Đề tài Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae ở miền Bắc Việt Nam

Phần 1 MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối với nhiều vùng trồng lúa khác nhau trên thế giới. Đối với miền Bắc nước ta, bệnh gây hại ở cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khác nhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Để phòng trừ người ta sử dụng nhiều biện pháp khác nhau, như áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác, bón phân sớm, cân đối, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý và dùng giống kháng bệnh, trong đó chọn tạo giống kháng bệnh có ý nghĩa kinh tế nhiều mặt, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được nông sản sạch. Để tạo giống kháng bệnh bạc lá bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng bệnh, sau đó phải xác định chính xác được số và thành phần các chủng hiện có ở mỗi vùng, nghiên cứu xác định gen kháng bệnh hữu hiệu rồi quy tụ nhiều gen kháng vào một giống. Hiện người ta đã xác định được 29 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau trên thế giới, tương ứng đã xác định được mỗi nước có một số chủng gây bệnh nhất định như ở Philippin có 6 chủng, Ấn độ 9 chủng, Nhật Bản có 12 chủng. Ở Việt Nam, theo Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 trên cơ sở lây nhiễm các dòng đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10 chủng. Đồng thời đã xác định được 4 gen kháng hữu hiệu là Xa4, xa5, Xa7 và Xa21, kháng mạnh và kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập. Tuy nhiên, do phương pháp lây nhiễm nhân tạo có một số nhược điểm như phụ thuộc vào môi trường, tốn thời gian, nhiều khi kết quả thu được chưa thật chính xác. Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phải xác định một cách chính xác sự đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử DNA. Trên thế giới có khá nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phân lập và xác định các chủng vi sinh vật gây bệnh. Lee và cộng sự, 2005 đã lần đầu tiên công bố đã xác định được trình tự DNA của genom vi khuẩn Xoo, vòng genom dài 4,9 triệu bp, trong đó đã xác định được một số vùng bảo thủ và những vùng dễ biến động, đây có thể là cơ sở phân tử để phân ra các chủng khác nhau. Sau đó Tika và cộng sự, 1999 đã sử dụng phương pháp rep-PCR và IS-PCR để nghiên cứu đa dạng di truyền của 171 chủng vi khuẩn Xoo phân lập ở Nepal và đã phân ra được 31 nhóm chủng khác nhau. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để xác định một cách chính xác các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá lúa vẫn chưa được tiến hành. Vì vậy, được sự phân công và hướng dẫn chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae ở miền Bắc Việt Nam”. II. Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Nghiên cứu xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá sử dụng kỹ thuật rep – PCR và IS-PCR, phục vụ công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững. 2. Yêu cầu - Nuôi cấy, phân lập thành công và xác định chính xác các mẫu vi khuẩn Xoo. - Lây nhiễm các dòng đẳng đơn gen, xác định tính độc của mẫu vi khuẩn và phổ kháng nhiễm. - Sử dụng kỹ thuật rep – PCR và IS-PCR theo phương pháp của Tika và cộng sự, 1999 xác định đa dạng di truyền các mẫu vi khuẩn Xoo, trên cơ sở đó phân chia ra các chủng. Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. Tổng quan về bệnh bạc lá và vi khuẩn Xoo 1. Tổng quan bệnh bạc lá lúa 1.1. Lịch sử phát hiện bệnh Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884. Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất (Bokura, 1911). Nhưng không lâu sau đó, người ta đã công nhận nguyên nhân của nó là do vi khuẩn gây nên và theo Ishiyama,1922 thuộc loại Bacillus oryzae. Vi khuẩn này sau đó được Tagami, Mizukami, 1962 và Mizukami, Wakimoto, 1969 đặt tên là Pseudomonas oryzae, cuối cùng Oku, 1972 đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên. Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ (1990), Philippin (1957), Indonexia (1950), Trung Quốc (1957). Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện từ sau hòa bình lập lại (1945) trên các giống lúa địa phương cao cây. Sau đó, do phong trào thâm canh lúa tăng cao đã làm bệnh bạc lá lúa phát triển mạnh trên diện rộng và phức tạp, khó phòng trừ và thường xuyên gây hại nặng ở vụ mùa. Bệnh đã phát triển thành dịch lớn ở một số tỉnh Đồng bằng sông Hồng trong vòng từ năm 1968 – 1975. Trong những năm gần đây, ở miền Bắc thiệt hại do bệnh bạc lá lúa có xu hướng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân. 1.2. Tác hại do bệnh bạc lá lúa gây ra Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới. Hàng năm, theo thống kê năng suất lúa toàn thế giới giảm từ 10-20% do các bệnh vi khuẩn, trong đó 50% là do bệnh bạc lá gây nên (Mew, 1989). Ở Việt Nam bệnh đã được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ. Hiện nay, bệnh gây hại trên cả lúa lai và lúa thuần, đặc biệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Tác hại của bệnh nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào giống lúa, thời điểm cây bị nhiễm bệnh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ. Tác hại của bệnh chủ yếu là làm cho lá đòng sớm tàn khô xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm năng suất lúa. Theo nghiên cứu của Tika, Mew & cộng sự, 1999 năng suất giảm chủ yếu do sự thay đổi về số nhánh, số hạt chắc trên bông và khối lượng 1000 hạt. 1.3. Triệu chứng bệnh Vi khuẩn Xoo gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek). Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh. Các giống lúa khác nhau có thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá. Triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra. Bệnh gây hại từ thời kỳ mạ đến khi lúa chín, triệu chứng bệnh biểu hiện rõ nhất vào giai đoạn lúa trỗ, chín. Khi bị bệnh, trên lá vết bệnh lan dần từ mép lá vào phiến lá, kéo dài theo gân chính, có khi vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra. Vết bệnh lan từ mép ngoài vào gân lá theo đường gợn sóng. Vào lúc trời ẩm hoặc buổi sáng sớm, đầu hoặc mép lá có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn màu hổ phách. Hiện nay có hai dạng triệu chứng là bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh. Trong đó, dạng bạc lá gợn vàng phổ biến hơn. 1.4. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 1.4.1. Quy luật phát sinh, phát triển Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc. Bệnh phát triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90 %, đặc biệt khi có mưa to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan. Vì thế vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân. Vụ chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5-6, còn vụ mùa là tháng 8-9 khi có nhiều mưa bão gây tổn thương cho lá lúa. Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá. Từ các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá Xoo cho thấy ở mỗi vùng, lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng. Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và điều kiện tự nhiên của mỗi vùng. Như ở Philipin tồn tại 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn Độ 9 chủng (Tika B. Adhikari và cộng sự, 1999). Còn ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn và cộng sự năm 2002 đã phân lập và xác định được ở miền Bắc Việt Nam có 10 chủng đang tồn tại. Gần đây, trong nghiên cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và cộng sự, 2005 đã nhận thấy các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương. Trên một vết bệnh đôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định. 