở chồi lan phát triển mạnh nhất. Hàm lượng Kali từ 950mg/l- 1120mg/l tăng khả năng tạo chồi lan Dendrobium Sonia. Nếu thấp hơn hoặc vượt quá ngưỡng này thì vai trò của Kali đối chồi không rõ rệt. Hàm lượng Kali trong môi trường ít ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển bộ rễ của cây lan. Phosphore ảnh hưởng rõ khi hàm lượng P từ 615 -791mg/l làm cho chồi ra rễ sớm, rễ lớn, khỏe và dài. Hàm lượng P trong môi trường từ 615-791mg/l số chồi đạt cao tập trung ở giai đoạn 6 tuần nuôi cấy hơn hẳn so với môi trường đối chứng. Số lá/chồi và số chồi không phụ thuộc vào sự tăng hay giảm hàm lượng P trong môi trường nuôi cấy. Chiều cao chồi tăng dần theo hàm lượng P từ P1(176mg/l)< P2(264mg/l) < P3(351mg/l) < P4(439mg/l) và đạt cực đại ở P = 439mg/l rồi và có xu hướng giảm dần theo chiều tăng của hàm lượng P như sau: P4(439mg/l) > P5(527mg/l)> P6(615mg/l) > P7(703mg/l) > P8(791mg/l. Sự tăng trưởng bộ rễ chỉ thễ hiện rõ từ môi rường P4 trở đi nghĩa là khi tăng hàm lượng lân trong môi trường từ 439mg/l trở lên thì sự tăng trưởng chiều dài bộ rễ cung tăng dân theo chiều tăng của hàm lượng P trong môi trường P4(439mg/l) < P5(527mg/l) < P6(615mg/l) < P7(703mg/l) < P8(791mg/l. Kết quả của đề tài la cơ sở cho việc thiết lập qui trình sản xuất cây lan giống chất lượng và hiệu quả cao, phục cho sản xuất hoa lan thương mại Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -5- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HOA LAN VÀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG 1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới Hoa lan được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, thị trường tiêu thụ hoa lan rộng khắp thế giới, mang lại lợi nhuận kinh tế cao cho nhiều nước. Thị trường tiêu thụ hoa lan của khối châu Âu rất hấp dẫn. Năm 2006 khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa lan là 73 tỉ EUR. Trong đó, Hà Lan là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa lan (37%) từ các nước khác trên thế giới. Năm 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% (52.049 ngàn sản phẩm) tổng sản lượng hoa lan trong khối EU (Nguồn: AIPH/Union Fluers: Internaational Statistics Flowers and Plants 2007). Mặc dù, khối châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa lan cao hơn so với các khối khác, nhưng do nhu cầu tiêu thụ hoa lan trong khối EU cao nên trong năm 2006 sản lượng nhập khẩu hoa lan từ các nước lên tới trên 155 tỉ sản phẩm, giá trị kim ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỉ EUR (Nguồn: AIPH/Union Fluers: Internaational Statistics Flowers and Plants 2007). Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, mang lại nguồn lợi kinh tế cho nhiều Quốc gia Châu Á. Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếù hoa lan nhiệt đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium Sonia và jumbo White. Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda, Mokara, Oncidium và Vanda. Hơn 80% Dendrobium trên thị trường Thế giới là từ Thái Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -6- Lan. Chỉ với loại hoa lan chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này. Giá trị xuất khẩu năm 2000 khoảng 1,765 triệu baht. Dendrobium được chọn là sản phẩm bởi vì sản phẩm của nó xuất khẩu liên tục trong năm. Hiện tại, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về hoa lan. Nó trở thành niềm kiêu hãnh của người trồng hoa lan của Thái Lan. Hiện nay, Thái Lan có khoảng 24 triệu m2 trang trại trồng hoa lan (Nguồn: Thailand orchid export.htm). 1.1.1.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2.500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm 5–6%. Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hoa lan tập trung khoảng 6 năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển khá nhanh. Tuy nhiên hiện nay do cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, các nhà vườn nhập cây giống ồ ạt từ nước ngoài như: Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc (Nguồn: Báo cáo điều tra thống kê của Sở NN & PTNT TP. HCM năm 2008). Theo thống kê của Sở NN & PTNT TP. HCM trong năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan cây kiểng chỉ đạt 200-300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến 600-700 tỉ đồng và ngay từ đầu năm 2006 doanh số đạt được là 400 tỉ đồng. Theo TS. Dương Hoa Xô - Trung tâm Công nghệ sinh học, đến nay đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho 7 nhóm giống hoa lan, có khả năng cung cấp 200.000 cây con hoa lan cấy mô thuộc các nhóm Mokara, Dendrobium, Phalaenopsis, Catlleya. Năm 2008, sản xuất 100.000 cây giống hoa lan cấy mô, tập trung cho nhóm hoa lan cắt cành Mokara, Dendrobium và một số giống lan rừng quý. Theo TS. Dương Tấn Nhựt, Thành phố Đà Lạt là cỗ máy điều hòa khổng lồ cho phép sản xuất địa lan trong thiên nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng lan trong nhà kính, có hệ thống điều hòa nhiệt độ. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -7- Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan... Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn. 1.1.2. Giới thiệu về giống lan Dendrobium Họ phong lan (Orchidaceae) với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm. Giống Dendrobium có khoảng 16.000 loài và đã được lai tạo thêm nhiều loại mới. Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp: “Dendro”-có nghĩa là gỗ “bio”- có nghĩa là sống. Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên vỏ cây. Ở Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng Lan, hay còn gọi là Đăng Lan. 1.1.2.1. Phân loại Vị trí phân loại: Ngành Angiospermantophyta Lớp một lá mầm Liliopsida (Monocotyledones) Lớp phụ Liliidae Bộ Orchidales Họ Orchidaceae Họ phụ Epidendroideae Tông Epidendreae Giống Dendrobium Theo truyền thống cổ điển các nhà khoa học trước đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epiden droideae, phân họ Orchidaceae (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004). Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium như sau: - Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi). Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -8- - Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng). - Dendrobium farmeri (Hoàng thảo thủy tiên). - Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế). - Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng). - Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xương cá). - Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng). - Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ). - Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu). - Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung). Lan rừng Việt Nam có rất nhiều nhóm Dendrobium: Nhóm có giả hành rất dài, to, đứng thẳng như lan Thái Bình (Dendrobium Pulchellum); Nhóm có giả hành dài thòng xuống như Long Tu (D. Primilium); Nhóm có giả hành to ngắn như Kim Điệp (D. Chrysotosum), Thủy Tiên (D. Farmeri), Vảy Cá (D. Lindleyi)… 1.1.2.2. Sự phân bố Phong lan có vùng phân bố rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo cho đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết. Dendrobium chỉ được tìm thấy ở Đông Bán Cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt nam Thái Bình Dương, Philippine, Ấn Độ, xuất hiện một ít ở Nhật Bản và xuất hiện nhiều nhất ở Đông Nam Á. Do quá đa đạng nên Dendrobium tập trung thành hai dạng chính: - Dạng đứng (Dendrobium Phalaenopsis): thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm, siêng hoa. Tp. Hồ Chí Minh trồng rất nhiều loại này. - Dạng thòng (Dendrobium Nobile): chịu khí hậu mát mẻ ở vùng đồi núi cao như Đà Lạt, Lâm Đồng… Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -9- Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa. Lan Dendrobium nhập nội: Ở TPHCM nhập rất nhiều lan Dendrobium từ Thái Lan, Úc về trồng vì phát hoa dài cho rất nhiều hoa, màu sắc đẹp lại lâu tàn. Các loại Dendrobium nhập đã được lai tạo thuần hoá nên có hoa quanh năm, không có mùa nghỉ. Thường thì trồng vào chậu đất nung có nhiều lỗ chung quanh, giá thể gồm than, gạch, xơ dừa, dớn, vỏ cây... 1.1.2.3. Đặc điểm hình thái Dendrobium có số lượng khá lớn, phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa dạng, do đó không có một hình dạng chung nhất nào về hoa và dạng cây. Nhìn chung, lan thuộc giống Dendrobium đều có các bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái. a. Rễ Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống: rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn khi sống ở đất. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -10- Ở một số loài có lối sống phụ bì, bám lơ lửng trên vỏ cây khác, nên thân rễ có thể dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa thân bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dài. Cây có hệ rễ khí sinh, có một lớp mô hút ẩm dày bao quanh gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xám bạc. Vì vậy rễ hút được nước mưa hay chảy dọc trên vỏ cây hấp thụ dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn. Có khi hệ rễ đan bện thành búi chằng chịt nhằm thu gom mùn của vỏ cây làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng. Ở loài sống hoại sinh thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc có vòi hút ngắn để hút dinh dưỡng từ đám xác thực vật (sau khi được nấm phân hủy). Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết. b. Thân Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ. Thân nhẵn hay có nhiều vảy là do thoái hoá và một phần thẳng đứng mang lá. Các lá này bao nhau hợp thành thân giả hay còn gọi là giả hành. c. Giả hành Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được. Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: từ nhỏ như chiếc đinh găm đến lớn như mũ người lớn, hình cầu, thuôn dài, hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ. Trên thân giả có nhiều mắt ngủ nên Dendrobium có thể nhân giống nhanh hơn các giống lan khác theo phương pháp Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -11- chiết nhánh thông thường. Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành không có màu xanh nhưng phía trên có mang lá. d. Lá Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuống hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân. Hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng.Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nước, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V, những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy. e. Hoa Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách. Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân ngọn và cả trên ngọn cây gọi là Keiki. Biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng lá trước khi ra hoa. Thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết. Hoa mọc thành chùm đơn hay chùm kép hay từng hoa riêng lẻ. Cành hoa dạng rũ hay dạng thẳng đứng. Giống Dendrobium có hoa lâu tàn, trung bình 1-2 tháng. Thời gian ra hoa có khi nở suốt năm. Mặt khác, số lượng cành hoa trên cây nhiều nên Dendrobium được xem là giống chủ đạo để cung cấp lan cắt cành. Cấu trúc hoa thì cực kì phong phú và hấp dẫn về hình dạng và màu sắc, tuy nhiên luôn có điểm chung sau: Bao quanh có vòng và ba mảnh bao gồm ba cánh đài và ba cánh tràng. Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hay cánh đài lưng dài hơn cánh đài bên. Các cánh đài dựng đứng hay trải ra. Ba cánh tràng có hai cánh bên rất giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng giữa còn đươ