Độc tốverotoxin VT2eB do E. colitiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và
tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Vì
vậy, các nghiên cứu giúp phòng bệnh, phát hiện, giám sát các tác nhân gây bệnh là vấn
đề đang nhận được sựquan tâm hàng đầu.
Việc sửdụng kháng sinh để điều trịbệnh tiêu chảy và phù đầu ởheo con tuy có
hiệu quảnhưng gây nhiều triệu chứng phụ, nhưrối loạn tiêu hoá, không có chức năng
phòng bệnh và tạo ra những chủng vi sinh vật kháng kháng sinh (gây khó khăn cho
việc trịbệnh lâu dài). Đểkhắc phục những khó khăn trên, phương pháp dùng vaccin để
phòng ngừa bệnh cho heo hứa hẹn mang lại hiệu quảhơn. Tuy nhiên, hầu hết các loại
vaccin hiện nay được sản xuất theo phương pháp cổ điển bằng cách sửdụng vi khuẩn
chết hay vi khuẩn nhược độc nên tính đặc hiệu không cao và gây một sốphản ứng phụ
có hại. Phương pháp này gặp một sốbất lợi nhưhiện tượng phục hồi một sốtính độc
ban đầu hay sựphân huỷkhông hoàn toàn các độc tố, dễdẫn đến các hiệu ứng không
mong muốn ởcác con thú được tiêm chủng. Hơn nữa, việc sửdụng vi khuẩn chết lại
đòi hỏi phải tiêm lập lại nhiều lần, vì tính gây đáp ứng miễn dịch không cao.
Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra
được chủng E. colimang gen mã hoá cho protein tái tổhợp MBP-VT2eB và tinh sạch
được protein này. Từthực tế đó, được sựchấp nhận của bộmôn Công NghệSinh Học,
với sựhướng dẫn của TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, PGS-TS khoa học Nguyễn Lê
Trang, chúng tôi thực hiện đềtài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein
tái tổhợp MBP-VT2eB trên thỏ”.
80 trang |
Chia sẻ: oanhnt | Lượt xem: 1420 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI
PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện : PHAN LÊ MAI
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI
PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ
Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện:
TSKH NGUYỂN NGỌC HẢI PHAN LÊ MAI
PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005
iii
LỜI CẢM ƠN
Con luôn nhớ ơn ba mẹ sinh thành, dưỡng dục và tạo mọi điều kiện cho con tự
hoàn thiện mình, cảm ơn sự quan tâm, động vịên của mọi người trong gia đình.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ
Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã
truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người
Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá
luận.
Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang,
người Thầy, người bác đã dạy bảo con rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp
con hoàn thành khoá luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Nguyễn Kim Dung, người Thầy
đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Đỗ Thị Châm, chị
Lạc Ngọc Thêm, chị Võ Thị Mỹ Duyên, chị Dương Ngọc Diễm, chị Doãn Thị Sim,
Thầy Lưu Đức Lợi, anh Nguyễn Văn Thương đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo em trong
suốt thời gian thực tập khoá luận tốt nghiệp.
Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH01SH đã san sẻ cùng tôi những vui
buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
iv
TÓM TẮT
PHAN LÊ MAI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-
VT2eB TRÊN THỎ”.
Hội đồng hướng dẫn:
TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải
PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang
Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu
và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta.
Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận
được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta.
Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được
chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được
protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn
dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng
dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E. coli gây ra trên heo .
Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố
VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố
verotoxin.
Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu:
- Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể
kháng MBP-VT2eB có hiệu quả.
- Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ
tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero.
- Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà
độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo).
v
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii
TÓM TẮT ....................................................................................................................iv
MỤC LỤC .....................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................xi
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ xii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...................................................................................... xiii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ..................................................................................xiv
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Mở đầu ..............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu .........................................................................................1
1.2.1. Mục tiêu.....................................................................................................1
1.2.2. Yêu cầu......................................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3
2.1. Kháng nguyên...................................................................................................3
2.2. Kháng thể..........................................................................................................3
2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) ............................................................................................4
2.2.2. Chuỗi nặng (H) ..........................................................................................4
2.3. Đáp ứng miễn dịch ...........................................................................................5
2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu ............................6
2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo....6
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch ..........................................7
2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể .............................................................................10
2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ....................................................................15
2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two
dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony)...................................................................15
2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể ............................................15
2.6.2. Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double
diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) ......................................17
vi
2.7. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero .................18
2.7.1. Sơ lược về tế bào vero .............................................................................18
2.7.2. Độc tố VT2e ............................................................................................19
2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố
trên môi trường tế bào vero ....................................................................20
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...............................21
3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................21
3.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................21
3.3. Vật liệu và hoá chất........................................................................................21
3.3.1. Thú thí nghiệm .......................................................................................21
3.3.2. Vật liệu và hoá chất ................................................................................21
3.3.3. Môi trường ..............................................................................................22
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................22
3.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22
3.4.1. Bố trí thí nghiệm .....................................................................................22
3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm .................................................................................24
3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh ..................................................................24
3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh ........................................................................24
3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S ........ 24
3.4.4.2. Hòa tan kháng thể ...................................................................25
3.5. Đánh giá .........................................................................................................27
3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) .....................................................................................................27
3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường
tế bào vero ........................................................................................................ 28
3.5.2.1. Xác định liều TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) .....28
3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố ................................................ 31
vii
3.6. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 33
3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu .................................................................33
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................34
4.1. Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ
thuật Ouchterlony.................................................................................................. 34
4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng ..................................................34
4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình
ngắn ngày và dài ngày ......................................................................................35
4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày ......................................................................35
4.1.2.2. Quy trình dài ngày .........................................................................36
4.1.3. Nhận xét...................................................................................................38
4.2. Xác định liều TCID50 ....................................................................................41
4.3. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ................42
4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero ..............42
4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và tế bào vero .......................43
4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và có bất hoạt .......................43
4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN3 .............................................................. 44
4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt .................44
4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ..................46
4.3.2.1. Quy trình dài ngày ...........................................................................47
4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày ........................................................................50
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................53
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................54
PHỤ LỤC ................................................................................................................56
viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ag
ATCC
DAG
DMEM
TCID50
EDTA
FBS
Gb4
Ig
IL2
IL4
IL5
IL6
IP3
LB
MAF
MBP
MHC class II antigens
MIF
MWCBs
PCR
Antigen
American Type Culture
Collection
Diacylglycerol
Dulbeccos Minimal
Essential Medium
Tissue culture infectious
dose 50
Ethyllene diamine tetra
acetic acid
Fetal Bovine Serum
Globotetraosyl ceramide
Immunoglobulin
Interleukin 2
Interleukin 4
Interleukin 5
Interleukin 6
Inositol triphosphate
Lubria – Bertani
Macrophage activating
factor
Maltose binding protein
Major histocompatibility
complex class II antigens
Macrophage inhibitation
factor
Manufacturer's working
cells bank
Polymerase chain reaction
Kháng nguyên
Tổ chức sưu tầm nhân
giống Mỹ
Huyết thanh bào thai bê
Globulin miễn dịch
Yếu tố có tác dụng hoạt
hoá đại thực bào
Các kháng nguyên phù hợp
tổ chức chính lớp II
Ngân hàng tế bào đang làm
việc
ix
PBS
SLT
TC
TDTH
TI
TH
Vero
VT
VT2e (SLT-IIv)
VT2eB
Phosphate buffer stalin
Shiga-like toxin
Cytotoxic T cell
Delayed type
hypersensitivity T cell
Inducer T cell
Helper T cell
Vervet Monkey Origin
Verotoxin
SLT-II variant
VT2e subunit B
Tế bào lympho T gây độc
Tế bào lympho T gây quá
mẫn muộn
Tế bào lympho T cảm ứng
Tế bào lympho T giúp
Độc tố Shiga-like toxin IIv
Tiểu đơn vị B của VT2e
x
DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1:
Hình 2.2:
Hình 2.3:
Hình 2.4:
Hình 2.5:
Hình 2.6:
Hình 2.7:
Hình 2.8:
Hình 3.1:
Hình 3.2:
Hình 4.1:
Hình 4.2:
Hình 4.3:
Hình 4.4:
Hình 4.5:
Hình 4.6:
Cấu trúc kháng thể ................................................................................5
Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được
phản ảnh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh ...................7
Quá trình biệt hoá và phân chia của tế bào lympho B ........................11
Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề
mặt tế bào lympho B............................................................................12
Sự kết hợp giữa tế bào lympho TH và tế bào lympho B......................13
Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho
TH ........................................................................................................13
Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình
đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên .........14
Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B),
đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch
tán kép trên thạch ................................................................................18
Bao thẩm tích ......................................................................................26
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) ..27
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc
lại 1) ....................................................................................................34
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc
lại 1) ....................................................................................................35
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc
lại 2) ....................................................................................................36
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................36
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................36
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc
xi
Hình 4.7:
Hình 4.8:
Hình 4.9:
Hình 4.10:
Hình 4.11:
Hình 4.12:
PHỤ LỤC
Hình 1:
Hình 2:
Hình 3:
Hình 4:
Hình 5:
Hình 6:
lại 1) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (mũi nhắc
lại 1) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc
lại 2) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................38
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây miễn
dịch ......................................................................................................40
Tế bào vero .........................................................................................60
Tế bào vero chịu tác động của độc tố VT2e .......................................60
Thú thí nghiệm ....................................................................................61
Tiêm protein MBP-VT2eB cho thỏ ....................................................61
Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ ..................................................................62
Tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S ....................................62
xii
DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 4.1:
Bảng 4.2:
Bảng 4.3:
Bảng 4.4:
Bảng 4.5:
Bảng 4.6:
Bảng 4.7:
Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây
miễn dịch ................................................................................................39
Kết quả đo OD620 mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e ................41
Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) .........45
Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại
4) .............................................................................................................47
Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) ..................................48
Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 2 ............................................................50
Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch .....52
xiii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
TRANG
Sơ đồ 3.1:
Sơ đồ 3.2:
Sơ đồ 3.3:
Sơ đồ 3.4:
Quy trình tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S ........................25
Quy trình xác định liều TCID50 ..............................................................29
Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quả ở bước sóng 620 nm ........30
Quy trình trung hòa độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero............... 32
xiv
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1:
Biểu đồ 4.2:
Biểu đồ 4.3:
Biểu đồ 4.4:
Biểu đồ 4.5:
Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e ............................................................42
Đồ thị trung hòa độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi
nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero .............................................46
Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi
nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero .............................................49
Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) trên môi
trường tế bào vero .............................................................................49
Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 2 trên môi trường tế bào vero .51
1