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh. Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão không những làm tổn thương đến lá khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chóng. Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh phát triển của bệnh. Lượng đạm bón lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh. Bón sớm, tập trung sẽ giảm khả năng bị bệnh hơn so với bón muộn, rải rác. Bón đạm cân đối với lân và kali cũng làm giảm khả năng nhiễm bệnh. Tuy nhiên, nếu bón quá nhiều đạm (>120 kg N/ ha) thì bón thêm lân và kali cũng không còn tác dụng. Đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển hơn ở chân đất cằn cỗi. Những nơi đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bóng bệnh cũng phát triển mạnh hơn. Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá. Các giống lúa cũ, lúa địa phương nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn. Theo điều tra của Viện bảo vệ thực vật thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 – 1997 hầu hết đều bị nhiễm bệnh bạc lá với mức tỷ lệ bệnh 50-80%, cấp phổ biến là 5-7, nếu bệnh nặng năng suất giảm 20-50%. 1.5. Nghiên cứu về cách chẩn đoán bệnh bạc lá. Hiện nay đã có nhiều phương pháp khác nhau để chẩn đoán bệnh bạc lá. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng của mình. Có thể kể ra ở đây một vài phương pháp và kỹ thuật chẩn đoán phổ biến như sau: - Phương pháp giọt dịch. - Phương pháp ELISA. - Phương pháp thấm hút tế bào trực tiếp (Direct tissue blotting). - Sử dụng que DNA/RNA. - Phương pháp thấm hút nén (Squash blot method). - Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi XOR theo Adachi và cộng sự, 1990. Trong số các phương pháp kể trên thì phương pháp của Adachi, 2000 là tiên tiến và cho kết quả chính xác nhất. Phương pháp này khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp khác và là phương pháp thích hợp được sử dụng trong điều kiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Các bước thực hiện phương pháp này như sau: thu thập mẫu bệnh, phân lập, chiết tách DNA của chúng và tiến hành PCR nhân đoạn DNA bảo thủ nằm giữa 2 gen tổng hợp cấu tử rDNA 16S và 23S của vi khuẩn Xoo với chu trình nhiệt độ và thành phần phản ứng PCR thích hợp. Sử dụng 2 đọan mồi có trình tự: XOR-F: 5'- GCA TGA CGT CAT CGT CCT GT-3' XOR-R2: 5'- CTC GGA GCT ATA TGC CGT GC-3' 1.6. Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, phun thuốc trừ bệnh, tăng cường chăm sóc bón phân đúng cách, thích hợp và điều chỉnh mực nước hợp lý và trồng giống kháng bệnh. Ngoài ra còn có biện pháp xử lý hạt giống trước khi gieo. Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn được coi là biện pháp có hiệu quả và khả thi nhất. 2. Vi khuẩn Xoo 2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm. Trên môi trường nhân tạo khuẩn lạc cầu vi khuẩn có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm. Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axít trong môi trường có đường. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 300C, nhiệt độ tối thiểu 0 - 50C, tối đa 400C nếu cao hơn 530C sẽ làm vi khuẩn chết. Vi khuẩn có thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 - 8,5 thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2. Hình 1. Ảnh hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Xoo trong mạch dẫn của lá lúa . Hình 2. Hình dạng tế bào vi khuẩn bệnh bạc lá lúa (Anna Maselli, 1999). 2.2. Nghiên cứu đặc điểm bộ genom Xoo Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo, trong đó gần đây nhất phải kể đến là công trình nghiên cứu về cấu trúc genom của hai chủng phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn Quốc), được công bố trên website: 2.2.1. Bộ genome Xoo chủng MAFF311018 Hinh 3. Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018. Hình phía trên trình bầy cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 biểu hiện bằng tám vòng tròn. Vòng ngoài cùng biểu hiện chiều dài của mỗi vùng gen bằng đơn vị 100 kb, vòng thứ 2 và 3 biểu hiện vị trí của các gen theo các hướng phiên mã khác nhau tương ứng. Những gen đã xác định rõ chức năng được ký hiệu màu vàng, gen chưa xác định rõ chức năng được ký hiệu màu xanh. Vòng tròn thứ tư biểu hiện vị trí tụ tập của các gen hrp và những gen gây độc avr ký hiệu màu xanh. Vòng tròn thứ năm biểu hiện vị trí của các trình tự gắn chèn. Vòng thứ sáu biểu thị hàm lượng C + G của mỗi trung bình 20 kb của mỗi đoạn. Vòng số bẩy biểu hiện vị trí của các gen mã hóa tạo ra tRNA và rRNA của vi khuẩn. Cuối cùng là vòng số tám biểu hiện vị trí của các prophage cùng các gen của phage. Theo đó genom của Xoo chủng MAFF 311018 gồm một nhiễm sắc thể vòng dài 4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7%. Bên trong không phát hiện thấy có chứa một thể plasmid nào. Trong đó phát hiện thấy có hai bản copy của operon rrn và thứ tự liền kề một số gen như sau: 16S-tRNAAla -tRNAIle -23S-5S. Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành các tRNAs đại diện cho 43 loại tRNA khác nhau. Trong tổng số 4.372 khung đọc mở được phát hiện (ORFs) trong genom chủng MAFF311018 thì có 2.799 (64%) gen đã xác định được chức năng, 1.383 (32%) proteins được xác định tương đồng với nhiều protein điển hình của vi khuẩn Xoo nhưng chưa biết rõ chức năng. Có 190 gen (4%) được xác định là không tương đồng rõ rệt với những gen đã được xác định và công bố trước đó của vi khuẩn. 2.2.2. Cấu trúc genom chủng KACC10331 Theo Lee và cộng sự, 2008 thì genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 có cấu trúc như sau: Tổng genom nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439 bp, với hàm lượng C + G chiếm 63.7%. Genom có 4637 khung đọc mở, trong đó có 3340 (72.0%) có thể xác định được chức năng. Khoảng 80% số gen trong đó được phát hiện thấy trong các loài vi khuẩn X. axonopodis pv. citri (Xac) và X.campestris pv. campestris (Xcc). Tuy nhiên, 245 gen được xác định là chỉ đặc thù đối với Xoo, trong đó có 8 gen gây độc. Đồng thời nhóm tác giả còn xác định được vị trí của cả những gen tạo phản ứng siêu mẫn (hrp), những gen sinh ra vỏ polysaccharide, gen mã hóa tạo enzyme phân rã màng tế bào thực vật. Điều này giúp chúng ta hiểu rõ được cơ chế tương tác giữa vi khuẩn Xoo gây bệnh đối với ký chủ họ hòa thảo. 2.2.3. Nghiên cứu trình tự chèn trên bộ genom Xoo Hiện đã xác định được tất cả có 611 trình tự chèn IS, chúng thuộc 25 kiểu chèn xen khác nhau trong bộ genom Xoo, chiếm sấp xỉ 10% tổng chiều dài của genom vi khuẩn. Tỷ lệ này là khá cao nếu so sánh với các loài vi khuẩn gây bệnh thực vật khác, đây có thể là một đặc điểm của vi khuẩn Xoo. Bảng 1. Liệt kê các yếu tố IS có mặt trong genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF 311018. IS của vi khuẩn Xoo phân bố khắp genom, chúng lặp lại liên tục trong nhiều locus. Có một số vùng chứa nhiều IS có thể dài tới 30 kb. Người ta đã xác định được đầy đủ trình tự của 386 IS và còn lại 225 IS đang được tiếp tục nghiên cứu. Theo số liệu trình tự, người ta chia chúng ra thành 7 nhóm khác nhau, trong đó nhóm IS5 và ISNCY phổ biến hơn cả, mỗi IS có lần lượt từ 110 đến 63 bản copy. Trong đó có 6 trình tự đặc thù là: ISXoo11, ISXoo12, ISXoo13, ISXoo14, ISXoo15 và ISXoo16.  2.2.3. Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related genes) - Nhóm gen hrp Trong số các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật thì những gen hrp mã hóa cho hệ thống tiết dịch loại III (TTSS) là đóng vai trò quan trọng nhất. Những gen này thường ổn định trong các vi sinh vật gây bệnh ở động vật và thực vật, chúng tiêm những protein hữu hiệu vào tế bào kí chủ. Nhóm gen hrp tìm thấy trong genom Xoo gồm 27 gen kí hiệu từ hpa2 đến hpaF và chúng có cấu trúc giống với cấu trúc của những gen này ở những vi khuẩn thuộc loài Xanthomonas, loại trừ trường hợp ở vùng hrpE2 của gen hpaB và vùng hrpF. Trong genom vi khuẩn Xoo, thấy có 3 gen đặc thù được phát hiện giữa gen hpaB và hrpF. Một gen định vị tại phần sau của gen hpaB (hrpE2) và có cùng hướng phiên mã với operon hrpE. Hai gen còn lại cũng nằm ở vùng sau của hpaB (hrpE2), nhưng hướng phiên mã theo chiều ngược lại. Theo sơ đồ này có 4 tương đồng chuyển vị liên tục nằm ở vùng giữa hpaB và hrpF là ISXo8, ISXo1, ISXo8 và ISXoo6. Hình 4. So sánh tổ chức di truyền nhóm gen hrp của 3 loài vi khuẩn Xoo, Xcc và Xac. A. Tổ chức di truyền của những gen bình thường. B. Những vùng biến động của nhóm gen hrp. Mỗi một gen có tên nằm trên hoặc dưới các mũi tên. Bản đồ được biểu diễn dựa trên số liệu trình tự các Nucleotit được xác định trong ngân hang gen (GenBankdatabase). Trình tự được xác định trên cơ sở sử dụng các gen của chủng X.axonpodis pv.citri 306 (kí hiệu AE008923) và gen của chủng X.campestris pv.campestris ATCC 33913 (kí hiệu AE008922). - Nhóm gen avr. Protein không gây độc là một trong những chất hiệu ứng loại III, chúng kích thích khả năng kháng bệnh trong cây tương ứng có những gen kháng bởi vậy chức năng của nó được xác định mang tính đặc thù theo giống lúa và chủng gây bệnh. Chủng MAFF 311018 biểu hiện mức độ đặc thù theo kí chủ giống lúa rất cao. Nó chứa một số các gen không gây độc. Vi khuẩn Xoo chứa rất nhiều bản copy các thành viên trong gia đình gen không gây độc avrBs3/pth, đây là một trong những nhóm gen không độc avr. Trong genom vi khuẩn Xoo, nhóm tác giả đã phát hiện có 17 bản copy phân bố và tụ tập tại 7 vùng genom khác nhau, được trình bày ở bảng dưới đây: Bảng 2. Bản liệt kê 17 bản copy các thành viên trong gia đình avrBs3/pth Mặc dù chúng có trình tự rất khá giống nhau nhưng chúng hoàn toàn phân biệt được với nhau bởi sự khác nhau chủ yếu ở số lượng các đoạn lặp lại nằm ở vùng trung tâm. Số lần lặp lại biến động từ 12,5 đến 31,5 và từ 2 đến 4 gen avr hầu hết nằm ở những vùng không gây độc, và những yếu tố di động như ISs và những gen có lien quan đến phage được định vị ở những vùng bên cạnh. Vị trí của những gen không gây độc này được trình bày ở hình dưới. Riêng vùng avr V, chúng bị ngắt quãng bởi một gen di động là ISXoo9 nằm ở đầu 3’. Hướng phiên mã của gen không độc avr ở vùng I, II và III là sợi anti-sense, nhưng đối với vùng IV, VI và VII thì là sợi sense theo hướng ngược lại. Hình 5. Bản đồ vị trí các gen không độc avr/pth của vi khuẩn Xoo. Vị trí tương đối của mỗi vùng và chiều dài của mỗi gen nh ư sau: v ùng I dài 1,228,783-1,246,335bp; II, 2,201,149-2,216,771 bp; III, 2,352,186-2,360,329 bp; IV, 2,383,115-2,392,653 bp; V, 2,999,333-3,001,924 bp; VI, 3,213,703-3,234,123 bp; và vùng VII dài 4,525,416-4,529,345 bp. - Gen điều hòa HrpX Trong vi khuẩn Xanthomonads, sự biểu hiện của một số gen cấu trúc TTSS và một số gen hiệu ứng được điều hòa bởi sản phẩm của các gen hrpG v à hrpX, các gen sản phẩm này đều có mặt ở cả 2 loại vi khuẩn Xac và Xcc. Một số gen hoạt động phụ thuộc vào gen HrpX đều cùng chứa một trình tự giống nhau là : TTCGC…N15…TTCGC, gọi là hộp PIP (PIP box). Hộp PIP này là một chỉ tiêu để phán đoán liệu gen nào đó có bị điều khiển bởi gen HrpX hay không, Đặc biệt đối với những gen mã hóa tạo ra các protein hiệu ứng. Trong vi khuẩn Xoo, người ta đã phát hiện có 37 bản copy hộp PIP hoàn chỉnh hoặc gần hoàn chỉnh có trình tự: TTCGN…N15…TTCGN, nằm ở vùng điều khiển của gen. Năm trong số đó nằm ở cụm tụ điểm của các gen hrp, số còn lại nằm rải rác ở vùng khác trong genom. Bảng 3. Danh sách các gen chịu sự điều hòa bởi gen HrpX trong genom Xoo Bottom of Form II. Đa dạng các chủng vi khuẩn Xoo 2.1. Tổng quan đa dạng sinh học Theo Công ước Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng si