Đề tài Nghiên cứu đa đạng di truyền của một số giống bưởi bằng kỹ thuật RAPD

MỞ ĐẦU Bưởi (Citrus grandis L.) là cây ăn quả có tác dụng bổ dưỡng và có nhiều giá trị về mặt y học. Bưởi được trồng rộng rãi ở Việt Nam, tuy nhiên, mỗi vùng có một số giống bưởi khác nhau do kết quả của quá trình chọn lọc cũng như ảnh hưởng của điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng. Trên đất nước ta từ lâu đã hình thành những vùng trồng bưởi và những giống bưởi nổi tiếng như bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi Đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi Phúc Trạch (Hương Khê, Hà Tĩnh), bưởi Thanh trà (Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai), bưởi Năm roi, bưởi Da xanh (Vĩnh Long)… [1]. Các giống bưởi này về mặt hình thái khác nhau không đáng kể, từ lá, hoa cho đến hình dạng trái. Sự khác nhau thể hiện ở màu sắc của cùi quả, cách sắp xếp múi, màu sắc và mùi vị của tép. Hiện nay, ở nước ta bưởi được trồng phổ biến và đem lại thu nhập cao cho bà con nông dân. Bưởi có rất nhiều giống do được trồng từ lâu và có nhiều giống du nhập từ miền Bắc và miền Nam. Để đánh giá mức độ di truyền thì việc dựa vào những chỉ thị hình thái là chưa đủ mà cần có những đánh giá sâu hơn về cấu trúc di truyền, cụ thể là hệ gen. Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rất rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau. Trong những năm gần đây, việc sử dụng các chỉ thị phân tử giúp phát hiện các biến dị trong các giống bưởi hay các cây có múi đã trở nên phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Các chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết kiệm thời gian do các đặc điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái. Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội. Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền đã được rất nhiều tác giả quan tâm và thực hiện trên nhiều đối tượng vi sinh vật, thực vật và động vật [63]. Để có thể phân biệt các giống bưởi dựa trên các đặc điểm di truyền, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đa đạng di truyền của một số giống bưởi bằng kỹ thuật RAPD” nhằm khảo sát sự sai khác của các band điện di thu được. Mục tiêu đề tài Sử dụng chỉ thị RAPD để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống bưởi thu thập được ở các vùng khác nhau. Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu lá của các giống bưởi và tách chiết, tinh sạch DNA tổng số. - Phân tích đa dạng di truyền của các giống bưởi nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD. - Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống bưởi nghiên cứu dựa trên giản đồ phả hệ DNA. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BƯỞI VÀ GIÁ TRỊ CỦA BƯỞI 1. Giới thiệu chung về bưởi Những ghi nhận lịch sử và phân tích di truyền có thể kết luận chỉ có 3 loài thực sự trong chi Citrus (thanh yên, quýt và bưởi) và nhiều dạng sinh học dưới loài. Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm mặc dù được thừa nhận rộng rãi nhưng chúng rất giống nhau về mặt di truyền, được tạo ra do chọn lọc, nhân giống bằng chiết ghép hay bằng hạt. Sự khác nhau giữa các dạng này có nguồn gốc từ các đột biến soma. Hơn nữa, nhiều thế hệ cây lai được tạo ra và được con người chọn lọc từ các dạng ăn được hay theo các tiêu chí công nghiệp tạo nên sự đa dạng trong chi Citrus như hiện nay [52]. Bưởi thuộc họ cam chanh (Rutaceae), dưới họ Aurantioidae, tộc Citreaea, dưới tộc Citrinae (Webber, 1967). Họ Rutaceae gồm 2 tộc và 33 chi. Mỗi tộc Clauseneae và Citreae được tạo thành từ 3 dưới tộc: Clauseneae bao gồm Micromelinae, Clauseninae và Merillinae; Citrinae gồm có Triphasiinae, Citrinae và Balsamocitrinae. Citrinae gồm 3 nhóm là Citrus nguyên thủy, gần giống Citrus và Citrus thật. Citrus thật gồm 6 chi: Clymenia, Eremocitrus, Microcitrus, Poncitrus, Fortunella và Citrus (Swingle and Reece, 1967). Hai hệ thống phân loại của chi Citrus được dùng phổ biến nhất là của Swingle và Tanaka. Swingle (1967) cho rằng chi Citrus có 16 loài, trong khi đó Tanaka (1977) lại cho rằng có đến 162 loài. Tuy nhiên, Scora (1975) cho rằng chỉ có 3 loài là thanh yên (C. medica), quýt (C. reticulata), và bưởi (C. grandis hoặc C. maxima) và Papeda là một nhóm của chi Citrus [62], [39]. Bưởi thuộc cây đại mộc, cao khoảng 10 m. Lá có phiến to, dày, gân phụ 5-6 cặp, cuống có cánh rộng và có đốt vào phiến. Hoa có chùm ngắn, trục có lông, cánh hoa trắng, dài 3,5 cm, tiểu nhụy nhiều, dính nhau. Trái to, gần như tròn, to 25-30 cm, quả bì dày, nạc quanh hột trong, ngà hay hường. Bộ nhiễm sắc thể 2n=18 [8]. Bưởi là một loài cây ăn quả thân gỗ, sống lâu năm, lá thường xanh quanh năm, thân cây cao, tán cây có dạng hình tròn tự nhiên, hình dẹt hoặc nón. Cành thường to hơn cam, quýt, cành lá phát triển mạnh. Các bộ phận lá, cành, quả khi còn non thường phủ một lớp lông tơ mỏng. Nhìn chung, cây có múi có bộ rễ ăn cạn, các rễ lông mọc yếu nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng thấp [4], [16]. Bưởi có thể sinh sản hữu tính bằng hạt hay nhân giống bằng giâm, chiết cành. Thông thường bưởi được nhân giống bằng hạt và thường ít được chú ý chăm sóc, chọn lọc nên có xu hướng ngày càng đa dạng so với các loài cây kinh tế khác trong chi Citrus. Bưởi được xem là cây trồng có khả năng thích nghi rộng với khí hậu mặc dù điều kiện sống tự nhiên của chúng là ở vùng nhiệt đới ẩm [55]. Bưởi được trồng trên khắp thế giới, ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, những nơi mà mùa đông có nhiệt độ ôn hòa, cây có thể sống sót và có đủ nước để sinh trưởng, phát triển (Gmitter và cs, 1992). Chất lượng quả bưởi tốt nhất là ở các vùng cận nhiệt đới. Các vùng trồng Citrus phổ biến nhất là châu Mỹ (Brazil, Mỹ, Argentina và Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, Bắc Phi), châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản) và Nam Phi. Theo FAO (2006), sản lượng bưởi và bưởi chùm trên thế giới là 4 triệu tấn, được trồng ở 74 quốc gia với diện tích là 264.000 ha. Mỹ là nước có sản lượng bưởi và bưởi chùm lớn nhất thế giới. Vùng Đông Nam Á, đặc biệt là Đông Ấn Độ, Bắc Burma và Tây Nam Trung Quốc được xem là trung tâm phát sinh và đa dạng của chi Citrus và những chi có quan hệ gần gũi với nó. Tổng sản lượng quả của chi Citrus trên toàn cầu trong thời gian 2004-2005 là 105,4 triệu tấn [36]. 2. Giá trị của bưởi Bưởi có nhiều giá trị về mặt y học đồng thời là thực phẩm ăn kiêng tốt cho nhiều loại bệnh. Bưởi có thể được sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều món ăn khác nhau như các loại mứt, bánh kẹo, gỏi và nước uống [22]. Theo Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ, các thành phần dinh dưỡng của bưởi được xác định ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của bưởi Thành phần Hàm lượng (100 g phần ăn được) Nước 89,10 g Năng lượng 38 kcal Protein 0,76 g Lipid tổng số 0,04 g Tro 0,48 g Carbohydrate 9,62 g Chất xơ 1,0 g Chất khoáng Calcium 4 mg Sắt 0,11 mg Magnesium 6 mg Phosphorus 17 mg Potassium 216 mg Sodium 1 mg Kẽm 0,08 mg Đồng 0,048 mg Mangan 0,017 mg Vitamin Vitamin C 61,0 mg Thiamin 0,034 mg Riboflavin 0,027 mg Niacin 0,220 mg Vitamin B-6 0,036 mg Vitamin A, IU 8 IU Cholesterol 0 mg Thành phần khác β-Carotene 0 µg α-Carotene 0 µg β-Cryptoxanthin 10 µg Nguồn: United States Department of Agriculture (USDA), 2004 Trong dung dịch nước ép múi bưởi có khoảng 9% citric acid, 14% đường. Ngoài ra còn có lycopin, các enzyme amylase, peroxidase, vitamin C (50 mg trong 100 g dịch ép), vitamin A và B [11]. Phần vỏ quả bưởi có thể được sử dụng để làm mứt hoặc dùng làm nguyên liệu của các hộp và thùng chứa. Hoa, quả và hạt bưởi có thể được ứng dụng trong các mục đích y tế. Hoa bưởi còn có thể được sử dụng để tách chiết các chất trong quá trình chế tạo nước hoa và pectin có thể được tách từ vỏ quả [55]. Bưởi được xem là nguồn vitamin C và các hợp chất giúp tăng cường sức khỏe như carotenoids, flavonoids, linonoids và chất xơ (Yu và cs, 2005). Các chất này có khả năng chống chất sinh ung thư và kháng đột biến, giúp con người chống lại bệnh tật. Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa của bưởi còn liên quan đến sự hiện diện của nhiều loại polyphenols và acid ascorbic [56]. Bưởi chứa nhiều loại flavonoid có cấu trúc khác nhau, bao gồm flavanone và flavone O- và C-glycosides, ngoài ra còn có methoxylated flavone. Mỗi nhóm hợp chất này đều biểu hiện hoạt tính cao trong chống viêm và trị ung thư. Có bằng chứng cho rằng các tác dụng sinh học của các flavonoid ở bưởi là có liên quan đến những tương tác của chúng với các enzyme điều hòa chủ chốt tác động đến kích hoạt tế bào và gắn kết thụ thể. Các flavonoid bưởi biểu hiện hoạt tính thấp trên các tế bào khỏe mạnh, bình thường, và vì thế biểu hiện đặc tính gây độc thấp rõ rệt ở các loài động vật. Những chất này mở rộng ảnh hưởng của chúng trong cơ thể thông qua sự cảm ứng của các enzyme gan I và II, và thông qua hoạt động sinh học của các chất chuyển hóa của chúng. Như vậy, có bằng chứng rõ ràng về những đặc tính tiềm năng của các hợp chất này trong việc tăng cường sức khỏe ở con người [50]. Carotenoid được xem như là tiền chất của vitamin A – chất rất quan trọng trong chế độ ăn của con người và động vật; ngoài ra nó còn đóng vai trò là chất chống oxy hóa, giúp giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư (Olson, 1989). Bưởi là nguồn phức hệ carotenoid với số lượng carotenoid lớn nhất được tìm thấy trong bất kỳ loại trái cây nào. Nồng độ và thành phần carotenoid thay đổi rất lớn giữa các loài bưởi và phụ thuộc vào điều kiện phát triển (Gross, 1987) [46]. Ngày nay, khoa học còn khám phá thêm những đặc tính trị liệu mới của bưởi. Trong bưởi chứa nhiều pectin, là chất sợi hòa tan chứa polysaccharide giúp hấp thu cholesterol của thức ăn và muối mật nên làm giảm cholesterol trong máu [11]. II. ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CHI CITRUS Trong xu hướng hiện nay, để chọn giống cây trồng hay xác định nguồn gốc của các loài cây trồng người ta thường sử dụng các chỉ thị phân tử (marker). Việc sử dụng các chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết kiệm thời gian do các đặc điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái, không chịu tác động của môi trường và chủ động trong nghiên cứu. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử là một công cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng di truyền của rất nhiều loài. Gần đây, các phân tích phân tử như phân tích trình tự các đoạn nucleotide lặp lại đơn giản (SSR-Simple sequence repeat), hay microsatellite các đoạn giữa hai SSR (ISSR-Inter-simple sequence repeat), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP-Restriction fragment length polymorphism), đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD-Random amplified polymorphic DNA), đa hình các đoạn khuếch đại với các primer đặc hiệu (SCAR-Sequence characterized amplified region), phản ứng RAPD cho gen ctv (CAPS)… đã được sử dụng để kiểm tra mối quan hệ họ hàng trong số các nhóm phân loại chi Citrus [52]. So sánh với phương pháp truyền thống thì phân loại và nghiên cứu đa hình bằng các chỉ thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao [3]. Trong số các chỉ thị trên thì RAPD được sử dụng phổ biến nhất để phân biệt giữa các loài khác nhau hay để xác định bản đồ gen ở các loài thực vật. Kỹ thuật này đã được sử dụng thành công trong việc xác định sự đa hình ở cà chua, cây mâm xôi, táo và cây mơ (Bogani và cs, 1994; Davis và cs, 1995; Dubouzet và cs, 1997; Mariniello và cs, 2002; Tartarini, 1996; Warburton và cs, 1996) [51]. 1. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong phân tích đa dạng di truyền Kỹ thuật RAPD dựa trên nguyên tắc của PCR, sử dụng các primer ngắn không đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA trong genome một cách ngẫu nhiên [9]. Sự đa hình RAPD tạo thành từ sự thay đổi của 1 nucleotide, ví dụ như chèn đoạn hay mất đoạn dẫn đến thay đổi vị trí kết hợp primer (Williams và cs, 1993). Những sản phẩm của sự khuếch đại có thể là đa hình và được sử dụng như là các chỉ thị di truyền (Tingey and del Tufo, 1993) [65]. RAPD là một kỹ thuật dễ thực hiện và có giá thành rẻ, với những ưu điểm nổi bật là chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn mẫu, không tạo thành phóng xạ và cho kết quả phân tích nhanh mà không đòi hỏi các thông tin về tình tự DNA của một loài (Williams et al., 1990; Martin et al., 1997). Mặc dù trong một số trường hợp, kỹ thuật RAPD có khả năng lặp lại thấp nhưng vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách tối ưu hóa các điều kiện phản ứng (Weising et al., 1995). Nhìn chung, RAPD có thể cung cấp các dữ liệu có giá trị về sự đa dạng di truyền bên trong hoặc giữa các quần thể của một loài (Lynch and Milligan, 1994; Collignon et al., 2002) [47]. Trong kỹ thuật RAPD thì các primer ngẫu nhiên chứa 10 nucleotide là cho kết quả khuếch đại tốt nhất (Coletta Filho và cs, 1998; Elisiario và cs, 1999). Trong chi Citrus, RAPD đã được sử dụng để xác định các đột biến ở loài chanh (Deng và cs, 1995), xây dựng bản đồ gen (Cai và cs, 1994), xác định các chỉ thị liên quan với các đặc điểm nông học (Cheng và Roose, 1995; Gmitter và cs, 1996) và cho các nghiên cứu về phân loại học (Luro và cs, 1992) [33]. Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đã được Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái và phân tử. Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao, Kiên Giang chia làm 5 nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh và hạnh. Sử dụng 4 primer là OPA02, OPA04, OPA11 và OPA13 (Operon Technologies, CA) trong phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD cho kết quả 49 chỉ thị phân tử được ghi nhận. Giản đồ phả hệ cho thấy cây có múi của Gò Quao, Kiên Giang chia thành 4 nhóm: bưởi, cam-quýt, chanh và hạnh. Kết quả phân tích cho thấy khoảng cách di truyền giữa các nhóm biến động từ 0-43%. Trong 49 chỉ thị có 11 chỉ thị xuất hiện ở 100% số cá thể, 26 chỉ thị trên 90%, 4 chỉ thị trên 80%, 2 chỉ thị trên 70%, 6 chỉ thị dưới 70% và có 1 chỉ thị là 45% [7]. Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng để phân biệt các cây con có nguồn gốc từ phôi tâm và hợp tử tạo thành từ phép lai giữa các giống quýt Montenegrina (Citrus deliciosa Tenore) và King (C. nobilis Loureiro). Phôi được tách ra từ những hạt giống, nhân giống in vitro và thích nghi trong điều kiện nhà kính. Bốn primer ngẫu nhiên đã được sử dụng để nhận biết 54 cây có cùng nguồn gốc hữu tính từ tổng số 202 cá thể. Mức độ đa hình của mỗi primer được phản ánh qua số lượng của các cây có nguồn gốc hợp tử thu được trên mỗi primer. Thuật toán phân tích nhóm của cây bố mẹ và con cái đã sắp xếp các cá thể vào các nhóm riêng biệt với khoảng cách di truyền lớn nhất là 20% [23]. Abkenar và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RAPD khi nghiên cứu các đặc điểm phân tử và khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật. Đối tượng nghiên cứu gồm 31 loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài ‘Yuzu’ và 21 loài họ hàng. Trong số 60 primer sử dụng có 27 primer được lựa chọn với 108 chỉ thị tạo thành, 76 chỉ thị trong số đó là đa hình, trung bình là 2,8 chỉ thị trên mỗi primer. Số lượng của các chỉ thị đa hình trên mỗi primer nằm trong khoảng từ 1 đến 8 và kích thước của các chỉ thị là từ 400 bp (OPA18) đến 3.200 bp (OPA01). Trong nghiên cứu này, một số chỉ thị RAPD có thể giúp phân biệt giữa các loài cây trồng rất gần gũi: OPA17 (1.100) và OPE20 (675) chỉ có ở ‘Kabosu’ mà không có ở ‘Aka kabosu’; tương tự OPA20 (1.400), OPB05 (990) và OPE16 (1.000) chỉ có ở ‘Aka kabosu’ mà không có ở ‘Kabosu’. Cây phát sinh loài được tạo thành dựa trên khoảng cách di truyền cho thấy các loài cam chua rất khác với các loài ‘Yuzu’ và họ hàng của chúng. Các loài ‘Yuzu’ có mối quan hệ gần gũi với nhau, tuy nhiên sự đa hình di truyền của các loài nghiên cứu khác có thể được xác định dễ dàng bằng kỹ thuật RAPD và sự đa dạng di truyền giữa các loài là khá cao, biểu lộ các nguồn gốc khác nhau của chúng [18]. Trong nghiên cứu nhằm xác định 10 giống chanh ở vùng Campania, miền Nam nước Ý, Mariniello và cs (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 44 primer ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide. Tất cả các primer đều được sử dụng trong phản ứng RAPD với DNA khuôn mẫu của các giống chanh nghiên cứu nhằm xác định sự đa hình. Mọi primer đều tạo ra các sản phẩm khuếch đại trong đó có 5 primer tạo ra các band có thể dùng để xác định các giống cây trồng. Sản phẩm khuếch đại của giống Sorrento khi thực hiện phản ứng với primer OPL02 cho thấy sự hiện diện 2 band (1.000-1.200bp) mà không có ở các giống khác. Giống chanh này còn tạo ra chỉ một sản phẩm khuếch đại duy nhất khi được khuếch đại với primer OPL16. Ngoài ra, primer OPL14 còn rất hữu ích trong xác định giống Amalfi với hình ảnh điện di biểu thị sự vắng mặt của các band có khối lượng phân tử cao và thấp. Giống Procida được nhận dạng bởi primer OPL19 với các band khuếch đại đặc biệt có khối lượng phân tử thấp. Cuối cùng, với việc sử dụng primer OPL31, giống Gloria d’Amalfi cho kết quả điện di không có các band khối lượng phân tử cao. Kết quả còn cho thấy mức độ tương đồng giữa các giống chanh nghiên cứu là khá cao, lớn hơn 80%, và có thể xếp chúng vào 4 nhóm. Nhóm thứ nhất bao gồm giống Napoli và S. Agnello; nhóm thứ hai gồm Gloria d’Amalfi, Sorrento, Procida, Sfusato d’Amalfi, Variegato, and Cannellino; nhóm thứ ba và nhóm thứ tư chỉ chứa 1 giống là Massa Lubrense và Amalfi [51]. Bastianel và cs (2001) đã sử dụng các chỉ thị RAPD để phân tích sự tương đồng về mặt di truyền của 15 giống thuộc chi Citrus (Citrus spp.) ở Brazil, bao gồm 4 giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck), 4 giống quýt (C. reticulata Blanco, C. nobilis Loureiro, C. sunki Loureiro và C. deliciosa Tenore), cam chua (C. aurantium L.), bưởi chùm (C. paradisi Marcf.), bưởi (C. grandis Osbeck), thanh yên (C. medica L.), chanh cốm (C. latifolia) và 2 dạng lai [C. clementina T. × (C. tangerina T. × C. paradisi Macf.)]. Sự tương đồng di truyền của 15 giống này được quan sát từ 12 primer ngẫu nhiên, độ tương đồng di truyền giữa các giống quýt thấp nhất là 81%. Độ tương đồng thấp hơn thấy ở các loài ít quan hệ là C. medica, C. grandis và C. latifolia. Bốn giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck) không có sự khác nhau dựa vào chỉ thị RAPD, chúng có độ tương đồng cao nhất [22]. Năm dòng khác nhau của loài cam chua (Citrus aurantium L.) biểu hiện những khác biệt có ý nghĩa về hình thái học đã được xác định bằng các chỉ thị phân tử phát triển từ kỹ thuật PCR là ISSR và RAPD. De Pasquale và cs (2006) đã phân tích các mẫu nghiên cứu với 11 primer ISSR và 6 primer RAPD (OPH04, OPAT14, OPH15, OPM04, OPO14 và OPN14). Dòng AACNR32 biểu hiện một kiểu band đặc trưng với tất cả các primer sử dụng, trong mỗi trường hợp đều có từ 1 đến 3 band đa hình mà có thể phân biệt được nó với các dòng khác. Các dòng còn lại có các kiểu band khuếch đại rất giống nhau, ngoại trừ các sản phẩm khuếch đại thu được bởi primer ISSR (CA)8RG, (AC)8YG và primer RAPD OPH04. Với primer ISSR (CA)8RG, dòng AACNR32 được phân biệt với các dòng khác bởi một đoạn khuếch đại đơn hình 1.800 bp và không có đoạn khuếch đại 800 bp mà hiện diện ở tất cả các dòng còn lại. Dòng AACNR9A được xác định bởi sự vắng mặt của đoạn khuếch đại 500 bp. Ngoài ra, dòng AACNR26A không thể phân biệt được với các dòng còn lại khi sử dụng các primer trên [33]. Machado và cs (1996) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự đa hình và sự tương đồng di truyền giữa 39 loài quýt Địa Trung Hải. Kết quả đã xác định được 111 sản phẩm khuếch đại từ 21 primer ngẫu nhiên. Trung bình mỗi primer có 2,2 chỉ thị RAPD, tương ứng với 42% của các sản phẩm khuếch đại. Các chỉ thị RAPD đặc hiệu kiểu gen đã được xác định, phần lớn là của các cây lai. Thuật toán phân tích nhóm UPGMA thể hiện sự khác biệt di truyền thấp giữa các loài quýt Địa Trung H